Guide d’interprétation du VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre (EC) VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Primary Antibody VENTANA anti-MSH2 (G219-1129) Mouse Monoclonal Primary Antibody VENTANA anti-MSH6 (SP93) Rabbit Monoclonal Primary Antibody SOMMAIRE Introduction1 Utilisation prévue 3 Utilisation prévue du produit 3 Objectif du guide d’interprétation 3 Évaluation clinique 4 Caractéristiques de coloration 4 Critères d’acceptabilité de la morphologie et de la coloration de fond 5 Critères de cas pour l’évaluation clinique 5 Algorithme de notation 6 Contrôles8 Contrôles positifs internes 8 Procédure de traitement des échantillons 10 Images de référence 12 Cas efficaces 12 Cas insuffisants 14 Cas difficiles 18 Impact des conditions préanalytiques sur le VENTANA MMR RxDx Panel 28 Conditions de fixation acceptables pour des résultats de coloration optimaux 28 Stabilité des lames 32 Épaisseur des tissus 32 Références33 Introduction La réparation des mésappariements (mismatch repair, MMR) Les protéines MMR (MLH1, PMS2, MSH2 et MSH6) sont de l’ADN est un mécanisme moléculaire dont la fonction est de exprimées de façon ubiquitaire dans les cellules normales et corriger les substitutions de bases inappropriées qui se produisent malignes proliférantes.⁹ Beaucoup de cancers courants présentent spontanément pendant la réplication de l’ADN.1 Des méthodes une déficience du MMR (dMMR) et une MSI.1⁰ De nombreuses basées sur l’amplification en chaîne par polymérase (PCR) ont études ont démontré que la déficience du MMR est corrélée à une montré que les défaillances du MMR entraînent fréquemment expression plus élevée des protéines PD-1 ou PD-L1.11-13 Ainsi, une instabilité microsatellitaire (microsatellite instability, MSI), les protéines MMR peuvent s’avérer utiles comme biomarqueurs condition dans laquelle de courtes séquences de nucléotides prédictifs en vue d’une thérapie ciblant PD-1. En particulier, une répétées en tandem sont insérées dans l’ADN.2-⁴ Lorsque le perte d’expression d’une ou plusieurs protéines MMR peut être nombre de répétitions est supérieur ou égal à 30 % des loci prédictive d’une plus grande probabilité de réponse à une telle des microsatellites examinés, la MSI est nommée MSI-H (MSI- thérapie.13-15 Les inhibiteurs de PD-1 peuvent s’avérer utiles dans High). Les déficiences du système MMR ont été attribuées à des certains cancers présentant une haute fréquence de déficience mutations dans les protéines MMR, généralement MLH1, PMS2, du MMR et/ou une MSI-H, indépendamment du tissu d’origine MSH2, et MSH6. des cancers.14,15 Par conséquent, les patients qui envisagent une thérapie ciblant PD-1 bénéficieront d’un test diagnostique Les protéines MLH1 et PMS2 agissent normalement ensemble compagnon permettant d’identifier la population de patients sous forme d’un complexe hétérodimérique, et il en va de même présentant une déficience du MMR. pour les protéines MSH2 et MSH6. Lorsque le MMR fonctionne normalement, l’hétérodimère MSH6/MSH2 se lie à l’ADN Le carcinome de l’endomètre (endometrial carcinoma, EC) mésapparié. Cette liaison induit un changement de conformation représente l’une des lésions malignes gynécologiques les plus qui permet à l’hétérodimère MLH1/PMS2 de se fixer sur l’ADN courantes.12 Il est fréquemment observé qu’il comporte de lié au complexe MSH6/MSH2, entraînant une réparation par nombreuses altérations génétiques, dont une MSI. 12 Il a été excision de l’ADN affecté.⁴,⁵ Les mutations ou les déficiences suggéré que le carcinome de l’endomètre MSI peut présenter une dans ces protéines sont la cause de fréquentes mutations MSI augmentation de l’expression de la protéine PD-L1 par rapport et somatiques dues à une erreur de réplication. Les tests du au carcinome de l’endomètre sans instabilité microsatellitaire MMR par immunohistochimie (IHC) peuvent s’avérer utiles dans (microsatellite stable, MSS).16 Tandis que le traitement de l’EC varie l’identification des gènes MMR susceptibles de contenir des en fonction du grade, de l’histologie et du stade de la maladie,17 altérations germinales ou somatiques.⁶ l’évaluation du statut MMR des tumeurs EC est utile pour le pronostic et l’orientation du traitement.12 De ce fait, les patients Historiquement, les régimes de traitement des patients cancéreux qui envisagent une thérapie ciblant PD-1 bénéficieront d’un test étaient dictés par la malignité spécifique. Toutefois, de nouvelles diagnostique compagnon permettant d’identifier la population de immunothérapies, notamment celles qui modifient les voies patients présentant une déficience du MMR. cellulaires impliquant les protéines PD-1 (programmed death 1) ou PD-L1 (programmed death ligand 1), redéfinissent les stratégies Une perte d’expression de l’une des protéines MMR essentielles, thérapeutiques des cliniciens. PD-1 est un récepteur inhibiteur dont MLH1, PMS2, MSH2 ou MSH6, entraîne la déficience du exprimé sur les lymphocytes T après leur activation, qui se MMR. La présence de coloration pour l’ensemble de ces quatre prolonge durablement dans les états de stimulation chronique protéines MMR marqueurs dans la tumeur indique que le cas tels que l’infection chronique ou le cancer.⁷ L’expression de est efficace quant au statut VENTANA MMR IHC. L’absence de PD-L1 a été observée dans les cellules immunitaires et les cellules coloration pour l’une des protéines MMR marqueurs du VENTANA malignes, et il a été rapporté que l’expression aberrante de PD-L1 MMR RxDx Panel indique que le cas est insuffisant quant au statut sur les cellules tumorales (tumor cells, TC) entrave l’immunité VENTANA MMR IHC. antitumorale, entraînant l’évasion immunitaire.⁷,⁸ L’interruption de la voie PD-L1/PD-1 représente donc une stratégie intéressante pour réactiver l’immunité des lymphocytes T spécifique à la tumeur. VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 1 2 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Utilisation prévue Utilisation prévue du produit Consulter la notice du VENTANA MMR RxDx Panel pour une description détaillée de l’utilisation prévue de ce produit, y compris des indications associées. Objectif du guide d’interprétation Le présent guide est destiné aux fins suivantes : • Fournir aux anatomopathologistes un outil facilitant l’évaluation clinique de coupes de tumeurs fixées au formol et incluses en paraffine (FFPE) colorées à l’aide du VENTANA MMR RxDx Panel conformément à l’étiquetage proposé du produit. • Fournir des clichés photographiques qui illustrent les profils de coloration pouvant résulter de la coloration des tissus tumoraux avec le VENTANA MMR RxDx Panel. • Fournir des exemples d’images illustrant les cas difficiles afin de faciliter leur évaluation. • Offrir des conseils pour l’utilisation d’éléments tissulaires normaux positifs pour les protéines MMR, qui servent de contrôle interne positif lorsqu’ils sont colorés à l’aide du VENTANA MMR RxDx Panel. VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 3 Évaluation clinique Caractéristiques de coloration Les cellules marquées avec chaque test dans le VENTANA MMR Le signal peut se distribuer de façon homogène, avec un niveau RxDx Panel sont évaluées quant à la présence ou à l’absence du d’intensité uniforme dans les régions néoplasiques de la tumeur, signal de la diaminobenzidine (DAB). La coloration du VENTANA ou de façon hétérogène, avec plus d’un niveau d’intensité. Il doit MMR RxDx Panel dans les protéines MMR s’effectue suivant un être facilement détectable avec les faibles grossissements tels profil nucléaire. La perte de l’une des protéines MMR détectées que 2x ou 4x. Une représentation graphique du ou des type(s) par le VENTANA MMR RxDx Panel est observée dans les noyaux de cellules néoplasiques/éléments de coloration marqués par le des cellules tumorales. Le statut MMR est classé comme « Intact » VENTANA MMR RxDx Panel est fournie dans la section Images ou « Perte » en fonction uniquement d’une coloration nucléaire de référence de ce guide d’interprétation. Un réactif de contrôle sans équivoque. négatif (negative reagent control, NRC) correspondant à l’espèce • Statut Intact : Il se caractérise par des cellules tumorales est utilisé pour évaluer la présence d'une coloration de fond dans présentant une coloration sans équivoque d’une intensité les échantillons testés et pour établir une intensité de coloration supérieure ou égale aux contrôles internes au-dessus de la de référence. Les critères d’acceptabilité de la morphologie et de coloration de fond. la coloration fond sont indiqués dans le tableau 1. Les critères de • Statut Perte : Il se caractérise par l’absence de tout signal détectable. Les cas avec un statut Perte peuvent tout de même présenter une pâle décoloration nucléaire grise. Coloration nucléaire sans équivoque dans les cellules tumorales MSH6 10x cas pour l’évaluation du statut MMR du tissu néoplasique avec n’importe lequel des quatre tests du VENTANA MMR RxDx Panel sont indiqués dans le tableau 2. Absence de coloration nucléaire dans les cellules tumorales MSH6 10x Forte coloration nucléaire dans les lymphocytes Statut Perte de coloration et Intact du MMR : Dans ces cas de carcinome de l’endomètre, les noyaux présentent une coloration sans équivoque, correspondant au profil de coloration prédominant observé dans la majorité des tissus tumoraux dans le statut Intact pour MSH6 (image de gauche). L’absence de coloration nucléaire dans les tissus tumoraux représente le statut Perte pour MSH6 (image de droite). Une coloration nucléaire sans équivoque dans les cellules de contrôle interne (c.-à-d. les lymphocytes) à proximité des tumeurs viables constitue un contrôle positif interne acceptable. 4 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Critères d’acceptabilité de la morphologie et de la coloration de fond Pour chaque cas coloré à l’aide du VENTANA MMR RxDx Panel, l’acceptabilité de la morphologie du tissu et de la coloration de fond doit être évaluée en fonction des critères décrits dans le tableau 1. Tableau 1 : Critères d’acceptabilité de la morphologie et de la coloration de fond Critères Acceptable Inacceptable Morphologie Les éléments cellulaires d’intérêt sont Les éléments cellulaires d’intérêt ne sont pas visualisés, permettant l’interprétation clinique visualisés, compromettant l’interprétation clinique de de la coloration spécifique la coloration spécifique La coloration de fond n’interfère pas avec La coloration de fond interfère avec la capacité à l’interprétation clinique de la coloration interpréter la coloration spécifique Coloration de fond spécifique Critères de cas pour l’évaluation clinique Dans le tableau 2 sont résumés les critères pour une lame de tissu néoplasique à évaluer quant au statut MMR avec n’importe lequel des tests du VENTANA MMR RxDx Panel. Tableau 2 : Critères rendant une lame évaluable ou non évaluable Interprétation clinique Évaluable (doit remplir tous les critères) Critères de profil de coloration 1. H&E a ≥ 50 cellules tumorales viables 2. La lame du réactif du Negative Reagent Control est acceptable 3. La morphologie est acceptable 4. La coloration de fond est acceptable 5. Les contrôles positifs internes présentent une coloration nucléaire sans équivoque Non évaluable (si l’un des critères de cette section est rempli, la coloration de la lame doit être répétée ou le cas rejeté, s’il y a lieu) 1. H&E a < 50 cellules tumorales viables 2. La lame du réactif du Negative Reagent Control est inacceptable 3. La morphologie est inacceptable 4. La coloration de fond est inacceptable 5. Les contrôles positifs internes ne présentent pas de coloration nucléaire sans équivoque 6. L’interprétation n’est pas possible en raison d’une perte de tissu, de l’absence de tumeur, d’artéfacts et/ou d’artéfacts de bord VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 5 Algorithme de notation Évaluation du VENTANA MMR RxDx Panel : Le VENTANA MMR RxDx Panel est constitué de quatre tests : La répétition de la coloration d’un échantillon pour un test MMR VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary RxDx particulier du panel (p. ex. VENTANA anti-MLH1 (M1) Antibody, VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Mouse Monoclonal Primary Antibody) doit être effectuée sur Primary Antibody, VENTANA anti-MSH2 (G219-1129) Mouse des lames non colorées si (1) la lame du cas colorée avec le NRC Monoclonal Primary Antibody et VENTANA anti-MSH6 approprié pour ce test ne présente pas de coloration acceptable (SP93) Rabbit Monoclonal Primary Antibody. Il est nécessaire ou (2) si la lame du cas colorée avec ce test MMR RxDx particulier d’effectuer une coupe sériée du tissu de l’échantillon à tester (p. ex. VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary pour la coloration avec chacun de ces anticorps. Des coupes Antibody) n’est pas évaluable. Si l’une des lames n’est pas sériées de tissu supplémentaires sont nécessaires pour la interprétable à cause d’un manque de coloration dans les cellules coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E) et avec l’anticorps NRC du contrôle positif interne, de la présence d’artéfacts, d’effets correspondant à l’espèce de l’anticorps approprié du VENTANA de bord, d’une nécrose, d’un manque de tissu ou de toute autre MMR RxDx Panel (Negative Control (Monoclonal) (mNRC) ou raison, la lame ne peut être évaluée. Si la coloration des contrôles Rabbit Monoclonal Negative Control Ig (rNRC)). est acceptable et que les lames colorées à l’aide du VENTANA MMR RxDx Panel sont évaluables, elles peuvent être évaluées par Les cellules néoplasiques colorées à l’aide du VENTANA MMR un anatomopathologiste qualifié comme décrit dans la section RxDx Panel sont évaluées quant à la présence ou à l’absence Algorithme de notation. du signal DAB. La lame correspondante colorée avec le NRC est utilisée pour évaluer la coloration de fond non spécifique REMARQUE : L’OptiView DAB IHC Detection Kit et l’OptiView et le niveau de coloration de fond due aux éléments tissulaires Amplification Kit sont les seuls réactifs de détection recommandés spécifiques (consulter les images de cas efficaces et insuffisants). pour une utilisation avec le VENTANA MMR RxDx Panel. Si l’évaluation H&E indique que l’échantillon patient est inadéquat Les tableaux 3 et 4 présentent les interprétations pour l’expression (par exemple, si moins de 50 cellules tumorales viables sont des protéines et le statut MMR avec le VENTANA MMR présentes), alors il faut obtenir un nouvel échantillon. RxDx Panel. La section Images de référence traite de cas représentatifs. Tableau 3 : Interprétation du VENTANA MMR RxDx Panel quant à l’expression des protéines Expression intacte des protéines Perte d’expression des protéines Coloration nucléaire sans équivoque dans les cellules Perte sans équivoque de coloration nucléaire ou faible coloration tumorales viables en présence de contrôles positifs nucléaire focale équivoque dans les cellules tumorales viables internes acceptables (p. ex. coloration nucléaire dans en présence de contrôles positifs internes acceptables. Une les lymphocytes, les fibroblastes ou l’épithélium normal coloration nucléaire ponctuée est considérée comme négative à proximité de la tumeur) Tableau 4 : Interprétation du VENTANA MMR RxDx Panel quant au statut MMR 6 Efficace Insuffisant Les quatre protéines (MLH1, PMS2, MSH2 et MSH6) du Au moins une protéine (MLH1, PMS2, MSH2 ou MSH6) du panel panel présentent une expression intacte présente une perte d’expression VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Carcinome de l’endomètre – Diagnostic clinique insuffisant MLH1 20x MSH6 20x MSH2 20x Statut Perte pour MLH1 : absence Statut Perte pour MSH6 : absence Statut Perte pour MSH2 : absence de coloration nucléaire en présence de de coloration nucléaire en présence de de coloration nucléaire en présence de contrôles positifs internes acceptables contrôles positifs internes acceptables contrôles positifs internes acceptables Carcinome de l’endomètre – Diagnostic clinique efficace PMS2 20x MSH2 20x Noyaux positifs pour MSH2 Noyaux positifs pour PMS2 MLH1 20x Noyaux positifs pour MLH1 Statut Intact pour MSH2 : forte Statut Intact pour PMS2 : forte coloration Statut Intact pour MLH1 : forte coloration coloration nucléaire en présence de nucléaire en présence de contrôles positifs nucléaire en présence de contrôles positifs contrôles positifs internes acceptables internes acceptables internes acceptables VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 7 Contrôles Lorsqu’ils sont colorés avec le VENTANA MMR RxDx Panel, les éléments tissulaires normaux tels que les lymphocytes, les fibroblastes ou l’épithélium normal à proximité de la tumeur présentent une coloration nucléaire pour les protéines MMR. Ces éléments tissulaires font office de contrôles positifs internes et doivent être acceptables pour évaluer la lame colorée pour chaque test du panel. Les contrôles internes doivent être évalués pour chaque test et doivent satisfaire aux critères de coloration pour l’interprétation du panel quant au statut MMR. En l’absence de coloration nucléaire sans équivoque dans les lymphocytes, les fibroblastes ou l’épithélium normal à proximité de la tumeur, la lame colorée du test doit être considérée comme « non évaluable ». Le tableau 5 décrit les critères pour une coloration acceptable des contrôles internes. Tableau 5 : Critères de coloration des contrôles internes Évaluable Non évaluable Présence d’une coloration nucléaire sans équivoque dans Absence de coloration nucléaire sans équivoque dans les les éléments tissulaires normaux (p. ex. lymphocytes, éléments tissulaires normaux (p. ex. lymphocytes, fibroblastes fibroblastes ou épithélium normal) à proximité de la tumeur ou épithélium normal) à proximité de la tumeur Contrôles positifs internes Les images ci-dessous sont représentatives du contrôle interne pour le VENTANA MMR RxDx Panel. H&E 40x mNRC 40x MLH1 40x Cas 1 de contrôle positif interne : Le carcinome de l’endomètre ne présente aucune coloration du contrôle interne à proximité des cellules tumorales, et le carcinome ne peut donc être évalué. Le Negative Reagent Control acceptable illustré est le NRC de souris (mouse NRC, mNRC). 8 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre H&E 20x Coloration des cellules du contrôle interne MLH1 20x mNRC 20x Coloration des cellules du contrôle interne MSH2 20x Cas 2 de contrôle positif interne : Une forte coloration des cellules du contrôle interne est présente à proximité de la tumeur d’un cas de carcinome de l’endomètre avec un statut Perte pour MLH1 et d’un cas avec un statut Intact pour MSH2. Le Negative Reagent Control acceptable est le NRC de souris (mNRC). VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 9 Procédure de traitement des échantillons Les tests effectués à l’aide du VENTANA MMR RxDx Panel nécessitent plusieurs coupes sériées du tissu de chaque échantillon à tester. Une coupe est nécessaire pour la coloration avec chacun des 4 tests : VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody, VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Primary Antibody, VENTANA anti-MSH2 (G219-1129) Mouse Monoclonal Primary Antibody et VENTANA anti-MSH6 (SP93) Rabbit Monoclonal Primary Antibody. De plus, des coupes de chaque échantillon à tester sont nécessaires pour la coloration H&E et la coloration avec l’anticorps NRC approprié pour l’espèce de l’anticorps correspondant du VENTANA MMR RxDx Panel (mNRC ou rNRC). Si l’évaluation H&E indique que l’échantillon patient est inadéquat (par exemple, si moins de 50 cellules tumorales viables sont présentes), alors il faut obtenir un nouvel échantillon. La répétition de la coloration d’un échantillon pour un test MMR RxDx particulier du panel (p. ex. VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody) doit être effectuée sur des lames non colorées si (1) la lame du cas colorée avec le réactif de contrôle négatif approprié ne présente pas de coloration acceptable ou (2) si la lame du cas colorée avec ce test MMR RxDx particulier (p. ex. VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody) n’est pas évaluable. Si l’une des lames n’est pas interprétable à cause de l’absence de coloration dans les cellules du contrôle positif interne, d’artéfacts, d’effets de bord, d’une nécrose, d’un manque de tissu ou de toute autre raison, la lame ne peut être évaluée. Si les contrôles sont acceptables et que les lames colorées à l’aide du VENTANA MMR RxDx Panel sont évaluables, elles peuvent être évaluées par un anatomopathologiste qualifié comme décrit dans la section Algorithme de notation. REMARQUE : L’OptiView DAB IHC Detection Kit et l’OptiView Amplification Kit sont les seuls réactifs de détection recommandés pour une utilisation avec le VENTANA MMR RxDx Panel. 10 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Déroulement du traitement des échantillons L’échantillon de tissu tumoral est fixé dans du formol neutre tamponné à 10 % pendant 6-72 heures. Des coupes de 4 μm d’épaisseur sont montées sur des lames chargées positivement (6 ou 7 coupes sériées sont nécessaires). La lame H&E estelle acceptable (≥ 50 cellules viables) ? Tumeur H&E Non Une coupe est colorée par H&E. Oui Répéter la coloration sur un nouvel échantillon patient* Une coupe est colorée avec chaque test du VENTANA MMR RxDx Panel. De plus, chaque condition de test est colorée avec un réactif de contrôle négatif approprié, Negative Control (Monoclonal) (mNRC) ou Rabbit Monoclonal Negative Control Ig (rNRC), selon le cas, lors du même cycle d’appareil. Non Répéter le cycle de coloration La lame d’échantillon colorée par le réactif de contrôle négatif est-elle acceptable ? Tumeur NRC Oui Non Répéter la coloration du cas* Chaque lame d’échantillon colorée présentet-elle des contrôles internes acceptables ? Contrôle interne Oui Non Répéter la coloration du cas* Les lames d’échantillon colorées à l’aide du VENTANA MMR RxDx Panel sontelles acceptables ? *La répétition peut s’effectuer sur le même bloc patient ou un autre bloc de tissu du même patient, selon le cas. (Toutes les images de tumeurs sont agrandies 20x) VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Tumeur IHC Oui Le résultat MMR (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6) est déterminé par un anatomopathologiste qualifié conformément à l’algorithme de notation du VENTANA MMR RxDx Panel. 11 Images de référence Cas efficaces H&E 20x mNRC 20x rNRC 20x MLH1 20x PMS2 20x MSH2 20x MSH6 20x Cas efficace 1 : Statut Intact pour MLH1, PMS2, MSH2 et MSH6 dans un carcinome de l’endomètre présentant une forte coloration nucléaire dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. Les Negative Reagent Controls acceptables illustrés sont le NRC de souris (mouse NRC, mNRC) et le NRC de lapin (rabbit NRC, rNRC). 12 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre H&E 20x mNRC 20x rNRC 20x MLH1 20x PMS2 20x MSH2 20x MSH6 20x Cas efficace 2 : Statut Intact pour MLH1, PMS2, MSH2 et MSH6 dans un carcinome de l’endomètre présentant une forte coloration nucléaire dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC). VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 13 Cas insuffisants H&E 20x mNRC 20x rNRC 20x MLH1 20x PMS2 20x MSH2 20x MSH6 20x Cas insuffisant 1 : Statut Perte pour MLH1 et PMS2 dans un carcinome de l’endomètre ne présentant aucune coloration nucléaire dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. MSH2 et MSH6 ont un statut Intact. La coloration cytoplasmique n’est pas prise en compte pour l’interprétation du statut. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC). 14 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre H&E 20x mNRC 20x rNRC 20x MLH1 20x PMS2 20x MSH2 20x MSH6 20x Cas insuffisant 2 : Statut Perte pour MLH1 et PMS2 dans un carcinome de l’endomètre ne présentant aucune coloration nucléaire dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. MSH2 et MSH6 ont un statut Intact. La coloration cytoplasmique n’est pas prise en compte pour l’interprétation du statut. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC). VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 15 H&E 20x mNRC 20x rNRC 20x MLH1 20x PMS2 20x MSH2 20x MSH6 20x Cas insuffisant 3 : Statut Perte pour MSH2 et MSH6 dans un carcinome de l’endomètre ne présentant aucune coloration nucléaire dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. MLH1 et PMS2 ont un statut Intact. La coloration cytoplasmique n’est pas prise en compte pour l’interprétation du statut. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC). 16 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre H&E 20x mNRC 20x rNRC 20x MLH1 20x PMS2 20x MSH2 20x MSH6 20x Cas insuffisant 4 : Statut Perte pour MSH6 dans un carcinome de l’endomètre ne présentant aucune coloration nucléaire dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. MLH1, PMS2 et MSH2 ont un statut Intact. PMS2 présente une coloration hétérogène. La coloration cytoplasmique n’est pas prise en compte pour l’interprétation du statut. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC). VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 17 Cas difficiles Bien que la vaste majorité des cas colorés à l’aide du VENTANA • Coloration ponctuée : Certains échantillons peuvent présenter MMR RxDx Panel soient clairement efficaces ou insuffisants, il a une coloration ponctuée discontinue au sein de quelques été observé quelques cas difficiles à interpréter. noyaux de la tumeur ; l’intensité de la coloration peut varier entre faible et forte. Ce profil de coloration doit être ignoré, et Index des cas difficiles : • Cas difficile 1 : Coloration de fond non spécifique – Piégeage de la DAB • Cas difficile 2 : Coloration de fond non spécifique – Coloration cytoplasmique • Cas difficile 3 : Coloration focale • Cas difficile 4 : Coloration ponctuée • Cas difficile 5 : Mouchetage • Cas difficile 6 : Artéfact de gradient de fixation • Cas difficile 7 : Coloration hétérogène • Cas difficile 8 : Dépôts de pigment • Cas difficile 9 : Coloration membranaire si un cas ne présente que ce type de profil de coloration, il doit se voir attribuer un statut clinique Perte. • Mouchetage : Par rapport à la coloration ponctuée, le mouchetage possède un aspect plus fin, plus granulaire, et peut être focal ou se retrouver dans de nombreuses cellules tumorales. Ce profil de coloration, s’il est observé dans les noyaux des cellules tumorales, doit être ignoré et la lame doit se voir attribuer un statut Perte. • Artéfact du tissu ou de la coloration : Les artéfacts histologiques provenant du traitement des échantillons et des processus de microtomie peuvent également compliquer la Certains cas peuvent être particulièrement difficiles à évaluer en détermination du statut clinique du MMR RxDx. Ces artéfacts raison des problèmes suivants : peuvent notamment comprendre les artéfacts de cautérisation du tissu, les gradients de fixation et les effets de bord, le • Coloration de fond non spécifique : Certains échantillons piégeage de la DAB, les dépôts de pigment d’hémosidérine, peuvent présenter une coloration de fond non spécifique dont les bulles nucléaires, le manque de coloration dans certaines l’origine n’est pas bien comprise. Pour cette raison, l’évaluation régions du tissu (coloration hétérogène), la coloration d’une lame MMR RxDx doit comprendre une comparaison membranaire et/ou cytoplasmique, le déchirement ou le de la lame avec la lame du réactif de contrôle négatif afin de repliement du tissu et la perte de coupe de tissu. Dans certains déterminer le niveau de la coloration de fond non spécifique. cas, il faut répéter la coloration avec de nouvelles coupes ou La coloration cytoplasmique, si elle est présente, ne doit pas prélever un nouvel échantillon. être prise en compte dans l’interprétation du MMR RxDx. Des exemples de cas difficiles sont illustrés dans les pages • Coloration focale : Certains échantillons peuvent présenter suivantes. une coloration focale dans les cellules tumorales et l’intensité de la coloration peut varier entre faible et forte. D’après l’algorithme de notation du MMR RxDx, une faible coloration nucléaire focale équivoque dans les cellules tumorales viables en présence de contrôles positifs internes doit se voir attribuer un statut clinique Perte. À l’inverse, une forte coloration nucléaire focale sans équivoque dans les cellules tumorales viables en présence de contrôles positifs internes doit se voir attribuer un statut clinique Intact. 18 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Coloration de fond non spécifique – Piégeage de la DAB H&E 4x mNRC 4x rNRC 4x MLH1 4x PMS2 4x MSH2 4x MSH6 4x Cas difficile 1 : Statut Perte pour MLH1 et PMS2 dans un carcinome de l’endomètre ne présentant aucune coloration nucléaire en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée avec coloration de fond non spécifique en lien avec un piégeage focal de la DAB dans le stroma (flèches bleues). Le statut Intact pour MSH2 et MSH6 présente une forte coloration nucléaire et une coloration de fond non spécifique en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. La coloration de fond cytoplasmique observée dans les cellules tumorales ne doit pas être prise en compte pour l’interprétation du statut. Un piégeage focal de la DAB est aussi observé sur la lame MSH2 (flèche bleue). Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC). VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 19 Coloration de fond non spécifique – Coloration cytoplasmique H&E 40x mNRC 40x rNRC 40x MLH1 40x PMS2 40x MSH2 40x MSH6 40x Cas difficile 2 : Statut Intact pour MSH2 et MSH6 dans un carcinome de l’endomètre présentant une forte coloration nucléaire dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. MSH2 présente une coloration cytoplasmique et un mouchetage cytoplasmique focal dans les cellules tumorales (flèches bleues), qui ne doivent pas être pris en compte pour l’interprétation du statut. Statut Perte pour MLH1 et PMS2 sans coloration nucléaire en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. PMS2 présente une coloration de contrôle interne faible et focale, mais interprétable. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC). 20 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Coloration focale H&E 20x mNRC 20x rNRC 20x MLH1 20x PMS2 20x MSH2 20x MSH6 20x Absence de coloration dans les cellules tumorales Coloration focale dans les cellules tumorales Cas difficile 3 : Statut Intact pour MLH1, PMS2, MSH2 et MSH6 dans un carcinome de l’endomètre. MSH6 présente une coloration nucléaire focale sans équivoque dans les cellules tumorales en présence de cellules de contrôle positif interne acceptables et est donc interprété comme Intact. PMS2 présente une intensité de coloration nucléaire hétérogène en présence de cellules de contrôle interne colorées de façon appropriée. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC). VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 21 Coloration ponctuée H&E 20x MLH1 20x mNRC 20x Coloration ponctuée MLH1 40x Cas difficile 4 : Statut Perte pour MLH1 dans un carcinome de l’endomètre présentant une forte coloration ponctuée dans les noyaux de quelques cellules tumorales. Cependant, aucune cellule dans la tumeur ne présente de coloration nucléaire sans équivoque en présence de contrôles positifs internes colorés de façon appropriée. Le Negative Reagent Control acceptable est le NRC de souris (mNRC). 22 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Mouchetage H&E 40x mNRC 40x rNRC 40x MLH1 40x PMS2 40x Mouchetage cytoplasmique MSH2 40x MSH6 40x Cas difficile 5 : Statut Perte pour MLH1 et PMS2 dans un carcinome de l’endomètre ne présentant aucune coloration nucléaire dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. PMS2 présente un mouchetage cytoplasmique. PMS2 et MSH2 présentent une faible coloration cytoplasmique. La coloration et le mouchetage cytoplasmiques ne sont pas pris en compte pour l’interprétation du statut. Le statut Intact pour MSH2 et MSH6 présente une coloration nucléaire sans équivoque en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC). VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 23 Artéfact du gradient de fixation H&E 4x mNRC 4x rNRC 4x MLH1 4x PMS2 4x MSH2 4x MSH6 4x Cas difficile 6 : Un artéfact de gradient de fixation dans les cellules tumorales et les cellules de contrôle positif interne peut être observé dans ce carcinome de l’endomètre présentant un statut Intact pour MLH1 et PMS2 et un statut Perte pour MSH2 et MSH6. L’interprétation des marqueurs ne doit être effectuée qu’en présence de contrôles positifs internes acceptables. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC). 24 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Coloration hétérogène H&E 10x mNRC 10x rNRC 10x MLH1 10x PMS2 10x MSH2 10x MSH6 10x Cas difficile 7 : Statut Intact pour MLH1, PMS2 et MSH2 dans un carcinome de l’endomètre présentant une intensité de coloration nucléaire hétérogène dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. Le statut Perte pour MSH6 ne révèle aucune coloration nucléaire à proximité des contrôles internes colorés de façon appropriée. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC). VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 25 Dépôts de pigment H&E 20x rNRC 20x MSH6 20x MSH6 40x Cas difficile 8 : Statut Intact pour MSH6 dans un carcinome de l’endomètre présentant une forte coloration nucléaire dans la tumeur en présence de contrôles positifs internes colorés de façon faible, mais appropriée. Des dépôts de pigment d’hémosidérine sont observés à côté des cellules tumorales et des contrôles internes, et ils ne doivent pas être pris en compte pour l’interprétation du statut (flèches bleues). Le Negative Reagent Control acceptable est le NRC de lapin (rNRC). 26 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Coloration membranaire H&E 20x mNRC 20x MSH2 20x MSH2 40x Cas difficile 9 : MSH2 non évaluable dans un carcinome de l’endomètre présentant uniquement une coloration membranaire (flèches bleues) sans contrôles internes colorés de façon appropriée. Le Negative Reagent Control acceptable est le NRC de souris (mNRC). VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 27 Impact des conditions préanalytiques sur le VENTANA MMR RxDx Panel Conditions de fixation acceptables pour des résultats de coloration optimaux Ventana recommande : • De traiter le tissu immédiatement après l’excision (temps d’ischémie ≤ 6 heures) • De fixer dans du formol neutre tamponné (neutral buffered formalin, NBF) à 10 % pendant 6-72 heures. Voir les fixateurs et les temps de fixation acceptables dans les encadrés bleus (tableaux 5-8). Tableau 5 : Coloration d’un tissu bénin d’amygdale humaine à l’aide du VENTANA anti-MLH1(M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody et de différents fixateurs et temps de fixation Fixateur Temps (heures) NBF à 10 % Formol zinc** Z-5** PREFER** AFA** Alcool à 95 %** 1* 6 12 24 72 (toutes les images sont agrandies 20x) REMARQUES Les fixateurs et les temps de fixation suivants ne sont pas recommandés : * La fixation pendant moins de 6 heures n’est pas recommandée. ** Les échantillons fixés avec des fixateurs tels que le formol zinc, Z-5 (Anatech Ltd), PREFER, AFA et l’alcool à 95 % présentent une coloration faible ou variable. La fixation avec le formol zinc, Z-5, PREFER, AFA et l’alcool à 95 % n’est pas recommandée. 28 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Tableau 6 : Coloration d’un tissu bénin d’amygdale humaine à l’aide du VENTANA anti-PMS2(A16-4) Mouse Monoclonal Primary Antibody et de différents fixateurs et temps de fixation Fixateur Temps (heures) NBF à 10 % Formol zinc** Z-5** PREFER** AFA** Alcool à 95 %** 1* 6 12 24 72 (toutes les images sont agrandies 20x) REMARQUES Les fixateurs et les temps de fixation suivants ne sont pas recommandés : * La fixation pendant moins de 6 heures n’est pas recommandée. ** Les échantillons fixés avec des fixateurs tels que le formol zinc, Z-5 (Anatech Ltd), PREFER, AFA et l’alcool à 95 % présentent une coloration faible ou variable. La fixation avec le formol zinc, Z-5, PREFER, AFA et l’alcool à 95 % n’est pas recommandée. VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 29 Tableau 7 : Coloration d’un tissu bénin d’amygdale humaine à l’aide du VENTANA anti-MSH2(G219-1129) Mouse Monoclonal Primary Antibody et de différents fixateurs et temps de fixation Fixateur Temps (heures) NBF à 10 % Formol zinc** Z-5** PREFER** AFA** Alcool à 95 %** 1* 6 12 24 72 (toutes les images sont agrandies 20x) REMARQUES Les fixateurs et les temps de fixation suivants ne sont pas recommandés : * La fixation pendant moins de 6 heures n’est pas recommandée. ** Les échantillons fixés avec des fixateurs tels que le formol zinc, Z-5 (Anatech Ltd), PREFER, AFA et l’alcool à 95 % présentent une coloration faible ou variable. La fixation avec le formol zinc, Z-5, PREFER, AFA et l’alcool à 95 % n’est pas recommandée. 30 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Tableau 8 : Coloration d’un tissu bénin d’amygdale humaine à l’aide du VENTANA anti-MSH6(SP93) Rabbit Monoclonal Primary Antibody et de différents fixateurs et temps de fixation Fixateur Temps (heures) NBF à 10 % Formol zinc** Z-5** PREFER** AFA** Alcool à 95 %** 1* 6 12 24 72 (toutes les images sont agrandies 20x) REMARQUES Les fixateurs et les temps de fixation suivants ne sont pas recommandés : * La fixation pendant moins de 6 heures n’est pas recommandée. ** Les échantillons fixés avec des fixateurs tels que le formol zinc, Z-5 (Anatech Ltd), PREFER, AFA et l’alcool à 95 % présentent une coloration faible ou variable. La fixation avec le formol zinc, Z-5, PREFER, AFA et l’alcool à 95 % n’est pas recommandée. VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 31 Stabilité des lames Ventana a établi que le VENTANA MMR RxDx Panel ne doit pas être utilisé avec des lames conservées pendant plus de 45 jours. Les lames doivent être colorées immédiatement, car l’antigénicité des coupes de tissus peut diminuer au cours du temps et être compromise 45 jours après la coupe du bloc de tissu FFPE. Épaisseur des tissus Les coupes doivent posséder une épaisseur de 4 µm et être montées sur des lames de verre chargées positivement. Aucune autre épaisseur n’a été validée. 32 VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre Références 1. 2. Hsieh P, Yamane K. DNA mismatch repair: in mismatch repair-deficient endometrial Mech Ageing Dev. 2008;129(7-8):391-407. carcinomas, including Lynch Syndrome-associated Naboush A, Roman C, Shapira I. Immune checkpoint inhibitors in malignancies with mismatch repair deficiency: a review of the state of the current knowledge. J Investig Med. 2017;65(4):754-758. 3. Chang L, Chang M, Chang HM, et al. Microsatellite instability: a predictive biomarker for cancer immunotherapy. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2018;26(2):e15-e21. 4. Buza N, Ziai J, Hui P. Mismatch repair deficiency testing in clinical practice. Expert Rev Mol Diagn. 2016;16(5):591-604. 5. Silva FCC, Torrezan GT, Ferreira JRO, et al. Germline mutations in MLH1 leading to isolated loss of PMS2 expression in Lynch syndrome: Implications for diagnostics in the clinic. Am J Surg Pathol. 2017;41(6):861-864. 6. Cunningham JM, Tester DJ, Thibodeau SN. Mutation detection in colorectal cancers: direct sequencing of DNA mismatch repair genes. Methods Mol Med. 2001;50:87-98. 7. 13. Sloan EA, Ring KL, Willis BC, et al. PD-L1 expression Molecular mechanism, cancer, and ageing. and MLH1 promoter hypermethylated tumors. Am J Surg Pathol. 2017;41(3):326-333. 14. Le DT, Durham JN, Smith KN, et al. Mismatch repair deficiency predicts response of solid tumors to PD-1 blockade. Science. 2017;357(6349):409-413. 15. Dudley JC, Lin MT, Le DT, et al. Microsatellite instability as a biomarker for PD-1 blockade. Clin Cancer Res. 2016;22(4):813-820. 16. Howitt BE, Shukla SA, Sholl LM, et al. Association of polymerase e–mutated and microsatellite-instable endometrial cancers with neoantigen load, number of tumor-infiltrating lymphocytes, and expression of PD-1 and PD-L1. JAMA Oncol. 2015;1(9):1319–1323 17. Tran A-Q and Gehrig P. Recent advances in endometrial cancer [version 1; referees: 2 approved]. F1000Research 2017;6(F1000 Faculty Rev):81 Blank C, Mackensen A. Contribution of the PD L1/ PD-1 pathway to T-cell exhaustion: an update on implications for chronic infections and tumor evasion. Cancer Immunol Immunother. 2007;56(5):739-745. 8. Herbst RS, Soria JC, Kowanetz M, et al. Predictive correlates of response to the anti-PD L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. 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VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre 33 Pour les coordonnées du fabricant, consulter les notices correspondantes du VENTANA MMR RxDx Panel. www.roche.com © 2021 Ventana Medical Systems, Inc. et Roche Diagnostics International, Inc. Tous droits réservés. VENTANA, OPTIVIEW et le logo VENTANA sont des marques commerciales de Roche. Toutes les autres marques commerciales appartiennent à leurs propriétaires respectifs. 1020315FR Rev A 2021-02-15 ">
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