Informations générales
L’épissage d’ADN, l'excision et l’encollage des molécules d’ADN sont l’un des outils de base de la biotechnologie moderne. Le concept de base derrière l’épissage d’ADN est de retirer un fragment d’ADN fonctionnel — disons un gène — d’un organisme et de le combiner avec l’ADN d’un autre organisme afin d’étudier le fonctionnement du gène. Le résultat désiré de l’épissage du gène est que l’organisme récepteur porte les instructions génétiques fournies par le gène nouvellement acquis.
Par exemple, certaines plantes peuvent recevoir les gènes permettant de résister à des parasites ou à des maladies et, dans quelques rares cas à ce jour, des gènes fonctionnels sont donnés à des personnes dont les gènes ne sont pas fonctionnels, c'est le cas, par exemple, pour les personnes atteintes d'une maladie génétique du type mucoviscidose.
Cette activité peut être utilisée pour simuler l’application en monde réel de l'épissage. Vous pouvez suggérer à vos élèves que l’ADN avec lequel ils travaillent représente un chromosome qui a
été coupé en de nombreux fragments. Un de ces fragments produits pourra représenter un gène spécifique. Ce gène imaginaire peut coder pour un nombre quelconque de caractères mais, avant qu’il ait pu être donné à un organisme bénéficiaire, vos élèves doivent commencer par identifier le gène par sa taille en utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose.
Enzymes de restriction
L’aptitude à exciser, encoller ou séparer – abouter les éléments fonctionnels d’ADN de manière prévisible et avec précision est ce qui permet aux biotechnologistes de recombiner les molécules d’ADN. C’est ce que l’on appelle la technologie d’ADN recombiné. La première étape de l’épissage d’ADN consiste à localiser un gène spécifique d’intérêt du chromosome. On utilise ensuite une enzyme de restriction pour découper le gène ciblé du reste des chromosomes. Cette même enzyme est également utilisée pour couper l’ADN du bénéficiaire dans lequel le fragment sera inséré.
Les enzymes de restriction sont des protéines qui coupent l’ADN en des sites spécifiques. Les enzymes de restriction, également connues sous le nom d'endonucléases de restriction, reconnaissent les séquences spécifiques de paires de bases d’ADN et coupent ou séparent chimiquement l’ADN au niveau des arrangements spécifiques de paires de bases. Elles ont tout d’abord été identifiées et isolées sur des bactéries qui les utilisent en tant que mécanisme de défense naturelle pour couper l’ADN intrus des bactériophages — virus qui infectent les bactéries. Tout ADN
étranger rencontrant une enzyme de restriction sera digéré ou coupé en de nombreux fragments, et rendu inefficace. Ces enzymes dans les bactéries constituent le premier système immunitaire biologique. Il y a des milliers d’enzymes de restriction, chacune est appelée d’après le nom de la bactérie dont elle est isolée. Par exemple :
EcoRI = la première enzyme de restriction isolée de la bactérie Escherichia coli
HindIII = la troisième enzyme de restriction isolée de la bactérie Haemophilus influenzae
PstI = la première enzyme de restriction isolée de la bactérie Providencia stuartii.
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Chaque enzyme de restriction reconnaît une séquence nucléotidique spécifique dans l’ADN, appelée un site de restriction et coupe la molécule d’ADN uniquement à cette séquence spécifique.
De nombreuses enzymes de restriction laissent une courte longueur de bases non appariées, appelée une extrémité « adhésive », sur le site d’ADN où elles coupent, alors que deux enzymes de restriction peuvent effectuer une coupure sur les deux brins créant des fragments d’ADN à double brins avec des extrémités « franches ». En général, les sites de restriction sont palindromiques, ce qui signifie que la séquence des bases se lit de la même façon dans les deux sens, de droite à gauche et de gauche à droite sur le brin d’ADN opposé.
Par exemple, on trouvera ci-dessous une liste des enzymes et des sites où ils sont coupés :
ADN du phage Lambda
L’ADN lambda est l’ADN génomique d’un virus bactérien ou bactériophage (phage) qui attaque les bactéries en insérant son acide nucléique dans la cellule bactérienne hôte. Lambda est un phage qui se réplique rapidement à l’intérieur de la cellule hôte jusqu’à ce que la cellule explose et libère plus de phages pour réaliser le même processus d’infection dans d’autres cellules hôtes bactériennes. Le lambda bactériophage est inoffensif pour l’homme et d’autres organismes eukaryotes et, par conséquent, en fait une excellente source d’ADN pour l’étude expérimentale.
Dans ce TP, les élèves observent les effets de trois enzymes de restriction sur l’ADN lambda.
Étant donné que le génome lambda est composé d’environ 48 000 paires de bases, chaque enzyme de restriction coupera plusieurs fois l’ADN et générera les fragments de restriction de différentes tailles. Dans cette activité, trois échantillons séparés d’ADN lambda seront coupés en utilisant trois enzymes de restriction différentes et un échantillon restera non digéré. Chaque échantillon produit des fragments d’ADN dont ont peut estimer les tailles lorsqu'ils sont passés sur un gel d’agarose en utilisant l’électrophorèse.
Head
Tail
Fiber
Base pairs
Tête
Queue
Fibre
Paires de base
Integration into bacterial chromosome chromosome bactérien
Early gene expression
DNA synthesis
Late gene expression
Lysis of bacterialhost intégration dans le
Expression précoce du gène
Synthèse d’ADN
Expression tardive du gène
Lyse de l’hôte bactérien
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Fig 1. Représentation schématique du bactériophage
lambda. Le bactériophage lambda contient principalement une tête qui contient l’ADN génomique et une queue qui est impliquée dans l'attachement du phage sur les cellules bactériennes (A). L’ADN génomique Lambda contient plusieurs clusters de gènes importants (Ausebel et al., 1998).
Les flèches désignent les sites où l’enzyme de restriction
HindIII coupe l’ADN et les chiffres indiquent le nombre de bases de chaque fragment (B).
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Analyse électrophorétique des fragments de restriction
Une enzyme de restriction agit à l’instar de ciseaux moléculaires, effectuant des coupures au niveau de la séquence de paires de bases qu’elle reconnaît. La structure tridimensionnelle ou la forme d’une enzyme de restriction lui permet de s’intégrer parfaitement dans le sillon formé par les deux brins d’une molécule d’ADN. Lorsque qu’elle est attachée à l’ADN, l’enzyme glisse le long de la double hélice jusqu’à ce qu’elle reconnaisse une séquence spécifique de paires de bases qui indique
à l’enzyme qu’elle doit arrêter de glisser. L’enzyme sépare ensuite chimiquement ou coupe la molécule d’ADN sur le site - appelé le site de restriction.
Si un site de restriction intervient dans plusieurs emplacements d’une molécule d’ADN, une enzyme de restriction effectue une coupure à chacun de ces sites, ce qui donne plusieurs fragments d’ADN. Par conséquent, si un morceau donné d’ADN linéaire est coupé avec une enzyme de restriction dont la séquence de reconnaissance spécifique est trouvée en cinq emplacements différents sur la molécule d’ADN, on obtiendra six fragments de longueurs différentes. La longueur de chacun des fragments dépend de l’emplacement des sites de restriction sur la molécule d’ADN.
Un fragment d’ADN qui a été coupé avec les enzymes de restriction peut être séparé en utilisant un processus connu sous la désignation d'« électrophorèse sur gel d’agarose ».
Electrophorèse signifie transporté par l'électricité. L’électrophorèse sur gel d’agarose sépare les fragments d’ADN par taille. Les fragments d’ADN sont déposés sur un gel d’agarose qui est placé dans une chambre remplie d’une solution tampon conductrice. Un courant continu est passé entre les
électrodes à chaque extrémité de la chambre. Les fragments d’ADN étant chargés négativement, ils seront attirés vers le pôle positif (anode) lorsqu’ils sont placés dans un champ électrique. La matrice de gel d’agarose agit comme un tamis moléculaire à travers lequel les fragments d’ADN plus petits peuvent se déplacer plus facilement que les fragments plus importants. Par conséquent, le taux auquel un fragment d’ADN migre à travers le gel est inversement proportionnel à sa dimension en paires de bases. Avec le temps, les fragments d’ADN plus petits, iront plus loin que les fragments d’ADN plus importants. Les fragments de la même taille restent ensemble et migrent en bandes simples d’ADN. Ces bandes se verront dans le gel une fois que l’ADN est coloré.
Une situation analogue est celle dans laquelle tous les bureaux et les chaises d’une salle de classe ont été rassemblés au hasard. Un élève isolé peut rapidement et assez facilement se faufiler dans ce labyrinthe alors qu’il faudra plus de temps à une chaîne de quatre élèves qui aura des difficultés à se frayer un chemin.
Rendre l’ADN visible
L’ADN est incolore, ainsi, on ne peut pas voir les fragments d’ADN dans le gel pendant l’électrophorèse. On ajoute à la solution d’ADN un tampon de charge contenant deux colorants bleus.
Le tampon de charge ne colore pas l’ADN lui-même mais facilite le chargement des gels et la surveillance de l’avancement de l’électrophorèse de l’ADN. Les fronts colorés migrent vers l’extrémité positive du gel à l’instar des fragments d’ADN. Le colorant « plus rapide » co-migre avec les fragments d’ADN d’environ 500 pb, alors que le colorant « plus lent » co-migre avec les fragments d’ADN d’une taille d'environ 5 kb. La coloration de l’ADN fait ressortir son emplacement sur le gel.
Lorsque le gel est immergé dans un colorant d’ADN Fast Blast, les molécules colorées s’attachent à l’ADN piégé dans le gel d’agarose. Lorsque les bandes sont visibles, vos élèves peuvent comparer les modèles de restriction ADN des différents échantillons d’ADN.
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La Figure 2 montre les profils de bandes qui seront obtenues par vos élèves à la suite de l’électrophorèse d’échantillons d’ADN qui ont été digérés en utilisant trois différentes enzymes de restriction. Par convention, les lignes sont numérotées à partir du haut à gauche. Il est à noter que chaque enzyme de restriction produit un profil de bandes unique sur chaque ligne. On peut déterminer la dimension relative des fragments dans chaque bande en mesurant de combien chaque bande s'est déplacée par rapport à son origine. Comme les dimensions des fragments sont connues pour le lambda digéré avec HindIII, cet échantillon fonctionnera en tant que marqueur standard ADN.
Fig. 2. Électrophorèse de l’ADN lambda digéré en utilisant trois enzymes de restriction différentes. Ligne 1, marqueurs
ADN ( Lambda digéré avec HindIII); ligne 2, ADN lambda non digéré; ligne 3, ADN lambda digéré avec PstI; ligne 4, ADN lambda digéré avec EcoRI; ligne 5, ADN lambda digéré avec HindIII.
Bibliographie
Ausubel FM et al., Current Protocols dans Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1998)
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