Macherey-Nagel NucleoSpin gDNA Clean-up, Mini kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
Moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d’utilisation
Purification d’ADN génomique
n NucleoSpin® gDNA Clean-up
Septembre 2023 / Rev. 05
www.mn-net.com
www.mn-net.com
Purification d’ADN génomique
Résumé du protocole (Rev. 05)
NucleoSpin® gDNA Clean‑Up
150 μL d’échantillon
+ 450 μL DB
1 Ajustement des
conditions de
fixation des ADN
Vortexer 5 s
(Pour les plus petits volumes
d’échantillons, ajuster à 150 μL
avec de l’eau, pour les plus grands
volumes d’échantillons, augmenter
proportionnellement le tampon de fixation).
Charger l’échantillon sur la colonne
NucleoSpin® gDNA Clean-up
2 Fixation des ADN
11,000 x g
30 s
+ 700 μL DW
Vortex 2 s
1er lavage
11,000 x g
30 s
3 Lavage de la
membrane de silice
+ 700 μL DW
Vortex 2 s
2ème lavage
11,000 x g
30 s
11,000 x g
4 Séchage de la
membrane de silice
1 min
50 μL DE
RT
1 min
11,000 x g
30 s
5 Elution de l’ADN
(Optionnel: Répéter l’élution
avec le premier éluat ou 50 μL
supplémentaires de tampon DE frais.
Utiliser du tampon d’élution chauffé
à 70 °C peut favoriser l’élution)
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com
Purification d'ADN génomique
Sommaire
1 Composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, consommables et équipement nécessaires
4
1.3 À propos de ce manuel
4
2 Description
5
2.1 Principe général
5
2.2 Caractéristiques du kit
5
2.3 Élimination de l’ARN
6
2.4 Interprétation des valeurs de rendement et de pureté évaluées par
spectrophotométrie UV-VIS ?
6
3 Conditions de stockage et de préparation des réactifs
7
4 Instructions de sécurité
8
4.1 Élimination des déchets
8
5 Protocole NucleoSpin® gDNA Clean-Up
9
6 Annexes
11
6.1 Guide de resolution des problèmes
11
6.2 Informations de commande
11
6.3 Restrictions d'utilisation / ​garantie
12
MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05
3
Purification d'ADN génomique
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoSpin® gDNA Clean-up
10 preps
740230.10
50 preps
740230.50
250 preps
740230.250
Tampon de fixation DB
25 mL
25 mL
125 mL
Tampon de lavage DW (concentré)*
6 mL
25 mL
3 × 50 mL
Tampon d’élution DE**
13 mL
13 mL
30 mL
Colonnes NucleoSpin gDNA
Clean-up (bagues vertes)
10
50
250
Tubes collecteurs (2 mL)
10
50
250
Manuel d’utilisation
1
1
1
REF
®
1.2
Réactifs, consommables et équipement nécessaires
Réactifs
•
Ethanol 96 – 100 %
Consommables
•
Tubes à centrifuger 1,5 mL
•
Cônes de pipette jetables
Equipement
•
Pipettes manuelles
•
Centrifugeuse pour microtubes
•
Équipement de protection individuelle (par exemple : blouse de laboratoire, gants,
lunettes)
1.3
À propos de ce manuel
Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs du kit NucleoSpin® gDNA Clean-up de
lire les chapitres détaillés du protocole de ce manuel d’utilisation. Les utilisateurs expérimentés
peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Celui-ci est conçu pour être utilisé
uniquement comme un outil supplémentaire permettant un suivi rapide des différentes étapes
de la procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante :
www.mn-net.com.
* Pour la préparation des réactifs et leurs conditions de stockage, voir le chapitre 3.
** Composition du tampon d’élution DE : 5 mM Tris/HCl, pH 8.5
4
MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05
Purification d'ADN génomique
2
Description
2.1
Principe général
L’ADN génomique prépurifié, de poids moléculaire particulièrement élevé, et dissous dans
l’eau, dans le tampon d’élution ou tout autre tampon de réaction, est tout d’abord mélangé au
tampon de fixation DB, puis chargé sur une colonne NucleoSpin® gDNA Clean-up.
Les divers contaminants sont éliminés lors de deux étapes de lavage avec le tampon de lavage
DW.
Après une étape de séchage, l’ADN purifié et concentré peut être élué avec le tampon d’élution
DE (Tris/HCl 5 mM, pH 8,5).
2.2
Caractéristiques du kit
•
Le kit NucleoSpin® gDNA Clean-up est conçu pour la purification rapide de l’ADN
génomique de petit et surtout de haut poids moléculaire préalablement extrait. Il est
utilisé pour purifier et concentrer l’ADN génomique après des méthodes d’extraction
insuffisantes, par exemple à l’aide de Trizol, ou encore après des réactions enzymatiques
ou chimiques.
•
La procédure n’emploie pas de dénaturants organiques ou d’étapes d’extraction au
moyen de chloroforme.
•
Toutes les impuretés, telles que le phénol, les enzymes, les sels, les colorants, les
marqueurs, les nucléotides, les petits oligonucléotides et même les détergents en forte
concentration jusqu'à 5% (comme par exemple du SDS, Triton, Tween, Lauroylsarcosin)
sont complètement éliminées.
•
Le tampon de fixation DB et le tampon de lavage DW sont spécialement conçus pour
permettre la fixation et un lavage très doux afin de maximiser le rendement en ADN de
haut poids moléculaire et des fragments d’ADN plus petits (jusqu’à 100 pb).
•
L’ADN élué est prêt à être utilisé pour toutes les applications standard telles que la PCR,
la restriction par endonucléases, le Southern Blot et le marquage.
Table 1: Résumé des caractéristiques du kit
Paramètre
NucleoSpin® gDNA Clean-up
Volume type de l’échantillon
150 µL de solution d’ADN
Quantité d’ADN
< 25 µg
Rendement
80 – 90 %
Taille des fragments
100 bp – environ. 50 kbp
Capacité de fixation
50 µg
Volume d’élution
50 – 100 µL
Temps de préparations
< 15 min/10 preps
Format
Mini colonne à centrifuge
Utilisation
Pour la recherche uniquement (RUO)
MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05
5
Purification d'ADN génomique
2.3
Élimination de l’ARN
Les nucléotides et les petits oligonucléotides sont éliminés par l’utilisation de conditions
de fixation douces et des étapes de lavage rigoureuses. Pour éliminer complètement la
contamination de l’ADNg par de l’ARN, il est recommandé d’ajouter 1 µg de RNase A (voir
’Informations de commande’) à 150 µL d’échantillon d’ADNg et d’incuber à température
ambiante pendant 5 à 15 minutes.
2.4
Interprétation des valeurs de rendement et de pureté
évaluées par spectrophotométrie UV-VIS ?
La méthode la plus courante pour déterminer le rendement en ADN est la spectrophotométrie
UV-VIS. La concentration d’ADN dans l’éluat final peut être calculée à partir de son maximum
d’absorption à 260 nm (A₂₆₀), sachant qu’une absorption A₂₆₀ = 1 correspond à 50 µg/mL
d’ADN double brin. Toutefois, ce calcul suppose l’absence de tout autre composé absorbant
la lumière UV à 260 nm. Toute contamination par du phénol, de l’ARN, des protéines, des
détergents, etc. contribue de manière significative à l’absorption totale à 260 nm, ce qui conduit
à une surestimation de la concentration réelle d’ADN.
Rapport de pureté A₂₆₀/A₂₃₀
Pour évaluer la fiabilité du rendement déterminé à partir des lectures A₂₆₀, le rapport de
l’absorption à 260 nm et 230 nm peut être utilisé. Le rapport A₂₆₀/A₂₃₀ doit être supérieur à 2,0
pour l’ADN pur et est acceptable jusqu’à des rapports d’environ 1,5. Des valeurs inférieures ou
proches de 1,0 indiquent la présence d’importantes quantités d’impuretés et la concentration
réelle d’ADN est bien inférieure à sa valeur calculée à partir de la valeur A₂₆₀.
Rapport de pureté A₂₆₀/A₂₈₀
Un autre indicateur de la pureté de l’ADN est le rapport A₂₆₀/A₂₈₀, qui doit être compris entre
1,8 et 1,9. Les valeurs inférieures à 1,8 indiquent une contamination par les protéines, tandis
que les valeurs supérieures indiquent une contamination par l’ARN. Toutefois, ce rapport doit
être considéré avec prudence, car les contaminations conjointes par des protéines et de l’ARN
peuvent se compenser et aboutir à un rapport A₂₆₀/A₂₈₀ parfait.
Électrophorèse sur gel d’agarose
Idéalement, l’ADN se doit d’être analysé sur un gel d’agarose afin d’évaluer sa qualité en termes
de distribution de taille des fragments et pour vérifier la cohérence de la quantification UV-VIS,
en particulier si les ratios A₂₆₀/A₂₃₀ et A₂₆₀ / ​A₂₈₀ ne sont pas optimaux.
6
MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05
Purification d'ADN génomique
3
Conditions de stockage et de préparation des
réactifs
Attention : Le tampon DB contient du chlorhydrate de guanidine. Porter des gants et des
lunettes !
Conditions de stockage :
•
Tous les composants du kit doivent être conservés à une température comprise entre 15
et 25 °C et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette sur le kit. Le stockage à des températures
inférieures peut entraîner la précipitation des sels. En cas de précipitation, incuber le
flacon pendant plusieurs minutes à environ 30 – 40 °C et mélanger bien jusqu’à ce que le
précipité soit dissous.
Avant de commencer la procédure NucleoSpin® gDNA Clean-up, préparer les éléments
suivants :
•
Tampon de lavage DW : ajouter le volume indiqué d’éthanol (96 – 100 %) au tampon
DW concentré. Marquer l’étiquette du flacon pour indiquer que de l’éthanol a été ajouté.
Le tampon DW est stable à température ambiante (15 – 25 °C) pendant au moins un an.
NucleoSpin® gDNA Clean-up
REF
Tampon de lavage
DW (concentré)
10 preps
740230.10
50 preps
740230.50
250 preps
740230.250
6 mL
Ajouter 14 mL
d’éthanol
25 mL
Ajouter 60 mL
d’éthanol
3 × 50 mL
Ajouter 110 mL
d’éthanol dans
chaque bouteille
MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05
7
Purification d'ADN génomique
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec les kits NucleoSpin® gDNA Clean-up, portez des vêtements
de protection appropriés (par exemple, une blouse de laboratoire, des gants jetables et des
lunettes de protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité
(FDS disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds).
Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon DB peut former des composés très
réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, ne pas ajouter d’eau de
Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation d’échantillons.
Les déchets générés par le kit NucleoSpin® gDNA Clean-up n’ont pas été testés pour
détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides
par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du traitement fortement
dénaturant réalisé avec le tampon de lyse, mais elle ne peut être totalement exclue. Par
conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme potentiellement infectieux et
doivent être manipulés et éliminés conformément aux règles de sécurité locales
4.1
Élimination des déchets
Éliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sûre et conforme aux dispositions règlementaires locales.
8
MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05
NucleoSpin® gDNA Clean‑up
5
Protocole NucleoSpin® gDNA Clean-Up
Avant de débuter le protocole
Vérifier si le tampon de lavage DW a été préparé conformément au chapitre 3.
1
Créer les conditions de fixation de l’ADN
Ajouter 450 µL de tampon de fixation DB à 150 µL de
solution d’ADN à purifier.
Mélanger au vortex pendant 5 s.
Note : si le volume de l’échantillon est inférieur à 150 µL,
compléter avec de l’eau jusqu’à 150 µL. Si plus de 150 µL
d’échantillon doivent être traités, augmenter le Binding
Buffer DB proportionnellement. Plusieurs étapes de
chargement peuvent alors être nécessaires à l’étape 2.
2
150 µL
échantillon
+ 450 µL DB
Vortex 5 s
Fixer l’ADN
Placer une colonne NucleoSpin® gDNA Clean-up dans
un tube collecteur (2 mL).
Charger
l’échantillon
Charger jusqu’à 700 µL d’échantillon sur la colonne.
Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g.
Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur
3
11,000 x g
30 s
Laver la membrane de silice
+ 700 µL DW
1er lavage
Déposer 700 µL de tampon DW sur la colonne
NucleoSpin® gDNA-Clean-up.
Refermer puis vortexer la colonne pendant 2 s, puis
centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g.
Vortex 2 s
11,000 x g
30 s
Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur.
2ème lavage
Déposer 700 µL de tampon DW sur la colonne
NucleoSpin® gDNA-Clean-up.
+ 700 µL DW
Refermer puis vortexer la colonne pendant 2 s, puis
centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g.
Vortex 2 s
Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur.
11,000 x g
30 s
MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05
9
NucleoSpin® gDNA Clean‑up
4
Sécher la membrane de silice
Centrifuger pendant 1 minute à 11 000 x g et jeter le tube
collecteur.
11,000 x g
1 min
Note : des résidus de tampon de lavage contenant de
l’éthanol peuvent inhiber les réactions enzymatiques.
5
Eluer l’ADN
Placer la NucleoSpin® gDNA Clean-up dans un nouveau
tube 1,5 mL (non fourni).
+ 50 µL DE
RT
1 min
Déposer 50 µL de tampon DE sur la colonne.
Ne pas refermer la colonne et incuber pendant 1 minute
à température ambiante.
Refermer la colonne et centrifuger pendant 30 s à 11 000
x g.
Note : il est possible d’augmenter le rendement ADN en
procédant à une deuxième élution. Il faut soit réappliquer
le premier éluat sur la colonne, soit déposer 50 µL de
nouveau tampon d’élution DE.
L’augmentation de la température du tampon d’élution à
70 °C peut encore augmenter l’efficacité de l’élution.
10
MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05
11,000 x g
1 min
Purification d'ADN génomique
6
Annexes
6.1
Guide de resolution des problèmes
Problème
Cause possible et suggestions
Mauvaise utilisation ou préparation des réactifs
Rendement d’ADN
faible ou nul
•
Toujours distribuer exactement les volumes de tampon
indiqués dans le protocole !
•
Toujours suivre scrupuleusement les instructions données
en ce qui concerne l’ordre et le mode de mélange (agitation,
vortex, etc.).
•
Ajouter le volume indiqué d’éthanol (96 – 100 %) au tampon
de lavage DW concentré et mélanger soigneusement (voir
chapitre 5 pour plus d’informations).
•
Garder les flacons bien fermés afin d’éviter l’évaporation ou la
contamination des solutions.
Contamination par de l’éthanol ou des sels
Performance
insuffisante de l’ADN
dans les applications
ultérieures
6.2
•
Veiller à sécher complètement la membrane de silice de la
colonne NucleoSpin® gDNA Clean-up avant l’élution afin
d’éviter la contamination par de l’éthanol provenant du
tampon DW.
•
Vérifier que le tampon DW a été équilibré à la température
ambiante avant utilisation. Le lavage à des températures plus
basses diminue l’efficacité de l’élimination des sels.
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
®
740230.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250 preps
®
NucleoSpin gDNA Clean-up XS
740904.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250 preps
RNase A (lyophilisée)
740505.50
740505
50 mg
100 mg
Tubes collecteurs (2 mL)
740600
1000
NucleoSpin gDNA Clean-Up
Visitez le site www.mn-net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit.
MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05
11
Purification d'ADN génomique
6.3
Restrictions d'utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne
font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société.
MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez
contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur
les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour
obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la
documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
Veuillez contacter :
MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Tel. : +49 24 21 969‑333
[email protected]
12
MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05
Plasmid DNA
Clean up
RNA
DNA
Viral RNA and DNA
Protein
High throughput
Accessories
Auxiliary tools
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FR +33 388 68 22 68 [email protected]
US +1 888 321 62 24 [email protected]
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