VENTANA PD-L1 (SP142) Assay Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial ii VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial Table des matières Introduction 1 Utilisation prévue 2 Utilisation prévue du produit 2 Objectif du guide d’interprétation 2 Évaluation clinique 3 Présentation de la coloration 3 Algorithme d’évaluation du test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay pour le carcinome urothélial 4 Déroulement du traitement des échantillons 5 Contrôles 6 Caractéristiques de la coloration - Carcinome urothélial 7 Différentiation de la coloration des IC et de la coloration des TC : 9 Méthode d’évaluation 11 Méthodes d’évaluation : difficultés et écueils 14 Images de référence 17 Test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay : évaluation des IC 17 Test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay : IC < 5 % 18 Test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay : IC ≥ 5 % 21 Cas difficiles 24 Artefacts de coloration 26 Impact des conditions pré-analytiques sur le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay 29 Conditions de fixation acceptables pour obtenir des résultats de VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial coloration optimaux avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay 29 Stabilité de l’antigène sur des coupes de tissu 30 Références 31 iii Introduction VENTANA PD-L1 (SP142) Assay est un test immunohistochimique qui utilise un anticorps primaire monoclonal de lapin anti-PD-L1 pour reconnaître la protéine-ligand de mort programmée 1 (PD-L1). Ce test a été mis au point conjointement par Roche/Ventana Medical Systems, Inc. (Ventana) et Roche/Genentech afin d’identifier les patients atteints d’un carcinome urothélial localement avancé ou métastatique (mUC) les plus susceptibles de répondre positivement à un traitement par TECENTRIQ® (atezolizumab). Le carcinome urothélial (également appelé carcinome des cellules urothéliales, carcinome à cellules transitionnelles des voies urinaires ou cancer urothélial de la vessie) est le cancer du système urinaire le plus courant dans le monde. La majorité des tumeurs urothéliales apparaissent dans la vessie. Elles apparaissent plus rarement dans le pelvis rénal, dans l’urètre ou dans l’uretère. Le carcinome à cellules transitionnelles (TCC) est le sous-type histologique le plus courant associé au cancer de la vessie et représente plus de 90 % de tous les cas de carcinome urothélial dans le monde industrialisé ; les soustypes non urothéliaux (ex. : carcinome épidermoïde, adénocarcinome, carcinome à petites cellules) sont plus fréquents dans les autres régions du monde.1 Globalement, on estime à 429 793 le nombre de nouveaux cas de cancer de la vessie et à 165 084 le nombre de décès en 2012.2 Rien qu’en Europe, en 2012, on estimait à 151 297 le nombre de nouveaux cas de cancer de la vessie et à 52 411 le nombre de décès. En 2015, on estime qu’il y aurait eu 74 000 nouveaux cas de cancer de la vessie et 16 000 décès aux États-Unis.3 Le carcinome urothélial se présente sous forme de maladie invasive non musculaire, de maladie invasive musculaire ou de maladie métastatique. Le taux de survie relatif à cinq ans des patients atteints d’un mUC est d’environ 5,4 %.4 PD-L1 est une protéine transmembranaire qui réduit les réponses immunitaires en se liant à ses deux récepteurs, programmed death-1 (PD-1) et B7.1 (Figure 1). PD-1 est un récepteur inhibiteur exprimé sur les lymphocytes T suite à l’activation de ces derniers, cette activation perdurant en état de stimulation chronique comme dans les cas d’infection chronique ou de cancer5. La liaison de PD-L1 et de PD-1 empêche la prolifération des lymphocytes T, la production des cytokines et l’activité cytolytique, ce qui entraîne l’inactivation fonctionnelle ou l’épuisement des lymphocytes T. B7.1 est une molécule exprimée sur les cellules présentatrices d’antigène et sur les lymphocytes T activés. La liaison de la protéine PD-L1 et du récepteur B7.1 sur les lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigène peut entraîner une diminution des réponses immunitaires, y compris l’inhibition de l’activation des lymphocytes T et la production des cytokines.6 L’expression de 1 Figure 1 : Voie PD-1/PD-L1 PD-L1 sur les cellules immunitaires et tumorales a été observée. L’expression aberrante de PD-L1 sur les cellules tumorales (TC) semblerait entraver l’immunité anti-tumorale, résultant en une évasion immunitaire.5, 7 L’interruption de la voie PD-L1/PD-1 représente donc une stratégie attrayante pour redynamiser l’immunité des lymphocytes T spécifiques de la tumeur supprimée par l’expression de PD-L1 dans le microenvironnement tumoral. Une corrélation entre l’expression de PD‑L1 dans les TC ou dans les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs (IC) et le bénéfice clinique obtenu avec les inhibiteurs de la voie PD‑L1/PD-1 a été décrite dans plusieurs types de cancers.7-13 L’atezolizumab est un anticorps monoclonal humanisé présentant une région Fc qui se lie à PD-L1 et bloque les interactions avec les récepteurs PD-1 et B7.1. L’atezolizumab est une immunoglobuline kappa IgG1 non glycosylée dont la masse moléculaire calculée est de 145 kDa. VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial Utilisation prévue Utilisation prévue du produit Objectif du guide d’interprétation Consulter la notice du test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay pour une description détaillée de l’utilisation prévue de ce produit. Le guide d’interprétation du test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay est destiné à aider les anatomopathologistes à interpréter et à évaluer les tissus de carcinome urothélial colorés avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay. Remarque : L’utilisation de ce diagnostic avec les traitements indiqués peut ne pas être autorisée dans tous les pays. Consultez votre représentant local Roche pour les autorisations locales. • Les photographies incluses dans ce guide de formation illustrent les profils de coloration, ainsi que la portée de l’expression de PD-L1, qui peuvent être présents dans les tissus de carcinome urothélial colorés avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay. • L’utilisation des amygdales comme tissu de contrôle dans le contexte de l’évaluation de PD-L1, ainsi que les caractéristiques et performances de coloration correspondantes sont traitées. • Les cas difficiles, les artéfacts de coloration et l’impact des conditions pré-analytiques sur le test sont également abordés. VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 2 Évaluation clinique Présentation de la coloration Le test de coloration immunohistochimique (IHC) VENTANA PD-L1 (SP142) Assay génère une coloration sur les IC (Figure 2) ainsi que sur les TC (Figure 3). Les caractéristiques détaillées de la coloration sont décrites à la section « Caractéristiques de la coloration pour le carcinome urothélial ». H&E 10X PD-L1 10X Figure 2 : Tissu de carcinome urothélial présentant une coloration punctiforme et linéaire marron foncé des IC. H&E 20X PD-L1 20X Coloration des IC Coloration des TC Figure 3 : Tissu de carcinome urothélial présentant une forte coloration membranaire circonférentielle des TC ainsi qu'une coloration des IC. 3 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial Algorithme d’évaluation du test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay pour le carcinome urothélial Un tissu de carcinome urothélial coloré avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay sera évalué selon les critères indiqués dans le Tableau 1. Les cellules immunitaires infiltrant la tumeur (IC) sont évaluées en fonction du pourcentage de la zone tumorale occupée par des IC présentant une coloration de PD-L1, quelle qu’en soit l’intensité. Si l’échantillon présente une coloration de PD-L1, quelle qu’en soit l’intensité, dans des cellules immunitaires infiltrant la tumeur occupant ≥ 5 % de la zone tumorale, le cas se verra attribuer un niveau d’expression de PD-L1 de IC ≥ 5 %. Si l’échantillon présente une coloration de PD-L1, quelle qu’en soit l’intensité, dans des cellules immunitaires infiltrant la tumeur couvrant < 5 % de la zone tumorale, le cas se verra attribuer un niveau d’expression de PD-L1 de IC < 5 %. Les échantillons de tissu de carcinome urothélial obtenus par résection, par résection transurétrale de tumeur de la vessie (TURBT) et par biopsie au trocart sur des sites primaires et métastatiques sont acceptables. Ce test n’a pas été validé pour une utilisation avec des échantillons de cytologie ou des échantillons d’os décalcifiés. Un tissu de carcinome urothélial est considéré comme adéquat pour une évaluation avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay s’il contient au moins 50 cellules tumorales viables et le stroma associé. La coloration nécessite trois coupes de chaque cas, une première coupe de tissu sériée pour la coloration H&E (hématoxyline et éosine), une deuxième pour la coloration avec le réactif de contrôle négatif et une troisième pour la coloration avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay. Un échantillon de tissu amygdalien bénin préqualifié doit être utilisé comme tissu de contrôle positif et négatif pour chaque cycle de coloration. Des instructions détaillées concernant les critères de qualification et l’acceptabilité du tissu de contrôle sont fournies dans le Tableau 2. Le tissu du patient doit être coloré avec un réactif de contrôle négatif afin d’évaluer la coloration de fond non spécifique. Tableau 1 : Algorithme d’évaluation du test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay pour le carcinome urothélial Coloration des cellules immunitaires infiltrant la tumeur (IC) Expression de PD-L1 Absence de coloration visible de PD-L1 (OU) Présence d’une coloration visible de PD-L1, quelle qu’en soit l’intensité, sur une quantité de cellules immunitaires infiltrant la tumeur couvrant < 5 % de la zone tumorale occupée par des cellules tumorales, du stroma intratumoral associé et du stroma péritumoral contigu IC < 5 % Présence d’une coloration visible de PD-L1, quelle qu’en soit l’intensité, sur une quantité de cellules immunitaires infiltrant la tumeur couvrant ≥ 5 % de la zone tumorale occupée par des cellules tumorales, du stroma intratumoral associé et du stroma péritumoral contigu IC ≥ 5 % VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 4 Déroulement du traitement des échantillons Un échantillon de tissu de carcinome urothélial est fixé dans du formol neutre tamponné à 10 % pendant 6 à 72 heures, traité, puis inclus en paraffine conformément aux procédures de laboratoire standard. Les coupes de 4 μm d’épaisseur sont placées sur des lames de verre chargées positivement. (Trois coupes sériées sont nécessaires) Adéquation de l’échantillon : au moins 50 cellules tumorales viables avec le stroma associé La coloration H&E est effectuée. La lame H&E estelle acceptable ? Carcinome urothélial H&E Non Oui Répétition de la coloration* Répétition de la coloration* Une coupe est colorée avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay. Une coupe est colorée avec l’anticorps Rabbit Monoclonal Negative Control Ig (Negative Reagent Control, NRC). Un échantillon de tissu amygdalien est utilisé comme tissu de contrôle positif et négatif. Non La lame de contrôle portant l’échantillon de tissu amygdalien est-elle acceptable ? Tissu amygdalien, IHC Oui Répétition de la coloration* Non La lame NRC estelle acceptable ? Carcinome urothélial, NRC Oui Répétition de la coloration* Non La lame IHC PD-L1 est-elle acceptable ? *La répétition peut être effectuée sur le même tissu ou sur un autre échantillon de tissu du patient, selon le cas. (Toutes les images du carcinome urothélial sont obtenues avec un grossissement 1x. Les images du tissu amygdalien sont obtenues avec un grossissement 4x.) 5 Oui Carcinome urothélial IHC Statut de PD-L1 relevé par un anatomopathologiste expérimenté VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial Contrôles Les tissus de contrôle doivent être utilisés uniquement pour vérifier que les performances des tissus traités, des réactifs de test et des instruments sont correctes, et non comme une aide à la formulation d’un diagnostic spécifique sur des échantillons de patients. Il est recommandé d’utiliser un tissu de contrôle pour chaque cycle de coloration (les contrôles sur lame sont acceptables). Le tissu amygdalien humain bénin est un tissu de contrôle idéal car il contient des cellules immunitaires et épithéliales à coloration positive et négative et peut servir de tissu de contrôle positif et négatif pour la coloration avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay. Le tissu amygdalien coloré avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay affiche une coloration des lymphocytes et des macrophages situés dans les centres germinaux, avec des cellules immunitaires colorées pour PD-L1dispersées parmi les cellules PD-L1-négatives situées dans les régions interfolliculaires. En outre, une coloration membranaire diffuse est observée dans les cellules épithéliales cryptiques réticulées avec une absence de coloration des cellules épithéliales pavimenteuses superficielles. Le tissu amygdalien fixé dans du NBF à 10 % et traité de la même manière que les tissus du patient doit être qualifié et utilisé comme tissu de contrôle. Le tissu amygdalien de contrôle doit présenter une coloration acceptable pour qu’un essai soit jugé concluant. Si le tissu amygdalien ne présente pas une coloration acceptable, le test est considéré comme non valide et doit être répété en incluant des échantillons du patient. Les critères de qualification et d’acceptabilité applicables aux tissus amygdaliens de contrôle sont indiqués dans le Tableau 2. Tableau 2 : Critères de qualification et d’acceptabilité des tissus amygdaliens Acceptable Inacceptable Éléments tissulaires négatifs : cellules immunitaires négatives pour PD-L1 dans les régions interfolliculaires avec épithélium pavimenteux superficiel négatif. Coloration de fond non spécifique excessive gênant l’identification des cellules positives pour PD-L1. Éléments tissulaires positifs : coloration modérée à forte de PD-L1 observée dans les lymphocytes et les macrophages situés dans les centres germinaux, avec coloration diffuse dans les cellules d’épithélium réticulé des cryptes. Coloration inexistante à faible du PD-L1 observée dans les lymphocytes et dans les macrophages situés dans les centres germinaux ainsi que dans les cellules d’épithélium réticulé des cryptes. PD-L1 20X PD-L1 4X Épithélium pavimenteux superficiel Coloration de fond non spécifique PD-L1 20X PD-L1 20X Épithélium cryptique Faible coloration dans les lymphocytes, les macrophages et les cellules épithéliales Région interfolliculaire Centre germinal VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 6 Caractéristiques de la coloration - Carcinome urothélial L’utilisation du test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay sur des tissus de carcinome urothélial pour immunomarquer PD-L1 génère une coloration des IC (Figures 4 à 7) et des TC. Les images de ce guide d’interprétation sont des clichés de lames numérisées. L’agrandissement utilisé est indiqué pour chaque image. Coloration des IC : Les IC sont les cellules immunitaires présentes dans le stroma intratumoral et dans le stroma péritumoral contigu. La coloration avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay met en évidence une population hétérogène de cellules immunitaires. La majorité de ces cellules est morphologiquement similaire aux lymphocytes, aux macrophages, aux cellules dendritiques et aux granulocytes. H&E 20X PD-L1 20X Stroma intratumoral avec coloration punctiforme des IC Figure 4 : Les IC présentent souvent une coloration punctiforme ou linéaire marron foncé qui constitue le profil de coloration des IC prédominant dans la majorité des tissus. La coloration des IC est souvent observée sous forme d’agrégats présents soit dans le stroma intratumoral, soit dans le stroma péritumoral (marge invasive), soit aux deux emplacements. 7 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial PD-L1 20X H&E 20X IC diffusées sous forme de cellules isolées H&E 10X PD-L1 10X Diffusion des IC sous forme de cellules isolées en association avec des agrégats Figure 5 : Une coloration des IC peut parfois également être observée sous forme de cellules isolées à répartition focale ou diffuse ou de petits agrégats dispersés (diffusion de cellules isolées) parmi les cellules tumorales. Ce profil peut être observé en association avec des agrégats dans le stroma tumoral. La coloration des IC correspond aux cellules immunitaires situées parmi les cellules tumorales dans l’image H&E. H&E 40X PD-L1 40X Coloration circonférentielle des IC Figure 6 : Parfois, une coloration membranaire circonférentielle de cellules immunitaires est également observée, notamment sur des cellules morphologiquement similaires aux macrophages et/ou aux cellules dendritiques. VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 8 H&E 20X PD-L1 20X Neutrophiles Figure 7 : Dans de rares cas, une coloration des IC peut être observée dans les neutrophiles sous forme de coloration punctiforme fine couplée à une coloration granulaire diffuse. La coloration des neutrophiles peut être dispersée parmi les cellules tumorales, dans le stroma intratumoral ou péritumoral, ou sous forme d’agrégats. Différentiation de la coloration des IC et de la coloration des TC : Une coloration des IC peut être observée en association avec une coloration des TC. La lame colorée de PD-L1 ne servira qu’à évaluer les IC ; il est donc essentiel de distinguer la coloration des IC de la coloration des TC. Un examen de la lame H&E correspondante aidera à distinguer les IC des TC. Associé à un examen sous fort H&E 20X grossissement de la lame colorée de PD-L1, cet examen peut aider à distinguer la coloration des IC de la coloration des TC. Les images suivantes représentent différents profils couramment observés dans la pratique clinique, lorsque la coloration des IC et des TC sont observées simultanément (Figures 8 à 10). Forte coloration des TC PD-L1 20X Agrégat d’IC dans le stroma Figure 8 : Les TC présentent une forte coloration membranaire, avec de rares IC identifiables parmi les TC sur la lame H&E ; se concentrer sur l’évaluation de la coloration des IC dans le stroma intratumoral et dans le stroma péritumoral contigu. 9 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial H&E 20X PD-L1 20X IC diffusées sous forme de cellules isolées Nombreuses IC parmi les TC sur la coloration H&E Coloration faible à modérée des TC Figure 9: Les TC présentent une coloration membranaire faible à modérée avec de nombreuses IC identifiables parmi les TC sur la lame H&E ; se concentrer sur l’évaluation des IC présentes parmi les cellules tumorales et dans le stroma. H&E 20X PD-L1 20X Coloration granulaire des TC H&E 20X PD-L1 20X Coloration granulaire des TC TC apoptotiques Figure 10 : Si la lame H&E ne présente que peu d’IC identifiables et qu’un profil de coloration granulaire ou perlé est observé parmi les TC, alors cette coloration doit être attribuée aux TC plutôt qu’aux IC. VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 10 Méthode d’évaluation Le tissu de carcinome urothélial coloré avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay ne sera utilisé que pour évaluer la coloration des IC. Évaluation des IC : les IC sont évaluées en fonction du pourcentage de la zone tumorale occupé par des cellules immunitaires présentant une coloration de PD-L1, quelle qu’en soit l’intensité. Toute coloration des IC, quel que soit le type de cellules ou leur emplacement, est incluse. • Zone tumorale : la zone tumorale pour l’interprétation du test PD-L1 (SP142) est définie comme la surface occupée par des cellules tumorales viables, le stroma intratumoral associé et le stroma péritumoral contigu associés (Figure 11A, échantillon prélevé par résection : Figures 11B et 11C, TURBT : Figure 11D et 11E). Les tumeurs nécrotiques sont exclues de cette définition de la zone tumorale (Figure 11F). • Dans les échantillons de tissu fragmentés, y compris les résections transurétrales de tumeurs de vessie (TURBT) et les biopsies, où la distinction entre le stroma intratumoral et le stroma péritumoral est difficile, seul le stroma contigu aux différents foyers tumoraux est inclus dans la définition de la zone tumorale ; le stroma qui fait partie du fragment de tissu, mais qui n’est pas contigu à une tumeur viable, en est exclus (Figures 11B et 11C). A H&E 4X B Zone tumorale C Zone tumorale H&E 1X Zone tumorale Stroma intratumoral PD-L1 1X Cellules tumorales Stroma péritumoral contigu D H&E 1X E PD-L1 1X B Zone tumorale Zone tumorale F H&E 1X XXXX Nécrose - exclue de la zone tumorale Figure 11 : A Zone tumorale ; B et C Zone tumorale dans un échantillon prélevé par résection ; D et E Zone tumorale dans un échantillon de résection transurétrale de tumeur de la vessie (TURBT) ; F Zone tumorale dans un échantillon présentant une nécrose. 11 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial Évaluation de la coloration de PD-L1 d’agrégats d’IC : H&E 2X Examiner la lame colorée par H&E afin d’y déceler la présence d’une tumeur, d’une nécrose, de déterminer l’adéquation de l’échantillon (au moins 50 cellules tumorales viables avec le stroma associé) et d’évaluer de la zone tumorale. Seule une coloration des IC est observée PD-L1 10X Examiner la lame colorée pour PDL1 sous un agrandissement de 10x ou 20x et confirmer que le profil de coloration global correspond aux IC, aux TC ou aux deux. PD-L1 2X Zone tumorale Entourer visuellement les agrégats d’IC aussi précisément que possible sous un agrandissement de 2x ou 4x. Agrégats d’IC Combiner la coloration des agrégats et estimer le pourcentage de la zone tumorale occupé par les agrégats d’IC en utilisant un agrandissement de 2x ou 4x. Le résultat de l’évaluation des IC pour ce cas est ≥ 5 %. Les images de référence de la section Images de référence doivent être utilisées comme aide à l’évaluation. VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial PD-L1 2X 12 Évaluation de la coloration de cellules isolées de PD-L1 IC : Les IC présentes sous forme de cellules isolées sont évaluées sur la base de la densité de la diffusion sous forme de cellules isolées, en utilisant les images de référence fournies dans ce guide. PD-L1 10X La densité cellulaire des IC diffusées sous forme de cellules isolées est < 5 % 13 PD-L1 10X La densité cellulaire des IC diffusées sous forme de cellules isolées est ≥ 5 % VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial Méthodes d’évaluation : difficultés et écueils 1. Zone tumorale dans un carcinome urothélial papillaire : dans les échantillons contenant un carcinome urothélial papillaire, le stroma dans les axes fibrovasculaires est considéré comme étant le stroma intratumoral. La lamina propria à la base de la lésion papillaire peut contenir des agrégats lymphoïdes qui présentent une coloration de PD‑L1. Seule la coloration contiguë à la base de la tumeur est considérée comme faisant partie de la zone tumorale (Figure 12). H&E 4X PD-L1 4X Agrégats lymphoïdes dans la lamina propria Agrégats lymphoïdes dans la lamina propria Zone tumorale Zone tumorale Figure 12 : En cas de carcinome urothélial papillaire, les agrégats lymphoïdes présents dans la lamina propria sont exclus de l’évaluation des IC. 2. Cellules immunitaires intravasculaires : le système vasculaire du stroma tumoral peut présenter des cellules immunitaires positives pour PD-L1 (Figure 13). On observe ceci le plus souvent dans les axes fibrovasculaires du carcinome urothélial papillaire. Elles ne doivent pas être prises en compte pour l’évaluation des IC. H&E 10X PD-L1 10X Coloration des IC intravasculaires exclue de l’évaluation des IC Figure 13 : Coloration des cellules immunitaires intravasculaires : cellules exclues de l’évaluation des IC. VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 14 3. Coloration sur les granulomes : certains tissus de carcinome urothélial peuvent présenter des granulomes probablement dus à l’effet du traitement. Une coloration de PD‑L1 peut être observée sur les macrophages et les cellules géantes de ces granulomes et peut être confondue avec une coloration des cellules tumorales (Figure 14). Un examen de la lame H&E correspondante facilitera l’identification de la coloration des cellules immunitaires. Si ces granulomes sont présents dans la zone tumorale, ils doivent être inclus dans l’évaluation des IC. H&E 10X PD-L1 10X Coloration sur un granulome situé à l’intérieur de la zone tumorale Figure 14 : Coloration sur un granulome : envisager de l’inclure dans l’évaluation des IC s’il se trouve à l’intérieur de la zone tumorale 4. Coloration sur des débris nécrotiques : les débris nécrotiques ou les cellules immunitaires situées en périphérie des régions nécrotiques ou apoptotiques peuvent présenter une coloration de PD-L1. Cette coloration peut être granulaire et être confondue avec la coloration des IC. Cette coloration, ainsi que la coloration observée sur des agrégats de neutrophiles, doivent être exclues de l’évaluation (Figure 15). H&E 20X PD-L1 20X Coloration dans les débris nécrotiques Figure 15 : Débris nécrotiques présentant une coloration de PD-L1. Ils ne doivent pas être inclus dans l’évaluation des IC. Noter la présence d’une coloration des TC, qui n’est pas évaluée. 15 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 5. Métastase au niveau d’un ganglion lymphatique : le VENTANA PD-L1 (SP142) Assay peut être utilisé pour tester des échantillons primaires et des échantillons métastatiques. Les échantillons métastatiques peuvent provenir de différents organes, parmi lesquels les ganglions lymphatiques, le foie, la glande surrénale, les os et les tissus mous. Les métastases osseuses ne conviennent pas pour la coloration avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay. Les métastases des ganglions lymphatiques méritent une attention particulière, compte tenu de la présence de cellules immunitaires natives qui présentent une coloration de PD-L1. Dans les tumeurs qui se sont métastasées dans les ganglions lymphatiques, seule la coloration des infiltrats de cellules immunitaires contiguë aux cellules tumorales doit être prise en compte pour déterminer le pourcentage d’IC présentant une coloration de PD-L1 (Figure 16). H&E 2X PD-L1 2X H&E 10X PD-L1 10X Figure 16 : A et B : Ganglion lymphatique avec métastases aux contours bien délimités. C et D : Ganglion lymphatique avec multiples petits foyers de cellules tumorales. La zone tumorale est contournée sur les images H&E et PD-L1. VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 16 Images de référence Test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay : évaluation des IC Toutes les images sont grossies 10x IC diffusées sous forme de cellules isolées Agrégats d’IC IC < 5 % IC ≥ 5 % Tableau 3 : Caractéristiques des cellules immunitaires (IC) infiltrant la tumeur Types de cellules présentant une coloration Lymphocytes, macrophages, cellules dendritiques et granulocytes Types de cellules inclus dans l’évaluation Lymphocytes, macrophages, cellules dendritiques et granulocytes Profil Agrégats dans le stroma, cellules isolées parmi des cellules tumorales avec coloration punctiforme, linéaire ou circonférentielle Dénominateur pour l’évaluation Zone tumorale 17 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial Test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay : IC < 5 % H&E 1X PD-L1 1X A B B A PD-L1 4X A B PD-L1 4X Cas 1 : Le résultat de ce cas est un niveau d’expression de PD-L1 de IC < 5 %. Score : IC : < 1 % ; TC : 0 %. Sous un faible grossissement, ce cas présente plusieurs régions présentant une coloration marron. Examinée sous un fort grossissement, la majeure partie de la coloration marron semble due à des produits réactionnels (colorants) piégés sous le tissu replié (piégeage de colorants). Il est important de faire la distinction entre un piégeage de colorant (Région A) et une coloration spécifique des IC (Région B). VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 18 PD-L1 1X H&E 1X A A A PD-L1 2X A PD-L1 4X A PD-L1 10X Cas 2 : Le résultat de ce cas est un niveau d’expression de PD-L1 de IC < 5 %. Scores : IC : 1 % ; TC : 0 %. Noter la présence d’une coloration de PD-L1 dans les IC sur des foyers d’IC isolées, qui, une fois normalisée à l’intégralité de la zone tumorale, est < 5 %. 19 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial H&E 1X A A PD-L1 4X A A PD-L1 1X PD-L1 10X Cas 3 : Le résultat de ce cas est un niveau d’expression de PD-L1 de IC < 5 %. Scores : IC 3 % ; TC : 0 %. Il s’agit d’un carcinome urothélial papillaire présentant plusieurs agrégats lymphoïdes dans la lamina propria. Seuls les agrégats lymphoïdes contigus à la base de la tumeur sont inclus pour l’évaluation des IC. VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 20 Test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay : IC ≥ 5 % PD-L1 1X H&E 1X A A B A B PD-L1 4X B PD-L1 10X B PD-L1 20X Cas 4 : Le résultat de ce cas est un niveau d’expression de PD-L1 de IC ≥ 5 %. Scores : IC : 10 % ; TC : 90 %. Ce cas illustre une coloration des IC ainsi qu’une coloration des TC. Sous faible grossissement, il est difficile de distinguer ces 2 types de cellules. En revanche, examinée sous un fort grossissement (10x), la coloration punctiforme des IC se distingue clairement de la coloration circonférentielle des TC. Ce cas illustre l’importance d’un examen sous fort grossissement afin de distinguer la coloration des infiltrats de cellules immunitaires de la coloration des cellules tumorales. 21 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial H&E 1X A A A PD-L1 4X B PD-L1 1X PD-L1 10X B Cas 5 : Le résultat de ce cas est un niveau d’expression de PD-L1 de IC ≥ 5 %. Scores : IC : 5 % ; TC : 0 %. Noter la présence d’une coloration sur un agrégat d’IC. VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 22 H&E 1X PD-L1 1X A A A PD-L1 4X A PD-L1 10X Cas 6 : Le résultat de ce cas est un niveau d’expression de PD-L1 de IC ≥ 5 %. Scores : IC : 20 % ; TC : 0 %. Noter la présence d’agrégats d’IC ainsi que de foyers de cellules isolées. 23 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial Cas difficiles H&E 1X C B A A PD-L1 10X PD-L1 1X C B B PD-L1 10X C A PD-L1 10X Cas 7 : Le résultat de ce cas est un niveau d’expression de PD-L1 de IC < 5 %. Scores : IC : 3 % ; TC : 5 %. Noter la présence d’une coloration granulaire des TC ainsi que d’une coloration punctiforme des IC. Noter également la distribution focale de la coloration des TC et des IC. Sous un fort grossissement, la Région A présente une prédominance de la coloration des TC. La Région B, quant à elle, présente une coloration des IC et une coloration des TC équivalentes. La Région C présente une coloration faible des deux types cellulaires. Observée sous un faible grossissement, la coloration des IC se concentre sur un bord de la tumeur (Régions A et B). Le résultat de ce cas est < 5 % (IC : 3 %). Ce cas illustre l’importance d’un examen sous fort grossissement afin de distinguer la coloration des IC et la coloration des TC, ainsi que l’hétérogénéité de la coloration. VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 24 H&E 0.5X PD-L1 0.5X A A B B A PD-L1 4X Zone tumorale A PD-L1 10X Zone tumorale B PD-L1 4X Zone tumorale Cas 8 : Le résultat de ce cas est un niveau d’expression de PD-L1 de IC < 5 %. Scores : IC : 2 % ; TC : 0 %. Noter la présence d’un carcinome urothélial papillaire dans un échantillon prélevé par résection transurétrale de tumeur de la vessie (TURBT). On voit clairement dans les Régions A et B des agrégats lymphoïdes dans la lamina propria qui ne sont pas contigus à la tumeur et peuvent être inclus par erreur dans l’évaluation des IC. La ligne définit le contour de la zone tumorale. 25 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial Artefacts de coloration Les artéfacts signalés dans cette section peuvent être observés sur les lames colorées avec le Negative Reagent Control et sur les lames colorées avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay. La présence de ces artéfacts peut nécessiter la répétition de la coloration s’ils interfèrent avec l’interprétation de la coloration avec le VENTANA PD-L1 (SP142) Assay. Toujours examiner la lame Negative Reagent Control correspondante afin de vérifier que la coloration de fond non spécifique se situe dans les limites acceptables. PD-L1 2X PD-L1 2X Taches non colorées Taches non colorées : les taches non colorées sont des zones faiblement ou non colorées généralement circulaires dues à une bulle statique qui s’est formée pendant la procédure de coloration. L’image de gauche représente un exemple d’une tache non colorée comparée à la coloration appropriée représentée sur l’image de droite. Si la tache non colorée interfère avec l’interprétation de la lame colorée pour PD-L1, un nouveau cycle de coloration peut être nécessaire. PD-L1 20X NRC 20x Mouchetage Coloration spécifique de PD-L1 dans les IC Mouchetage : le mouchetage, représenté sur l’image de gauche, est une coloration non spécifique faible à modérée, qui apparaît sous la forme d’un précipité granulaire fin réparti uniformément et qui se forme le plus souvent dans le cytoplasme. Le mouchetage n’est pas conforme aux caractéristiques de coloration des IC ou des TC. Cet artéfact ne doit pas être confondu avec une coloration spécifique telle que représentée sur l’image de droite. VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 26 PD-L1 20X PD-L1 20X Taches de DAB : les taches de DAB sont des taches circulaires qui peuvent se former en raison de DAB piégée sous la coupe tissulaire pendant la procédure de coloration. Si cet artéfact interfère avec l’interprétation de la lame colorée pour PD-L1, répéter la coloration avec des lames non colorées fraîches. Sur l’image de droite, la tache de DAB n’est pas présente sur la nouvelle coloration réalisée sur une coupe sériée. NRC 10X NRC 10X Débris luminaux : le tissu amygdalien coloré à l’aide du VENTANA PD-L1 (SP142) Assay peut servir à la fois de tissu de contrôle positif et négatif en raison de la présence d’éléments positifs et négatifs pour la coloration. Une coloration luminale due à une réactivité croisée avec un antigène inconnu peut être observée sur l’image de tissu amygdalien coloré avec le NRC à gauche. Un exemple approprié de tissu amygdalien coloré avec le NRC est représenté à droite. Si vous choisissez d’utiliser le NRC sur un tissu de contrôle amygdalien et que des débris luminaux sont observés, l’échantillon ne devrait pas être utilisé comme tissu de contrôle. 27 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial NRC 10X PD-L1 10X Points de DAB Coloration spécifique de PD-L1 dans les IC Points de DAB : une coloration de fond punctiforme non spécifique peut être observée sur du tissu de n’importe quel échantillon. Il s’agit de petits artéfacts de colorations aléatoires générés par le processus d’amplification du système de détection. Par rapport à la coloration de PD-L1 des IC, les points de DAB sont plus petits et présentent une morphologie différente et plus nette que la coloration punctiforme des IC. La coloration attendue des cellules immunitaires est visible sur l’image de droite. NRC 4X PD-L1 4X Bruit de fond sérique Coloration spécifique de PD-L1 dans les IC Bruit de fond sérique : le bruit de fond sérique est une coloration non spécifique qui se produit dans les espaces vasculaires et dans les extravasations de sérum. Ce bruit de fond peut être observé en bas de chacune des images ci-dessus. Il ne doit pas être confondu avec une coloration spécifique de PD-L1 sur les IC comme illustrée sur l’image de droite. VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 28 Impact des conditions pré-analytiques sur le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay Conditions de fixation acceptables pour obtenir des résultats de coloration optimaux avec le test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay • Ventana recommande d’effectuer la fixation pendant 6 à 72 heures dans du NBF à 10 %. • Le formol zinc permet d’obtenir une coloration comparable à celle obtenue avec le NBF à 10 %. • La fixation pendant moins de 6 heures n’est pas recommandée. • Les échantillons fixés avec du Z-5 présentent une coloration non comparable à celle obtenue avec les échantillons fixés avec du NBF à 10 %. La fixation au Z-5 n’est pas recommandée. • Le PREFER (Anatech, Ltd.) et les fixateurs à l’alcool, y compris l’AFA (coloration plus faible) ne sont pas recommandés. Tableau 4 : Coloration avec le VENTANA PD-L1 (SP142) Assay d’un tissu amygdalien avec différents fixateurs et pendant différents temps de fixation Temps de fixation (en heures) Fixateur NBF à 10 % Formol zinc Z-5* PREFER* (Anatech, Ltd.) AFA* Alcool à 95 %* 1* 6 12 24 72 Recommandé *Non recommandé 29 (toutes les images sont grossies 20x) VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial Stabilité de l’antigène sur des coupes de tissu Les coupes de carcinome urothélial (lames non colorées) doivent être colorées dans les 3 mois qui suivent la coupe et les tissus amygdaliens humains doivent être colorés dans les 2 mois qui suivent la coupe. Passé ce délai, les coupes de tissu (lames non colorées) conservées à température ambiante présentent une perte de coloration importante (Figure 18). A PD-L1 4X Jour 0 B PD-L1 4X Après 3 mois Figure 18 : Coupes sériées de tissu de carcinome urothélial colorées lors du jour 0 (A) et après trois mois de conservation à température ambiante (B). VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 30 Références 1. Chalasani V, Chin JL, Izawa JI. Histologic variants of urothelial bladder cancer and nonurothelial histology in bladder cancer. Can Urol Assoc J. 2009;3(6 Suppl 4):S193-198. 2. Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, et al. GLOBOCAN 2012 v1.0. Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. http://globocan.iarc.fr. Published 2013-12-12. Updated 2014-01-09. Accessed 2014-02-02. 3. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2015. Atlanta: American Cancer Society; 2015. 4. Howlader N, Noone AM, Krapcho M, et al. (eds). SEER Cancer Statistics Review (CSR),1975-2012. National Cancer Institute. http://seer.cancer.gov/csr/1975_2012/. Published 2015-04-23. Updated 2015-11-18. Accessed 2016-02-22. 5. Blank C, Mackensen A. Contribution of the PD-L1/PD-1 pathway to T-cell exhaustion: an update on implications for chronic infections and tumor evasion. Cancer Immunol Immunother. 2007;56(5):739-745. 6. Butte MJ, Keir ME, Phamduy TB, et al. Programmed death-1 ligand 1 interacts specifically with the B7-1 costimulatory molecule to inhibit T cell responses. Immunity. 2007;27(1):111-122. 7. Herbst RS, Soria JC, Kowanetz M, et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 2014;515(7528):563-567. 8. Bellmunt J, Mullane SA, Werner L, et al. Association of PD-L1 expression on tumor-infiltrating mononuclear cells and overall survival in patients with urothelial carcinoma. Ann Oncol. 2015;26(4):812-817. 9. Brahmer JR, Drake CG, Wollner I, et al. Phase I study of singleagent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. 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Lancet. 2016;387(10031):1909–20. 31 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial VENTANA PD-L1 (SP142) Assay - Guide d’interprétation pour le carcinome urothélial 32 Consulter la notice du test VENTANA PD-L1 (SP142) Assay correspondant pour connaître les coordonnées du fabricant. www.ventana.com © 2020 Ventana Medical Systems, Inc. et Roche Diagnostics International, Inc. Tous droits réservés. VENTANA et le logo VENTANA sont des marques commerciales de Roche. Toutes les autres marques de commerce appartiennent à leurs détenteurs respectifs. 1015704FR Rev D 2020-07-29 ">
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