Préparation du professeur
Cette section décrit comment l'enseignant peut s'avancer. Ces procédures peuvent être mises en œuvre 1 ou 2 jours à l’avance par l’enseignant ou être effectuées par des groupes d'élèves au cours des travaux pratiques.
Leçon 1 : Enzymes de restriction : ciseaux moléculaires
Préparation
Objectifs
Distribuer les réactifs tels que les enzymes de restriction, les tampons et l’
ADN lambda (en option)
Couler les gels d’agarose*. Si vous préférez que vos élèves coulent leurs propres gels pendant les travaux pratiques, préparez l’agarose à l’avance. Si vous préparez à l’avance, l’agarose dissout doit être maintenue entre 55 et
60°C jusqu’à ce que le gel soit coulé. Préparer les postes de travail de l’élève et de l’enseignant.
Temps nécessaire
Trente minutes à 1 heure, en fonction de la manière que vous choisissez pour préparer les gels d’agarose.
Matériaux nécessaire Chambre d’électrophorèse, plateau et peignes
Tampons électrophorèse (TAE 1x)
Poudre d’agarose
Tampon de charge ADN.
Procédures
Chaque poste de travail aura besoin d’échantillons d’enzymes de restriction, d’ADN lambda et de tampon de restriction. Vous pouvez distribuer les tubes pour chaque poste de travail ou bien laisser les tubes de solution de base à l’avant de la classe pour que les groupes d’élèves aillent se servir.
1.
Distribuer les enzymes de restriction. Ajouter 5 µl de chaque enzyme dans huit microtubes, non fournis (total de 24 tubes). Étiqueter les tubes : HindIII, PstI, et EcoRI.
2.
3.
Remarque : les enzymes de restriction sont sensibles à la température et doivent, à tout
moment, être conservées dans de la glace. Stocker les enzymes au congélateur jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées. Le jour de la séance de travaux pratiques, placer les tubes sur de la glace et distribuer un tube à chaque équipe.
Distribuer le tampon de restriction. Ajouter 60 µl de tampon de restriction dans 8 microtubes bleus. Étiqueter les tubes « TR ». Placer les tubes sur de la glace et distribuer un tube à chaque équipe.
Distribuer l’ADN lambda. Ajouterr 25 µl d’ADN lambda dans 8 microtubes roses. Étiqueter les tubes « lambda ». Placer les tubes sur de la glace et distribuer un tube à chaque équipe.
4. Préparer les gels d’agarose. La concentration d’agarose recommandée pour les gels dans cette application de travaux pratiques est un agarose à 1%. Cette concentration d’agarose donne une bonne résolution et minimise le temps nécessaire pour obtenir la séparation
électrophorétique des fragments d’ADN. L’épaisseur recommandée du gel est de 0,75 à
1,0 cm pour faciliter le chargement d’échantillon et la manutention du gel. Pour préparer les
gels d’agarose, bien utiliser un tampon électrophorèse et non pas de l’eau.
* On peut se procurer auprès Bio-Rad des gels précoulés pratiques (référence catalogue
N°161-3057EDU). Il s’agit de gels TAE à 1% 2 x 8-puits, qui s’insèrent dans la cuve GT Mini-
Sub Cell de Bio-Rad ou sur tout système d'électrophorèse horizontal qui reçoit des gels de 7 x
10 cm.
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a. b.
Préparation du tampon électrophorèse. Le tampon électrophorèse TAE (Trisacétate-EDTA) est fourni sous forme de solution concentrée à 50x. En plus du tampon
TAE 1x nécessaire pour obtenir les gels d’agarose, il faut également environ 275 ml pour chaque chambre d’électrophorèse. Trois litres de tampon TAE 1x suffisent pour faire fonctionner huit chambres d’électrophorèse et préparer 8 gels d’agarose. Pour réaliser 3 l de TAE 1x à partir de concentré de TAE 50x, ajouter 60 ml de concentré
50x à 2,94 l d’eau distillée.
Préparation d’agarose. Ces procédures peuvent être mises en œuvre 1 à 2 jours à l’avance par le professeur ou pendant le cours par chaque groupe d’élèves.
i.
Pour obtenir une solution d’agarose à 1%, utiliser 1 gramme d’agarose pour chaque 100 ml de tampon électrophorèse TAE 1x. Bien vérifier que vous utilisez le tampon électrophorèse et non de l’eau.
Si les chambres d’électrophorèses vous limitent, vous pouvez utiliser un plateau de 7 x 10 cm et deux peignes 8-puits pour couler un gel qui peut être utilisé pour exécuter deux jeux de digestion.
Le tableau ci-dessous peut vous servir de guide pour les besoins de volume de gel lorsque vous coulez un ou plusieurs gels.
Volume d’agarose 1% pour : ii.
Nombre de gels Plateau 7 x 7 cm
1
2
4
40 ml
80 ml
160 ml
8 320 ml
Plateau 7 x 10 cm
50 ml
100 ml
200 ml
400 ml
Ajouter de la poudre d’agarose à un conteneur adapté (par ex., fiole d'Erlenmeyer de 500 ml pour 200 ml ou moins). Ajouter la quantité appropriée de tampon électrophorèse TAE 1x et agiter en tourbillon pour que la poudre d’agarose se trouve en suspension dans le tampon. Si vous utilisez une fiole d’Erlenmeyer, renverser une fiole d’Erlenmeyer de 25 ml dans l’extrémité ouverte de la fiole d’Erlenmeyer de 500 ml contenant l’agarose. La petite fiole agit en tant que chambre de reflux, permettant par conséquent une ébullition longue ou vigoureuse sans trop d'évaporation. Pour couler le gel, on peut faire fondre l’agarose par ébullition jusqu’à ce que ce dernier ait complètement fondu sur une plaque chauffante magnétique, un bainmarie ou dans un four à micro-ondes.
Attention : toujours porter des gants, des lunettes de protection et des blouses lors de la préparation et du coulage de gels d’agarose. De l’agarose fondu ou en ébullition ou des fioles contenant de l’agarose chaud peuvent provoquer des brûlures graves en cas de contact avec la peau.
Méthode du four à micro-ondes. Cette technique est la plus rapide et la plus sûre pour dissoudre l’agarose. Placer la solution de gel dans une bouteille ou une fiole appropriée dans le micro-ondes. DESSERRER LE BOUCHON SI VOUS UTILISEZ UNE BOUTEILLE.
Utiliser un réglage moyen et régler à 3 minutes. Arrêter le micro-ondes toutes les 30 secondes et agiter la fiole pour suspendre tout agarose non dissous. Porter à ébullition et agiter jusqu’à ce que toutes les petites particules d’agarose transparentes soient dissoutes. Mettre de côté et refroidir entrz 55 et 60°C avant de verser.
Méthode de la plaque chauffante magnétique. Ajouter un agitateur à la solution d’agarose non dissoute. Chauffer la solution jusqu’à ébullition tout en agitant sur une plaque chauffante magnétique. Faire retomber les bulles et la mousse avant qu’ils n’atteignent le col de la fiole. Faire bouillir la solution jusqu’à ce que toutes les petites particules transparentes d’agarose se soient dissoutes. Mettre de côté et refroidir entre 55 et 60°C avant de verser.
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c.
Procédure pour couler le gel
Cette activité de travaux pratiques exige que chaque gel ait au moins 4 puits. Suivre les instructions ci-dessous pour préparer l’agarose et déterminer quel volume d’agarose à 1% sera nécessaire pour vos classes. Verser suffisamment d’agarose pour couvrir les dents du peigne de gel ou pour atteindre une profondeur de 0,5 à 0,75 cm. Ne pas déplacer ni manipuler le plateau du gel tant que le gel n’est pas solidifié. Le gel solidifié peut être stocké en sachets scellables à température ambiante pendant un jour ou au réfrigérateur jusqu’à une semaine avant d’être utilisé. Les élèves doivent étiqueter leurs sachets en plastique. Il faut pour une classe entière environ 30 minutes pour couler les gels. Si possible, couler des gels supplémentaires à titre de secours. Cette section décrit une méthode pour couler les gels.
D’autres méthodes sont détaillées dans le manuel d’instruction de la cuve Sub-Cell
®
GT
(chambre d’électrophorèse).
i. ii. iii. iv. v.
Bien sceller les extrémités du plateau avec du scotch à autoclave standard
(pas de Scotch ou similaire). Appuyer fermement le scotch sur les extrémités du plateau pour former un joint étanche au fluide.
Mettre à niveau le plateau sur une table de mise à niveau ou sur une paillasse en utilisant un niveau à bulle fourni avec la chambre.
Préparer la concentration désirée et la quantité d’agarose dans le tampon
électrophorèse TAE 1x.
Refroidir l’agarose à au moins 60°C avant de couler.
Pendant que l’agarose refroidit à 60°C, placer le peigne dans la fente appropriée du plateau. Le peigne doit être placé à moins de 1/2 pouce de l’extrémité du plateau si on coule un seul puits de gel de 7 x 7 cm. Pour couler deux rangées de puits en utilisant un plateau de 7 x 10 cm et deux peignes de
8 puits, placer un peigne à l’une des extrémités du plateau et l’autre peigne au milieu du plateau. Les peignes formeront des puits dans lesquels les vi.
vii.
échantillons seront déposés.
Laisser le gel se solidifier à température ambiante pendant 10 à 20 minutes. Il aura un aspect blanchâtre ou opaque lorsqu’il sera prêt à être utilisé.
Retirer avec précaution le peigne du gel solidifié.
viii. Retirer le scotch des bords du plateau.
ix. Vous avez deux options :
Option un : si vous n’avez pas suffisamment de temps pour passer à la Leçon 2, stocker les gels dans un sachet en plastique scellable à température ambiante pendant 1 jour ou au réfrigérateur (4°C) pendant une semaine avant de les utiliser. Faites étiqueter les sachets en plastique par vos élèves.
Option deux : s’il y a suffisamment de temps pour passer à la Leçon 2, placer le plateau sur la chambre d’électrophorèse d’ADN mise à niveau, de sorte que les puits d’échantillons soient à l’extrémité noire (cathode) de la base. Au cours de l’électrophorèse, les
échantillons d’ADN migreront vers l’extrémité rouge (anode) de la chambre.
Digestion par enzymes de restriction. Une incubation de 30 minutes à 37°C est la condition optimale pour la digestion. Si l’on ne dispose pas d’un bloc de chauffe à 37°C, d’un bain-marie ou d’un incubateur, les échantillons peuvent être digérés en plaçant les tubes dans des portoirs en mousse en les faisant flotter dans un volume important d’eau (1 litre ou plus) portée à 37°C, et en les laissant incuber la nuit en laissant l'eau refroidir et revenir à la température ambiante.
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