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MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
Manuel
d’utilisation
User manual
Purification de l’ADN plasmidique
n NucleoBond® Xtra Midi
n NucleoBond® Xtra Maxi
n NucleoBond® Xtra Midi Plus
n NucleoBond® Xtra Maxi Plus
Juin 2022 / Rev. 17
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Purification de l’ADN plasmidique
Sommaire
1 Composition
4
1.1 Composants des kits
4
1.2 Réactifs et équipement nécessaires
6
2 Caractéristiques des kits
7
3 A propos de ce manuel d’utilisation
8
4 Système de purification NucleoBond® Xtra
10
4.1 Principe général
10
4.2 Colonnes échangeuses d’anions NucleoBond® Xtra
10
4.3 Croissance des cultures bactériennes
11
4.4 Amplification des plasmides low copy au moyen de chloramphénicol
13
4.5 Volume de culture pour les plasmides high copy
13
4.6 Volume de culture pour les plasmides low copy
14
4.7 Neutralisation du lysat et intérêt du réactif LyseControl
15
4.8 Lyse des cellules
15
4.9 Souches difficiles à lyser
16
®
4.10 Mise en place des colonnes NucleoBond Xtra
16
4.11 Filtration et chargement du lysat
17
4.12 Lavage de la colonne
18
4.13 Elution et concentration de l’ADN plasmidique
18
4.14 Détermination du rendement et de la qualité de l’ADN
21
4.15 Etapes de pause possible
22
5 Conditions de stockage et préparation des réactifs
22
6 Instructions de sécurité
23
®
7 Purification de l’ADN plasmidique avec NucleoBond Xtra
24
7.1 Purification de plasmides High copy (Midi, Maxi)
24
7.2 Purification de plasmides Low copy (Midi, Maxi)
29
7.3 Concentration des éluats NucleoBond® Xtra avec les NucleoBond® Finalizers
32
8 Annexes
34
8.1 Guide de résolution des problèmes
34
8.2 Informations de commande
42
8.3 Restriction d’utilisation / garantie
43
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
3
Purification de l’ADN plasmidique
1
Composition
1.1
Composants des kits
NucleoBond® Xtra
Midi
NucleoBond® Xtra
Midi Plus
Référence
10 preps
740410.10
50 preps
740410.50
100 preps
740410.100
10 preps
740412.10
50 preps
740412.50
Tampon RES
100 mL
500 mL
1000 mL
100 mL
500 mL
Tampon LYS
100 mL
500 mL
1000 mL
100 mL
500 mL
Tampon NEU
100 mL
500 mL
1000 mL
100 mL
500 mL
Tampon EQU
200 mL
1000 mL
2 x 1000 mL
200 mL
1000 mL
Tampon WASH
100 mL
500 mL
1000 mL
100 mL
500 mL
Tampon ELU
60 mL
300 mL
600 mL
60 mL
300 mL
RNase A*
(lyophilisée)
6 mg
30 mg
60 mg
6 mg
30 mg
Colonnes
NucleoBond®
Xtra Midi et filtres
NucleoBond® Xtra
Midi
10
50
100
10
50
NucleoBond®
Finalizers
-
-
-
10
50
Seringues 30 mL
-
-
-
10
50
Seringues 1 mL
-
-
-
10
50
Tampon TRIS
-
-
-
13 mL
60 mL
Adaptateurs
en plastique
(réutilisables)
5
10
10
5
10
Manuel d’utilisation
1
1
1
1
1
* Pour la préparation des réactifs et leurs conditions de stockage, voir le chapitre 5.
4
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
1.1
Composants des kits suite
NucleoBond® Xtra
Maxi
NucleoBond® Xtra
Maxi Plus
Référence
10 preps
740414.10
50 preps
740414.50
100 preps
740414.100
10 preps
740416.10
50 preps
740416.50
Tampon RES
150 mL
750 mL
2 x 750 mL
150 mL
750 mL
Tampon LYS
150 mL
750 mL
2 x 750 mL
150 mL
750 mL
Tampon NEU
150 mL
750 mL
2 x 750 mL
150 mL
750 mL
Tampon EQU
500 mL
2 x 1000 mL
500 mL
5 x 1000 mL
500 mL
2 x 1000 mL
500 mL
Tampon WASH
300 mL
1000 mL
500 mL
3 x 1000 mL
300 mL
1000 mL
500 mL
Tampon ELU
180 mL
900 mL
2 x 900 mL
180 mL
900 mL
RNase A*
(lyophilisée)
10 mg
50 mg
2 x 50 mg
10 mg
50 mg
Colonnes
NucleoBond®
Xtra Maxi
et filtres
NucleoBond®
Xtra Maxi
10
50
100
10
50
NucleoBond®
Finalizers Large
-
-
-
10
50
Seringues 30 mL
-
-
-
10
50
Seringues 1 mL
-
-
-
10
50
Tampon TRIS
-
-
-
13 mL
60 mL
Adaptateurs
en plastique
(réutilisables)
5
10
10
5
10
Manuel
d’utilisation
1
1
1
1
1
* Pour la préparation des réactifs et leurs conditions de stockage, voir le chapitre 5.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
5
Purification de l’ADN plasmidique
1.2
Réactifs et équipement nécessaires
Réactifs
•
Isopropanol (à température ambiante)
•
70 % ethanol (à température ambiante)
•
Tampon pour la solubilisation finale de l’ADN purifié, par exemple du tampon TE ou de
l’H2O stérile (inutile avec les kits NucleoBond® Xtra Midi /Maxi Plus)
Equipement
Equipement standard de microbiologie pour la culture et la collecte des bactérie (exemple :
boucle d’inoculation, tubes et Erlens de culture, incubateur agitant à 37°C, centrifugeuse
munie d’un rotor pour tubes ou flacons permettant de culotter les cellules).
•
Centrifugeuse réfrigérée capable d’atteindre ≥ 4,500 x g et munie d’un rotor compatible
avec les tubes ou flacons utilisés (inutile avec les kits NucleoBond® Xtra Midi / Maxi
Plus)
•
Tubes ou contenants appropriés pour les volumes utilisés dans les différents
protocoles.
•
Portoir pour colonnes ‘NucleoBond® Xtra Combi Rack’ (‘Voir Informations de
commandes’) ou support équivalent.
6
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
2
Caractéristiques des kits
•
Les kits NucleoBond® Xtra sont conçus pour la purification ultra rapide de plasmides,
cosmides, et de très grands vecteurs (constructions P1, BACs, PACs) d’une taille
allant de 3 kpb jusqu’à 300 kpb. Pour la préparation des réactifs et leurs conditions de
stockage, voir le chapitre 5.
•
Les colonnes NucleoBond® Xtra sont en polypropylène et contiennent une résine
de silice NucleoBond® Xtra conditionnée entre deux filtres inertes. Les colonnes sont
disponibles en format Midi et Maxi, pour des rendements moyens respectifs de l’ordre
de 500 μg et 1000 μg.
•
Toutes les colonnes NucleoBond® Xtra sont résistantes aux solvants organiques
comme les alcools, le chloroforme, le phénol et sont aussi compatibles avec les
tampons contenant des agents dénaturants comme le formamide, l’urée, ou des
détergents courants comme le Triton X-100 ou le NP-40.
•
La résine de silice NucleoBond® Xtra est utilisable dans une vaste gamme de pH
(pH 2.5 – 8.5), et peut rester en contact des tampons pendant plusieurs heures sans
variation de ses propriétés chromatographiques.
•
Les filtres de la colonne NucleoBond® Xtra sont des filtres larges spécialement
conçus pour s’insérer dans les colonnes NucleoBond® Xtra . Les filtres sont fournis
déjà placés dans les colonnes NucleoBond® Xtra et permettent un gain de temps
en rendant concomitantes les étapes de clarification et de chargement du lysat sur la
résine des colonnes NucleoBond® Xtra. Par ailleurs, l’utilisation des colonnes filtres
évite une fastidieuse étape de centrifugation pour la clarification du lysat.
•
Les filtres de la colonne NucleoBond® Xtra permettent l’élimination totale des
précipités, même en cas d’utilisation d’un volume important de lysat, sans colmatage et
sans endommagé l’ADN des vecteurs de grande taille comme les PACs ou BACs grâce
à une filtration douce permise par le filtre.
•
Les kits NucleoBond® Xtra Midi Plus et NucleoBond® Xtra Maxi Plus contiennent
de surcroit, respectivement, les NucleoBond® Finalizers et NucleoBond® Finalizers
Large. Ces outils sont conçus pour le dessalage et la concentration rapides des éluats
et sont compatibles avec la plupart des plasmides et cosmides de 2 – 50 kpb avec un
rendement de 40 – 90 % (dépendant du volume d’élution utilisé).
•
NucleoBond® Finalizer est un filtre seringue en polypropylène contenant une
membrane de silice spéciale. Le NucleoBond® Finalizer possède une capacité de
fixation de 500 μg, tandis que le NucleoBond® Finalizer Large peut permettre de
récupérer jusqu’à 2000 µg d’ADN plasmidique.
•
Grâce aux faibles volumes mort des filtres NucleoBond® Finalizers l’ADN plasmidique
peut être élué avec une concentration allant jusqu’à 3 µg/µL (voir paragraphe 4.13,
Tableau 4 et 5 pour des détails concernant l’impact du volume d’élution sur la
concentration).
•
Tous les NucleoBond® Finalizers sont résistants aux solvants organiques comme les
alcools, le chloroforme, le phénol et sont exempts d’endotoxines.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
7
Purification de l’ADN plasmidique
3
A propos de ce manuel d’utilisation
Le chapitre 4 correspond à la description détaillée du système de purification
NucleoBond® Xtra et contient des informations importantes, relatives à la croissance
bactérienne, la lyse cellulaire et les différentes étapes de la procédure de purification. Les
chapitres 5 et 6 mentionnent les conditions de stockage des réactifs, les instructions pour
leur préparation et les recommandations en terme de sécurité.
Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs de lire ces chapitres attentivement
avant l’utilisation du kit. Les utilisateurs expérimentés pourront, quant à eux, utiliser
directement le protocole de purification (chapitre 7) ou encore le résumé du protocole pour
un suivi rapide de l’enchaînement des différentes étapes de la procédure.
Le chapitre 7 comprend les protocoles pour la purification des plasmides high copy et low
copy, ainsi que la procédure pour concentrer les éluats des colonnes NucleoBond® Xtra
avec les NucleoBond® Finalizer. Cette partie du protocole est également disponible en
anglais sur notre site web www.mn-net.com.
Chaque étape de la procédure de purification est présentée selon l’exemple, ci-dessous,
issu du paragraphe 7.1 :
Midi
Maxi
5
Lyse cellulaire (Tampon LYS)
!
Vérifier l’absence de précipité SDS dans le tampon LYS avant utilisation. Si
un précipité blanc est visible, réchauffer le tampon pendant plusieurs minutes à
30 – 40 °C jusqu’à sa complète dissolution. Laisser le tampon revenir à température
ambiante avant utilisation (15 – 25 °C).
Ajouter le tampon LYS à la suspension.
Mélanger doucement en retournant le tube 5 fois. Ne pas vortexer, au risque de
fragmenter et de contaminer la suspension par de l’ADN chromosomique contenu
dans les débris cellulaires.
Incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.
Attention : l’exposition prolongée à des conditions alcalines peut dénaturer et
dégrader de manière irréversible l’ADN plasmidique ainsi que libérer de l’ADN
chromosomique dans le lysat.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de tampon LYS si une masse
cellulaire supérieure aux recommandations est utilisée (voir paragraphe 4.8 pour
des informations détaillées sur les conditions optimales de lyse cellulaire).
8 mL
12 mL
Si vous effectuez une Midi prep pour purifier de l’ADN plasmidique, vous trouverez les
volumes de tampon ou durée d’incubation dans les cadres blancs. Pour une Maxi prep, merci
de suivre les indications mentionnées dans les cadres noirs.
8
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
Le nom du tampon, les durées d’incubation, les répétitions ou toutes autres étapes
importantes de la procédure sont soulignés par l’utilisation de caractères gras. Les
notes complémentaires ou les étapes optionnelles apparaissent en italiques. Les points
d’exclamation indiquent des informations et conseils essentiels pour réussir l’extraction.
Dans l’exemple, ci-dessus, il vous est demandé de vérifier le tampon de lyse LYS avant
utilisation, puis de lyser le culot de cellules dans 8 mL de tampon LYS pour la Midi prep
et dans 12 mL pour la Maxi prep. Suivez scrupuleusement les instructions et prenez
connaissances des conseils mentionnés concernant les adaptations du protocole.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
9
Purification de l’ADN plasmidique
4
Système de purification NucleoBond® Xtra
4.1
Principe général
Les cellules bactériennes sont lysées à l’aide d’une combinaison optimisée de tampons
nouvellement conçus et basés sur la méthode de lyse NaOH / SDS de Birnboim et Doly*.
Après équilibration de la colonne NucleoBond® Xtra et du filtre NucleoBond® Xtra, la
totalité du lysat est déposée sur le filtre et clarifié par gravité. Parallèlement, le chargement
de la résine de silice de la colonne débute.
L’ADN plasmidique est fixé à la résine de silice NucleoBond® Xtra.
Après une procédure de lavage efficace, l’ADN plasmidique est finalement élué, précipité,
dessalé et dissout dans un tampon adéquat (ex : tampon faiblement salin ou eau) et prêt à
l’emploi pour les applications ultérieures.
!
4.2
Les colonnes NucleoBond® Xtra ne sont pas compatibles avec les systèmes
d’aspiration. L’utilisation des colonnes NucleoBond® Xtra sur une chambre à
vide peut induire une perte totale de l’ADN plasmidique.
Colonnes échangeuses d’anions NucleoBond® Xtra
NucleoBond® Xtra est une résine de silice échangeuse d’anions brevetée, développée
par MACHEREY-NAGEL. Elle est dédiée à la purification des différentes classes d’acides
nucléiques comme les oligonucléotides, l’ARN et les plasmides.
La résine de silice NucleoBond® Xtra est constituée de billes de silice macroporeuses,
hydrophiles, fonctionnalisées avec le groupement MAE (méthyl-amino-éthanol). La densité
élevée de ces groupes fonctionnels procure une charge positive globale de densité élevée
dans des conditions de pH acide permettant aux groupements phosphate de l’ADN
plasmidique, chargés négativement, de se fixer avec une grande spécificité (Figure 1).
CH 3
Si
spacer
échangeuse d’anion
groupement MAE
NH
O
OH
CH 2
lia
is
on
O
O
P
O
Squelette d’ADN
O
Figure 1 Interaction ionique entre le groupe fonctionnel méthyl-hydroxyéthyl-amino
chargé positivement et les groupements phosphate oxygène chargés
négativement du squelette de l’ADN.
Contrairement au groupe DEAE (diéthylaminoéthyl) couramment utilisé, le groupe
hydroxyl du méthyl-hydroxyéthyl-amino peut être impliqué dans des interactions
supplémentaires, de type liaison hydrogène de l’ADN.
* Birnboim, H. C. and Doly, J., (1979) Nucl. Acids Res. 7, 1513–1523
10
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
Tous les contaminants, comme les protéines et les ARNs, sont lavés et éliminés de
la colonne. La charge positive de la résine est neutralisée par un passage du pH à des
conditions légèrement alcalines et l’ADN plasmidique pur est élué en présence d’un tampon
fortement concentré en sel.
Les acides nucléiques purifiés peuvent être utilisés pour des applications de biologie
moléculaire les plus exigeantes, comme la transfection, la transcription in vitro, le séquençage
automatique ou manuel, le clonage, l’hybridation et la PCR.
Classe des composés
ADN plasmidique;
constructions de grande taille
ADN simple brin,
ADN double brin
ARNm, ARNr 16S/23S
ARNr 5S
ARNt
ARNt
Absorbance à 260 nm
ARNr
ADN plasmidique,
constructions de
grande taille
Protéines, marquages,
polysaccharides, métabolites,
trinucléotides
0
0.5
1
1.5
2
Concentration en sel pour l’élution [M (KCl)]
Figure 2 Profil d’élution de la résine de silice NucleoBond® Xtra à pH 7.0
Plus le nombre d’interactions entre le squelette d’un acide nucléique et la résine
chargée positivement est élevé, plus l’élution est tardive avec des concentrations
en sel croissant. Les acides nucléiques de grande taille sont porteurs de plus de
charges négatives que les plus petits fragments ainsi que l’ADN double brin plus
que l’ARN simple brin.
4.3
Croissance des cultures bactériennes
Le rendement et la qualité de l’ADN plasmidique dépend fortement du type de milieu de
culture et des antibiotiques utilisés, de la souche bactérienne, du type de plasmide, de sa
taille et du nombre de copies par cellules mais aussi des conditions de culture.
Pour des plasmides high copy standards, le milieu LB (Luria-Bertani) est recommandé. La
culture bactérienne doit être incubé à 37°C sous agitation constante (200-250 rpm), de
préférence pendant 12-16 h (une nuit). Utiliser des Erlens d’un volume au moins trois ou
quatre fois supérieur au volume de la culture pour obtenir un milieu de culture saturé en
oxygène. De plus, des milieux riches comme le 2 xYT (Yeast / Tryptone), le TB (Terrific Broth)
ou le milieu CircleGrow peuvent être utilisés. Dans ce cas, les bactéries se multiplient plus
vite, la phase stationnaire est atteinte plus rapidement que dans le milieu LB (≤ 2 h) et
une masse cellulaire plus importante peut être obtenue. Cependant, ceci n’implique pas
forcément un rendement d’ADN plasmidique plus élevé. Une culture dont la croissance a
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
11
Purification de l’ADN plasmidique
été excessivement prolongée peut contenir une plus grande proportion de cellules mortes
ou mourantes, et l’ADN plasmidique résultant peut être partiellement dégradé ou contaminé
avec de l’ADN chromosomique. Pour déterminer les conditions de culture optimales, le
milieu et la durée d’incubation doivent être adaptés pour chaque combinaison souche
bactérienne / plasmide.
Les cultures doivent être soumises à une pression de sélection constante grâce à un
antibiotique pour garantir la propagation des plasmides. Sans cette pression de sélection,
les cellules tendent à perdre leur plasmide pendant la division cellulaire. Les bactéries,
sans cette charge de plasmides high copy, ont une croissance plus rapide et envahissent la
culture impliquant un rendement en ADN plasmidique faible et indépendant de la croissance
cellulaire. Le Tableau 1 donne des informations sur les concentrations d’antibiotiques
couramment utilisées.
Tableau 1: Informations à propos des antibiotiques selon Maniatis*
Antibiotique
Solution stock
(concentration)
Stockage
Concentration
utile
Ampicilline
50 mg/mL in H2O
-20 °C
20 – 60 µg/mL
Chloramphénicol
34 mg/mL in EtOH
-20 °C
25 – 170 µg/mL
Kanamycine
10 mg/mL in H2O
-20 °C
10 – 50 µg/mL
Streptomycine
10 mg/mL in H2O
-20 °C
10 – 50 µg/mL
Tétracycline
5 mg/mL in EtOH
-20 °C
10 – 50 µg/mL
Carbénicilline
50 mg/mL in H2O
-20 °C
20 – 60 µg/mL
La souche de E. coli influence grandement la qualité de l’ADN plasmidique, les souches
comme DH5α® ou XL1-Blue produisent habituellement des plasmides surenroulés de
haute qualité. D’autres souches, comme par exemple HB101, avec un contenu élevé en
endonucléases, peuvent induire une qualité moindre de l’ADN plasmidique et donc impacter
les performances pour les réactions ultérieures comme les restrictions enzymatiques ou le
séquençage.
Le type de plasmide, en particulier en termes de taille et d’origine de réplication (ori)
a une importance cruciale sur le rendement en ADN. En général, plus le plasmide ou son
insert est grand, moins le rendement attendu est important en raison d’un nombre de copie
par cellule généralement plus faible. Même un plasmide high copy basé sur une ori ColE1
peut se comporter comme un vecteur low copy s’il contient un insert de grande taille ou
défavorable. De plus, l’ori elle-même influence le rendement d’un facteur 10 – 100. Ainsi,
les plasmides basés sur par exemple pBR322 ou pACYC, les cosmides ou les BACs sont
maintenus à un nombre de copie par cellule < 20 et même parfois réduit à 1 copie, tandis que
les vecteurs basés sur le pUC, pBluescript ou pGEM peuvent être représentés par plusieurs
centaines de copies par cellule.
* Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J : Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring,
New York 1982.
12
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
Par conséquent, tous les facteurs mentionnés, ci-dessus, doivent être considérés, en
particulier si un objectif de rendement d’ADN est fixé. Le volume de culture et la procédure
de lyse doivent être ajustés conjointement.
4.4
Amplification des plasmides low copy au moyen de
chloramphénicol
Pour accroître drastiquement le nombre de copie par cellule pour les plasmides low copy
dérivés de pMB1 / colE1, cultiver les cellules jusqu’au milieu ou jusqu’à la fin de la phase
logarithmique (OD600 ≈ 0.6 – 2.0) sous pression sélective avec l’antibiotique approprié.
Ajouter ensuite 170 µg/mL de chloramphénicol et poursuivre l’incubation pendant encore
8 – 12 heures. Le chloramphénicol inhibe la synthèse des protéines de l’hôte et empêche
ainsi la réplication du chromosome de l’hôte. La réplication des plasmides, cependant, est
indépendante des protéines néo-synthétisées et se poursuit pendant plusieurs heures et ils
s’accumulent jusqu’à atteindre 2000 – 3000 copies par cellule*.
Alternativement, la culture bactérienne peut être soumise à une inhibition partielle de
la synthèse des protéines en utilisant de faibles concentrations (10 – 20 µg/mL) de
chloramphénicol, induisant une augmentation du rendement ADN d’un facteur 5 – 10 **.
Les deux méthodes ont l’avantage d’augmenter la quantité de plasmides par rapport à la
quantité d’ADN génomique, mais ne fonctionnent évidemment qu’avec les plasmides ne
portant pas de gène de résistance au chloramphénicol. De plus, la méthode n’est efficace
que pour des plasmides low copy soumis à un contrôle rigoureux (ex : pBR322). Tous les
plasmides récents high copy (ex : pUC) sont déjà sous contrôle relâché en raison de mutations
dans les gènes de contrôle du nombre de copie et donc le traitement chloramphénicol
n’améliore pas significativement le nombre de copies par cellule.
4.5
Volume de culture pour les plasmides high copy
En raison de l’influence des milieux de culture (TB, CircleGrow, 2 xYT), les conditions de
croissance (agitation, température), la souche bactérienne, le type de plasmide et d’insert
etc… la quantité finale de cellules dans les cultures bactériennes peut grandement varier.
En règle générale, une culture de E.coli avec un litre de LB et une DO600 de 1 contient
1 x 1012 cellules et correspond à une masse de culot frais 1.5 – 1.8 g. Les cultures overnight
en milieu LB, en Erlens vigoureusement agitées, atteignent en général une DO600 de 3 – 6.
Les cultures en fermenteur peuvent même atteindre une DO600 de 10 et plus. Le rendement
d’ADN attendu pour un plasmide high copy est d’environ 1 mg par gramme de culot bactérien
frais.
Il est donc important d’ajuster la quantité de masse cellulaire plutôt que le volume de
culture pour optimiser les résultats des purifications. Mais, tandis que la masse de cellules
ou de culot cellulaire est fastidieuse à mesurer, cette valeur est remplacée dans ce manuel
par le produit mathématique de la densité optique à 600 nm (DO600) et du volume de culture
(Vol) – deux variables beaucoup plus aisées à mesurer.
*Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J : Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring,
New York 1982.
**Frenkel L, Bremer H : Increased amplification of plasmids pBR322 and pBR327 by low concentrations of
chloramphenicol, DNA (5), 539 – 544, 1986.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
13
Purification de l’ADN plasmidique
DOV = DO600 x Vol [ mL ]
Noter que pour une détermination correcte de la DO des cultures bactériennes, les
échantillons doivent être dilués si la DO600 excède 0,5 afin que la mesure soit dans la zone
linéaire où la DO600 croît proportionnellement à la masse cellulaire. Pour une culture correcte
de E.coli, une dilution au 1 :10 dans du milieu de culture est recommandé. La DO600 mesuré
est ensuite multipliée par le facteur de dilution (c'est-à-dire 10 dans notre cas) pour obtenir la
valeur théorique DO600. Cette valeur est utilisée dans le Tableau 2 pour déterminer le volume
de culture le plus approprié. Le Tableau 2 mentionne les valeurs de DOV et les couples de
valeurs DO600 / volume de culture correspondants et pouvant être facilement mis en œuvre
avec le protocole et les volumes de réactifs de lyse standards. Par exemple, pour une DO600
de 6 de culture d’E. coli, utiliser 66 mL de culture bactérienne pour une Midi prep ou 200 mL
de cette même culture pour une Maxi prep.
Tableau 2: Volumes de culture recommandés pour des plasmides high copy
NucleoBond®
Xtra
Masse
de culot
frais
DOV
rec.
DO600 =
DO600 =
DO600 =
DO600 =
DO600 =
2
4
6
8
10
Midi
0.75 g
400
200 mL
100 mL
66 mL
50 mL
40 mL
Maxi
2.25 g
1200
600 mL
300 mL
200 mL
150 mL
120 mL
4.6
Volume de culture pour les plasmides low copy
Les kits NucleoBond® Xtra sont conçus pour l’extraction de plasmides high copy (parfois
plusieurs centaines de copies/cellule) ainsi que pour les plasmides low copy (< 20 copies /
cellule). Cependant, lors de la purification de plasmides low copy, la masse cellulaire et les
volumes de tampons de lyse doivent être augmentés, au moins doublés pour produire assez
d’ADN afin d’utiliser la capacité de fixation des colonnes. Le Tableau 3 présente les valeurs
DOV et les couples DO600 / volume de culture correspondant pour les cultures de bactéries
dédiées à la purification de plasmides low copy (pour des informations détaillées sur le calcul
DOV = DO600 x Vol., voir le paragraphe 4.5). Par exemple, pour une DO600 de 6, collecter
133 mL de culture bactérienne pour une Midi prep et 400 mL pour une Maxi prep.
Tableau 3: Volumes de culture recommandés pour les plasmides low copy
NucleoBond®
Xtra
Masse
de culot
frais
DOV
rec.
DO600 =
DO600 =
DO600 =
DO600 =
DO600 =
2
4
6
8
10
Midi
1.5 g
800
400 mL
200 mL
133 mL
100 mL
80 mL
Maxi
4.5 g
2400
1200 mL
600 mL
400 mL
300 mL
240 mL
Pour optimiser les rendements, il est possible d’augmenter le volume de culture et des
tampons de lyse (par exemple d’un facteur 3 – 5). Dans ce cas, des tampons de lyse
supplémentaires peuvent être commandés séparément (voir ‘Informations de commande’).
De plus, la clarification du lysat peut nécessiter une étape de centrifugation plutôt que
14
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
l’utilisation des filtres NucleoBond® Xtra seules, leur capacité volumique pour recevoir le
précipité étant limitée.
Noter que l’amplification au moyen du chloramphénicol peut être envisagée pour augmenter
le nombre de copies de plasmides par cellule (voir paragraphe 4.4).
4.7
Neutralisation du lysat et intérêt du réactif LyseControl
Un mélange complet du lysat avec le tampon de neutralisation NEU est d’une importance
primordiale pour une précipitation totale du SDS, des protéines et de l’ADN génomique.
Une neutralisation incomplète induit des rendements plus faibles, un écoulement gravitaire
ralenti et un colmatage possible du filtre NucleoBond® Xtra. Cependant, l’ADN plasmidique,
en solution à cette étape, est très vulnérable et une agitation excessive ou trop violente
endommagerait l’ADN.
Par conséquent, ne pas vortexer ou agiter mais retourner le mélange très doucement
jusqu’à la formation d’un précipité floconneux blanchâtre et d’une décoloration totale du
réactif LyseControl, sans aucune trace résiduelle de bleu.
4.8
Lyse des cellules
Les bactéries sous forme de culot sont resuspendues dans le tampon RES et lysées lors
d’un traitement NaOH/SDS avec le tampon LYS. Dans ces conditions, les protéines ainsi
que l’ADN chromosomique et plasmidique sont dénaturées. L’ARN est dégradé par la RNase
A préalablement ajoutée au tampon RES. Le tampon de neutralisation NEU, contenant de
l’acétate de potassium, est ensuite ajouté au lysat, provoquant la précipitation du SDS sous
forme de KDS (dodécyl sulfate de potassium), entraînant les protéines, l’ADN chromosomique
et autres débris cellulaires. Le tampon contenant l’acétate de potassium neutralise également
les conditions alcalines suite à l’addition de solution NaOH et contribue à la renaturation de
l’ADN plasmidique sous sa forme native surenroulée tout en le conservant en solution.
Les volumes de tampons NucleoBond® Xtra (selon le protocole standard) sont ajustés
pour permettre la lyse optimale des volumes de culture recommandés pour les plasmides
high copy selon les recommandations du paragraphe 4.5, Tableau 2. Utiliser une quantité
de cellules trop importante peut impacter de manière négative l’efficacité de la lyse, de
la précipitation, induire une diminution du rendement et de la pureté. Par conséquent, les
volumes de tampons de lyse doivent être adaptés lors de l’utilisation de volumes de culture
supérieurs, par exemple, lors de la purification de vecteurs low copy (voir paragraphe 4.6,
Tableau 3).
En règle générale, calculer les volumes de réactifs de lyse RES, LYS et NEU nécessaires
de la manière suivante :
Vol. [ mL ] = Volume de culture [ mL ] x OD600 / ​50
Par exemple, pour un culot bactérien de 200 mL, issu d’une culture de DO600=4 et destinée à
la purification de plasmides low copy, les volumes adéquats de tampons RES, LYS, et NEU
sont de 16 mL pour chacun. Si des tampons de lyse supplémentaires sont nécessaires, un
set de tampons complémentaires incluant les tampons RES, LYS, NEU et la RNase A peut
être commandé séparément (voir ‘Informations de commande’).
En utilisant des volumes adéquats de tampons de lyse, la durée de lyse peut être limitée
à 3 – 4 minutes et ne doit pas excéder 5 minutes. Une exposition prolongée aux conditions
alcalines peut dénaturer et dégrader irréversiblement l’ADN plasmidique et conduire au
relargage d’ADN chromosomique dans le lysat.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
15
Purification de l’ADN plasmidique
Noter que les volumes de lyse calculer pour les préparations NucleoBond® Xtra Maxi ne
correspondent pas aux volumes recommandés dans le protocole du fait que la majorité
des utilisateurs débute la préparation avec une quantité de cellules très inférieure à la
valeur DOV 1200 recommandée. De plus, les 3 x 12 mL du protocole standard permettent
l’utilisation très pratique des tubes 50 mL. L’utilisation de plus de tampon de lyse nécessite
généralement de diviser l’échantillon.
4.9
Souches difficiles à lyser
Pour la purification de plasmides à partir de bactéries Gram positives ou de souches
disposant des parois cellulaires plus résistantes, un traitement initial au lysozyme peut
s’avérer bénéfique. Pour cela, suspendre le culot cellulaire dans le tampon RES contenant
2 mg/mL de lysozyme et incuber à 37 °C pendant 30 minutes. Poursuivre avec la procédure
de lyse selon le protocole standard NucleoBond® Xtra.
4.10 Mise en place des colonnes NucleoBond® Xtra
Idéalement, les colonnes NucleoBond® Xtra Midi ou Maxi seront placées sur un portoir
NucleoBond® Xtra Combi Rack (voir ‘Informations de commande’). Elles sont maintenues
soient par le col de la colonne ou en utilisant les adaptateurs circulaires en plastique
(réutilisables) inclus dans les kits, permettant d’ajuster la hauteur des colonnes (voir Figure
3). Ces adaptateurs peuvent aussi servir à maintenir les colonnes positionnées sur des
tubes ou des Erlens. Le support NucleoBond® Xtra Combi Rack peut également être utilisé
avec les kits NucleoBond® PC 100, 500 et 2000. Noter que les colonnes NucleoBond®
Xtra Midi sont aussi compatibles avec le support NucleoBond® Rack Large (Référence
740563).
16
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
A
B
Figure 3 Montage des colonnes NucleoBond® Xtra Midi / Maxi sur le support NucleoBond®
Xtra Combi Rack
A : Montage pour les étapes de clarification, de chargement et de lavages. B : montage
pour l’élution.
4.11 Filtration et chargement du lysat
Après la lyse alcaline, l’échantillon doit être débarrassé des débris cellulaires et des précipités
pour garantir une pureté et un débit élevés. Ceci est possible en filtrant le lysat sur les filtres
NucleoBond® Xtra, déjà insérées dans les colonnes NucleoBond® Xtra.
NucleoBond® Xtra
Midi
NucleoBond® Xtra
Maxi
Filtre
NucleoBond® XTRA
Colonne
NucleoBond® XTRA
Les filtres NucleoBond® Xtra sont conçus pour éliminer l’étape de centrifugation après
la lyse alcaline. Ces filtres sont pré-imbibés pendant l’équilibration et permettent un gain
de temps en effectuant la clarification du lysat bactérien et le chargement de la colonne
NucleoBond® Xtra simultanément.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
17
Purification de l’ADN plasmidique
En comparaison avec la clarification par centrifugation ou au moyen de filtres seringues, les
filtres NucleoBond® Xtra empêchent la dégradation des constructions d’ADN de grande
taille comme les PACs ou BACs grâce à une filtration douce en profondeur (la filtration
intervient aussi bien à la surface comme dans la matrice interne du filtre). Le filtre est conçu
à partir d’un matériel spécial permettant une filtration très rapide du lysat. De plus, de très
grands volumes de culture peuvent être appliqués sans risque de colmatage. Cet aspect est
particulièrement important lors de la purification de plasmides low copy. Cependant, pour une
lyse de culot bactérien supérieur aux recommandations (voir paragraphe 4.5, Tableau 2, et
paragraphe 4.6, Tableau 3), il peut s’avérer bénéfique de clarifier le lysat par centrifugation
plutôt que les filtres fournis avec les colonnes, en raison de leur capacité limitée en volume.
4.12 Lavage de la colonne
La concentration élevée en sels du lysat prévient la fixation des protéines et de l’ARN sur
la colonne NucleoBond® Xtra (voir paragraphe 4.2, Figure 2). Cependant, pour éliminer
toute trace de contaminants et purger le volume mort des filtres NucleoBond® Xtra, il est
important de laver la colonne et le filtre en deux étapes consécutives.
Appliquer d’abord le tampon d’équilibration EQU sur les bords supérieurs évasés du filtre
pour laver tout lysat résiduel du filtre sur la colonne. Ne déposer pas seulement le tampon
dans le centre du filtre ! Retirer et jeter ensuite le filtre de la colonne ou le faire tomber en
retournant la colonne. Il est essentiel de laver la colonne NucleoBond® Xtra sans le filtre
une seconde fois avec le tampon WASH. Cela permet d’assurer un rendement et une pureté
plus élevés
4.13 Elution et concentration de l’ADN plasmidique
L’élution est menée en condition de forte concentration saline et grâce à un saut de pH de 7.0
à 9.0. Dans ces conditions alcalines, la charge positive de la résine échangeuse d’anions est
neutralisée et l’ADN plasmidique est relargué. Pour toutes applications, il est nécessaire de
précipiter l’ADN, de le dessaler et d’éliminer toute trace d’éthanol, potentiellement inhibiteur
de l’activité enzymatique lors des réactions de restrictions ou de séquençage.
Tous les éluats NucleoBond® Xtra contiennent déjà assez de sels pour une précipitation à
l’isopropanol de l’ADN. Par conséquent, la précipitation se réalise avec l’ajout de 0,7 volumes
d’isopropanol. Pour éviter la co-précipitation de sels, utiliser uniquement de l’isopropanol
à température ambiante et ne laisser pas l’éluat d’ADN s’écouler dans l’isopropanol mais
ajouter l’isopropanol à l’éluat final et mélanger immédiatement.
Ensuite, suivre au choix, soit le protocole de précipitation par centrifugation décrit à la suite
du protocole NucleoBond® Xtra ou suivre le protocole additionnel mentionné au paragraphe
7.3 concernant l’utilisation des NucleoBond® Finalizers, outils éliminant les longues étapes
de centrifugation (les NucleoBond® Finalizers ne sont recommandés que pour des vecteurs
de taille inférieure à 50 kpb).
Les NucleoBond® Finalizers sont dédiés à la concentration et au dessalage rapide des
plasmides et cosmides contenus dans les éluats obtenus avec les systèmes de purification
utilisant la technologie de chromatographie échangeuse d’anions. L’échantillon est précipité
à l’isopropanol comme mentionné ci-dessus et déposé sur une membrane de silice spéciale
au moyen d’une seringue. Après une étape de lavage à l’éthanol de la membrane, celle-ci
est séchée par le passage d’air au travers du filtre. L’élution de l’ADN pur est ensuite obtenue
grâce à un tampon faiblement salin comme le tampon TRIS (Tris/HCl 5 mM, pH 8.5, inclus
dans les kits NucleoBond® Xtra Plus kits) ou du tampon TE (Tris/HCl 10 mM, pH 7.5, EDTA
1 mM). Ne pas utiliser d’eau purifiée à moins que son pH soit mesuré à plus de 7.0
18
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
Pour optimiser le rendement, il est recommandé d’effectuer l’étape d’élution deux fois.
La première élution est effectuée avec le tampon frais tandis que la seconde est menée
en redéposant la première élution sur le NucleoBond® Finalizer afin de permettre une
solubilisation complète de l’ADN plasmidique.
Le rendement d’ADN dépend du volume de tampon d’élution utilisé. Les volumes élevés
permettent un rendement élevé, jusqu’à 90 % mais une concentration plus faible. Les petits
volumes d’élution, d’autre part, favorise la concentration au détriment du rendement d’ADN.
Si un petit volume est choisi, veiller à récupérer le maximum du liquide contenu dans la
seringue et le NucleoBond® Finalizer en pressant fortement de l’air à travers le filtre
NucleoBond® Finalizer à plusieurs reprises de manière à collecter toutes les gouttelettes
et minimiser le volume mort.
100
2.0
90
1.8
80
1.6
70
1.4
60
1.2
50
1.0
40
0.8
30
0.6
20
0.4
10
0.2
Concentration [µg/µL]
Rendement [%]
Les Figures 4 et 5 illustrent, à titre d’exemple, comment le rendement et la concentration de
l’ADN final sont dépendant du volume de tampon d’élution utilisé avec les NucleoBond®
Finalizer et les NucleoBond® Finalizer Large, respectivement.
Rendement
Concentration
Concentration [µg/µl]
0.0
0
0
200
400
600
800
1000
Volume d’élution [µL]
Figure 4 Rendement et concentration finaux d’ADN après utilisation de NucleoBond®
Finalizer
Un éluat issu d’une préparation NucleoBond® Xtra Midi et contenant 250 µg d’ADN
plasmidique (8 kpb) a été déposé sur un NucleoBond® Finalizer et élué deux fois avec
des volumes croissants de tampon TE.
Le NucleoBond® Finalizer est conçu pour retenir un maximum de 500 µg d’ADN et il est,
par conséquent, idéal en combinaison avec NucleoBond® Xtra Midi. Le rendement maximal
est obtenu en utilisant un volume > à 600 µL de tampon d’élution. Pour augmenter la
concentration, les utilisateurs expérimentés pourront diminuer le volume de tampon d’élution
à 400 – 200 µL.
Le Tableau 4 présente les rendements et les concentrations attendus pour différentes
quantités d’ADN déposées sur le NucleoBond® Finalizer. L’ADN a été élué en deux
étapes successives avec des volumes croissants de TE. Merci de consulter ce tableau pour
sélectionner un volume de tampon d’élution approprié en fonction de vos besoins et de vos
contraintes.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
19
Purification de l’ADN plasmidique
Tableau 4: Rendement et concentration d’ADN avec NucleoBond® Finalizer
Volume d’élution
Quantité d’ADN déposée
100 µL
500 µg
250 µg
100 µg
50 µg
200 µL
400 µL
600 µL
800 µL
1000 µL
35 %
60 %
70 %
75 %
75 %
75 %
2.5 µg/µL
2.3 µg/µL
1.2 µg/µL
0.8 µg/µL
0.6 µg/µL
0.5 µg/µL
40 %
65 %
75 %
80 %
80 %
80 %
1.9 µg/µL
1.1 µg/µL
0.6 µg/µL
0.4 µg/µL
0.3 µg/µL
0.2 µg/µL
45 %
70 %
80 %
85 %
85 %
85 %
0.7 µg/µL
0.4 µg/µL
0.2 µg/µL
0.1 µg/µL
0.1 µg/µL
0.1 µg/µL
30 %
75 %
85 %
90 %
90 %
90 %
0.3 µg/µL
0.2 µg/µL
0.1 µg/µL
0.1 µg/µL
0.1 µg/µL
< 0.1 µg/µL
Rendement
d’ADN
Concentration
d’ADN
Rendement [%]
90
2.5
80
70
2.0
60
1.5
50
40
1.0
30
20
0.5
10
Concentration [µg/µL]
3.0
100
Rendement
Concentration
Concentration [µg/µl]
0.0
0
0
200
400
600
800
1000
Volume d’élution [µL]
Figure 5 Rendement et concentration finaux d’ADN après utilisation de NucleoBond®
Finalizer Large
Un éluat issu d’une préparation NucleoBond® Xtra Maxi et contenant 1000 µg d’ADN
plasmidique (8 kpb) a été déposé sur un NucleoBond® Finalizer Large et élué en deux
fois avec des volumes croissants de tampon TE.
Les éluats issus des préparations NucleoBond® Xtra Maxi sont facilement concentrés avec
les NucleoBond® Finalizer Large capables de fixer jusqu’à 2000 µg d’ADN plasmidique.
Le rendement maximal est obtenu en utilisant un volume > à 800 µL de tampon d’élution.
Pour augmenter la concentration, les utilisateurs expérimentés pourront réduire le volume
d’élution à 600 – 400 µL.
Le Tableau 5 présente les rendements et concentrations attendus pour différentes quantités
d’ADN déposées sur le NucleoBond® Finalizer Large. L’ADN a été élué en deux étapes
20
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
successives avec des volumes croissants de TE. Merci de consulter ce tableau pour
sélectionner un volume de tampon d’élution approprié en fonction de vos besoins et de vos
contraintes.
Tableau 5: Rendement et concentration d’ADN avec NucleoBond® Finalizer Large
Volume d’élution
Quantité d’ADN déposée
100 µL
1500 µg
1000 µg
500 µg
100 µg
200 µL
400 µL
600 µL
800 µL
1000 µL
5%
30 %
65 %
80 %
85 %
90 %
1.9 µg/µL
3.2 µg/µL
2.9 µg/µL
2.2 µg/µL
1.7 µg/µL
1.4 µg/µL
5%
35 %
70 %
85 %
90 %
90 %
1.3 µg/µL
2.5 µg/µL
2.1 µg/µL
1.6 µg/µL
1.2 µg/µL
1.0 µg/µL
10 %
40 %
70 %
85 %
90 %
90 %
1.3 µg/µL
1.4 µg/µL
1.0 µg/µL
0.8 µg/µL
0.6 µg/µL
0.5 µg/µL
15 %
45 %
70 %
80 %
85 %
90 %
0.4 µg/µL
0.3 µg/µL
0.2 µg/µL
0.1 µg/µL
0.1 µg/µL
0.1 µg/µL
Rendement
d’ADN
Concentration
d’ADN
4.14 Détermination du rendement et de la qualité de l’ADN
Le rendement d’une préparation de plasmides doit être estimé avant et après la précipitation
à l’isopropanol afin de mesurer l’efficacité de la procédure de précipitation et de déterminer
le volume le plus approprié pour la solubilisation finale du culot d’ADN. Utiliser le tampon
d’élution ELU du kit NucleoBond® Xtra comme blanc pour la mesure spectrophotométrique
de la quantité d’ADN contenue dans l’éluat.
La concentration en acides nucléiques de l’échantillon est calculée à partir de l’absorption
à 260 nm, 1 unité (1 cm de trajet optique) équivaut à une concentration de 50 µg d’ADN/mL.
Noter que la mesure absolue de l’absorbance doit se situer entre 0,1 et 0,7 pour demeurer
dans la partie linéaire de la loi de Beer-Lambert et en déduire une valeur fiable de la
concentration d’ADN. Diluer l’échantillon si nécessaire.
La pureté de l’ADN plasmidique peut également être vérifiée par spectrophotométrie UV.
Un ratio A260 / A280 de 1,80 – 1,90 et un ratio A260 / A230 autour de 2,0 indiquent un ADN
plasmidique pur. Un ratio A260 / A280 au-delà de 2.0 est signe d’une contamination excessive
par de l’ARN, tandis qu’un ratio A260 / A280 inférieur à 1,8 indique une contamination par des
protéines.
La qualité de l’ADN plasmidique peut être vérifiée en effectuant une migration sur gel à 1 %
d’agarose. Cela procure des informations quant à la conformation et l’intégrité structurale
de l’ADN plasmidique purifié, par exemple, en offrant la possibilité de vérifier que les
prédominances conformationnelles : surenroulée (forme ‘ccc’, habituellement la bande de
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
21
Purification de l’ADN plasmidique
migration la plus rapide), en cercle ouvert (oc) ou même sous forme linéaire (paragraphe
8.1, Figure 6).
4.15 Etapes de pause possible
Les culots bactériens peuvent aisément être stockés plusieurs mois à -20 °C.
Les lysats clarifiés peuvent être conservés sur la glace ou à 4°C pendant plusieurs jours.
Pour une performance optimale, la procédure de purification sur colonne ne doit pas être
interrompue. Cependant, les colonnes peuvent être laissées sans surveillance pendant
plusieurs heures du fait qu’elle ne sèche pas. Cependant, une faible perte de rendement
pourrait être observée.
Les éluats peuvent être stockés pendant plusieurs jours à 4°C. Noter qu’ils devront être
équilibrés à température ambiante avant de procéder à la précipitation à l’isopropanol pour
éviter la co-précipitation des sels.
5
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Tous les composants du kit peuvent être conservés à température ambiante (15 – 25 °C) et
sont ainsi stables jusqu'à : voir l'étiquette sur le kit.
Le stockage du tampon LYS en deçà de 20°C peut conduire à la précipitation du SDS
contenu. Le cas échéant, incuber le tampon LYS à 30 – 40 °C pendant plusieurs minutes et
mélanger efficacement jusqu’à complète dissolution du précipité. Laisser le tampon revenir
à température ambiante avant utilisation.
Avant toute première utilisation d’un kit NucleoBond® Xtra Midi / Maxi, préparer les réactifs
suivants :
•
Dissoudre la RNase A lyophilisée* avec 1 mL de tampon RES. Le port de gants est
recommandé. Mélanger en pipetant plusieurs fois jusqu’à ce que la RNase A soit
parfaitement dissoute. Transférer la solution de RNase A dans le flacon contenant le
tampon RES et mélanger précautionneusement. Noter sur le flacon la date d’ajout de
la RNase A. La concentration finale de RNase A est de 60 µg/mL de tampon RES.
Stocker le tampon RES contenant la RNase A à 4 °C. La solution est stable à cette
température pendant au moins 6 mois.
* La référence 740414.100 contient 2 x 50 mg de RNase A. Veiller à bien dissoudre la RNase A des deux flacons,
avec 1 mL de tampon RES pour chacun et transférer les solutions dans le flacon de tampon RES.
22
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
6
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoBond® Xtra, portez des vêtements de protection
appropriés (par exemple: une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de
protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées
(les FDS sont disponibles en ligne sur www.mn‑net.com/msds).
Les déchets générés par le kit NucleoBond® Xtra n’ont pas été testés pour la présence
de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel
infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement
dénaturant et du traitement à la Protéinase K mais elle ne peut être totalement exclue. Par
conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être
manipulés et éliminés conformément aux réglementations de sécurité locales.
6.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
23
NucleoBond® Xtra Midi/Maxi
7
Purification de l’ADN plasmidique avec
NucleoBond® Xtra
Le paragraphe suivant décrit les protocoles pour la purification de plasmides high copy et
low copy ainsi que la procédure pour concentrer les éluats NucleoBond® Xtra avec les
NucleoBond® Finalizers.
7.1
Purification de plasmides High copy (Midi, Maxi)
Midi
1
Maxi
Préparation d’une préculture
Inoculer une préculture de 3 – 5 mL de milieu LB avec une seule colonie prélevée sur
une boîte de culture fraîchement striée. Veiller à ce que la boîte et le milieu de culture
contiennent bien l’antibiotique approprié pour la pression de sélection nécessaire à
la propagation du plasmide d’intérêt (voir paragraphe 4.3 pour plus d’informations).
Agiter à 37°C et ~ 300 rpm pendant ~ 8h.
2
Préparation d’une culture overnight
Inoculer une culture pendant la nuit en diluant la préculture au 1/1000 dans les
volumes mentionnés de milieu LB contenant également l’antibiotique de sélection
adéquat. Faire pousser la culture toute la nuit à 37 °C et ~ 300 rpm pendant 12 – 16 h.
100 mL
3
300 mL
Collecter les bactéries
Mesurer la DO600 de la culture et déterminer le volume de culture recommandé.
V [mL] =
400 / ​DO600
V [mL] =
1200 / ​DO600
Culotter les cellules par centrifugation à 4,500 – 6,000 x g pendant ≥ 10 min à 4 °C
et jeter la totalité du surnageant.
Note : Les conditions optimales de lyse sont déterminées par un ratio unique entre
les volumes des tampons RES, LYS, NEU et la masse cellulaire utilisée. Voir le
paragraphe 4.5 pour des recommandations concernant le volume optimal de culture
à partir duquel les bactéries doivent être collectées pour des plasmides high copy
et le paragraphe 4.6 pour des recommandations pour les plasmides low copy. Lire
le paragraphe 4.5 attentivement car une quantité excessive de cellules induira des
rendements réduits. Les volumes de culture recommandés ci-dessous sont calculés
pour un DO600 finale de 4.
24
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
NucleoBond® Xtra Midi/Maxi
Midi
4
Maxi
Resuspension (Tampon RES)
Resuspendre complètement le culot bactérien dans le tampon de resuspension
RES + RNase A en pipetant les cellules plusieurs fois ou en vortexant.
Pour une lyse efficace, il est important qu’aucun agrégat de cellules ne subsiste dans
la suspension.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de tampon RES si une masse
cellulaire supérieure aux recommandations est utilisée (voir le paragraphe 4.8 pour
des informations sur les conditions optimales de lyse et le paragraphe 4.9 pour les
souches difficiles à lyser).
8 mL
12 mL
5
Lyse cellulaire (Tampon LYS)
!
Vérifier l’absence de précipité de SDS dans le tampon LYS avant utilisation.
Si un précipité blanc est visible, réchauffer le tampon pendant plusieurs minutes à
30 – 40 °C jusqu’à sa complète dissolution. Laisser le tampon revenir à température
ambiante avant utilisation.
Ajouter le tampon LYS à la suspension.
Mélanger doucement en retournant le tube 5 fois. Ne pas vortexer, au risque de
fragmenter et de contaminer la suspension par de l’ADN chromosomique contenu
dans les débris cellulaires.
Incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.
Attention : une exposition prolongée aux conditions alcalines peut dénaturer et
dégrader irréversiblement l’ADN plasmidique et libérer de l’ADN chromosomique
contaminant dans le lysat.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de tampon LYS si une masse
cellulaire supérieure aux recommandations est utilisée (voir paragraphe 4.8 pour
des informations sur les conditions optimales de lyse).
8 mL
6
12 mL
®
Equilibrer la colonne NucleoBond
Xtra avec son filtre avec le tampon
d’équilibration EQU.
Déposer le tampon sur les bords
supérieurs évasés du filtre comme
indiqué sur le schéma et veiller à
imprégner la totalité du filtre.
Laisser la colonne se vider par gravité.
La colonne ne sèche pas.
12 mL
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
25 mL
25
NucleoBond® Xtra Midi/Maxi
Midi
Maxi
7
Neutralisation (Tampon NEU)
!
Ajouter le tampon de neutralisation NEU à la suspension et mélanger
immédiatement le lysat en retournant doucement le tube jusqu’à disparition
complète de la coloration bleue ! Ne pas vortexer.
La flasque ou le tube utilisé pour cette étape ne doit pas être rempli à plus de deux
tiers pour permettre un mélange homogène. Veiller à neutraliser la totalité du lysat
pour précipiter toutes les protéines et l’ADN chromosomique. La consistance du
lysat doit passer de visqueuse à une suspension plus fluide, homogène de floculat
blanchâtre. De plus, le réactif LyseControl doit être totalement décoloré sans aucune
trace résiduelle de bleu.
Procéder immédiatement à l’étape 8. Une incubation du lysat n’est pas nécessaire.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de tampon NEU si une masse
cellulaire supérieure aux recommandations est utilisée (voir paragraphe 4.8 pour
des informations sur les conditions optimales de lyse).
8 mL
12 mL
8
Clarification et chargement du lysat
!
Veiller à déposer une suspension homogène du précipité en retournant le tube 3
fois avant le chargement sur le filtre NucleoBond® Xtra préalablement équilibré pour
éviter le colmatage du filtre.
Le lysat est simultanément clarifié et chargé sur la résine. Recharger le lysat si un
volume supérieur à la capacité volumique du filtre est à procéder. Permettre à la
colonne de se vider par écoulement gravitaire.
Alternative : le précipité peut être éliminé par centrifugation à ≥ 5,000 x g pendant
au moins 10 min, par exemple si la masse cellulaire utilisée est plus du double
de la quantité recommandée. Si le surnageant contient encore des matières en
suspension, transférer le dans un nouveau tube et répéter la centrifugation, de
préférence à vitesse supérieure ou bien déposer le lysat sur le filtre NucleoBond®
Xtra équilibrée.
Cette étape de clarification est extrêmement importante car des résidus de précipité
pourrait induire le colmatage de la colonne NucleoBond® Xtra. Pour charger la
colonne, déposer le lysat clair sur le filtre équilibré ou enlever le filtre inutilisé au
préalable. Laisser la colonne se vider par écoulement gravitaire.
Note : Vous pouvez conserver tout ou partie des filtrats pour des analyses ultérieures
(voir paragraphe 8.1).
26
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
NucleoBond® Xtra Midi/Maxi
Midi
9
!
Maxi
1er lavage : Filtre et colonne (Tampon
EQU)
Laver le filtre NucleoBond® Xtra et la
colonne NucleoBond® Xtra avec le
tampon d’équilibration EQU.
Déposer le tampon sur les bords
supérieurs évasés du filtre et veiller à
l’imprégner complètement pour que
le lysat contenu dans le filtre s’écoule
dans la colonne. Omettre cette étape
ou déposer le tampon directement au
centre du filtre peut réduire le rendement
d’ADN plasmidique.
5 mL
10
15 mL
Elimination du filtre
Retirer le filtre NucleoBond® Xtra
ou laisser le tomber en retournant la
colonne.
11
!
2nd lavage : Colonne
(tampon WASH)
uniquement
Laver la colonne NucleoBond® Xtra
avec le tampon WASH. Il est important
d’enlever le filtre avant de déposer le
tampon de lavage pour optimiser la
pureté de l’ADN.
8 mL
12
25 mL
Elution (tampon ELU)
Eluer l’ADN plasmidique avec le tampon d’élution ELU. Collecter l’éluat dans un tube
à centrifuger 15 mL ou 50 mL (non fourni).
Note : Préchauffer le tampon ELU à 50 °C avant de procéder à l’élution peut améliorer
le rendement pour les constructions de grande taille comme les BACs.
Optionnel : Déterminer le rendement en ADN plasmidique par spectrophotométrie
UV afin d’ajuster la concentration d’ADN à l’étape 15 et évaluer le rendement de
l’étape de précipitation.
5 mL
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
15 mL
27
NucleoBond® Xtra Midi/Maxi
Midi
!
13
Maxi
®
NucleoBond Xtra Midi / ​Maxi Plus :
Poursuivre avec l’étape 13 pour le protocole de centrifugation après la précipitation
à l’isopropanol ou continuer avec le paragraphe 7.3 pour la concentration et
le dessalage avec NucleoBond® Finalizer (NucleoBond® Xtra Midi Plus) ou
NucleoBond® Finalizer Large (NucleoBond® Xtra Maxi Plus).
Précipitation
Ajouter l’isopropanol à température ambiante pour précipiter l’ADN plasmidique élué.
Vortexer efficacement !
Centrifuger à ≥ 4,500 x g pendant ≥ 15 min à ≤ température ambiante, de
préférence à 15,000 x g pendant 30 min et à 4 °C. Jeter précautionneusement le
surnageant.
3.5 mL
14
10.5 mL
Lavage et séchage
Ajouter de l’éthanol 70 % à température ambiante sur le culot.
2 mL
14 mL
Centrifuger à ≥ 4,500 x g, de préférence ≥ 15,000 x g pendant 5 min à température
ambiante.
Eliminer complètement l’éthanol avec un cône. Laisser sécher le culot à l’air libre à
température ambiante.
Note : l’ADN plasmidique peut être difficile à solubiliser en cas de séchage excessif.
10 – 15 min
15
15 – 30 min
Solubilisation de l’ADN
Dissoudre le culot d’ADN dans le volume adéquat de tampon TE ou d’H2O. Selon
le type de tube à centrifuger utilisé, dissoudre en pipetant de manière répéter ou
en faisant tourner le tube pendant 10 – 60 min (agitateur 3D) contenant un volume
suffisant de tampon.
Déterminer le rendement d’ADN plasmidique par spectrophotométrie UV. Vérifier
l’intégrité de l’ADN plasmidique par électrophorèse sur gel d’agarose (voir
paragraphe 4.14).
28
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
NucleoBond® Xtra Midi/Maxi
7.2
Purification de plasmides Low copy (Midi, Maxi)
Les volumes de tampons de lyse fournis dans le kit sont calculés pour la purification de
plasmides high copy. Par conséquent, des tampons supplémentaires doivent être commandés
séparément en cas de purifications répétées de plasmides low copy (voir ‘Informations de
commande’).
Midi
1
Maxi
Préparation d’une préculture
Inoculer une préculture de 3 – 5 mL de milieu LB avec une seule colonie prélevée sur
une boîte de culture fraîchement striée. Veiller à ce que la boîte et le milieu de culture
contiennent bien l’antibiotique approprié pour la pression de sélection nécessaire à
la propagation du plasmide d’intérêt (voir paragraphe 4.3 pour plus d’informations).
Agiter à 37°C et ~ 300 rpm pendant ~ 8 h.
2
Préparation d’une culture overnight
!
Note : pour utiliser l’entière capacité de fixation des colonnes NucleoBond® Xtra, il est
important de produire suffisamment d’ADN plasmidique. Pour le protocole standard
de purification de plasmides low copy, les volumes de culture sont doublés par rapport
à la procédure recommandée pour les plasmides high copy. Cependant, en raison
d’un contenu en plasmides 10 – 100 fois plus faibles, ceci peut demeurer insuffisant.
Si vous souhaitez optimiser vos rendements en plasmides low copy, augmenter
le volume de culture d’un facteur 3-5. Les volumes de culture recommandés
ci-dessous sont calculés pour une DO600 finale de culture d’environ 4 (voir
paragraphe 4.6 pour plus d’informations).
Inoculer une culture overnight en diluant la préculture au 1/1000 dans les volumes
mentionnés de milieu LB contenant également l’antibiotique de sélection adéquat.
Faire pousser la culture pendant une nuit à 37 °C et ~ 300 rpm pendant 12 – 16h.
200 mL
3
600 mL
Collecter des bactéries
Mesurer la DO600 de la culture bactérienne et déterminer le volume de culture
recommandé.
V [mL] =
800 / ​DO600
V [mL] =
2400 / ​DO600
Culotter les cellules par centrifugation à 4,500 – 6,000 x g pendant ≥ 10 min à 4 °C et
jeter la totalité du surnageant.
Note : Il est bien entendu possible d’utiliser des volumes de culture supérieurs,
par exemple afin d’obtenir un rendement plus élevé de plasmides low copy
(voir paragraphe 4.6 pour plus d’informations). Dans ce cas, augmenter
proportionnellement les volumes de tampons RES, LYS et NEU aux étapes 4, 5 et 7.
Des tampons de lyse complémentaires peuvent être commandés séparément
(voir ‘Informations de commande’ pour le set de tampons NucleoBond® Xtra
Buffer Set I, au paragraphe 8.2). Utiliser la centrifugation pour la clarification plutôt
que les filtres NucleoBond® Xtra.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
29
NucleoBond® Xtra Midi/Maxi
Midi
4
Maxi
Resuspension (Tampon RES)
Resuspendre complétement le culot cellulaire dans le tampon de resuspension
RES + RNase A en pipetant les cellules de manière répétée ou en vortexant.
Pour une lyse efficace, il est important qu’aucun agrégat de bactéries ne subsiste
dans la suspension.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de tampon RES si une masse
cellulaire supérieure aux recommandations est utilisée (voir paragraphe 4.8 pour des
informations sur les conditions optimales de lyse et le paragraphe 4.9 concernant les
souches difficiles à lyser).
16 mL
24 mL
5
Lyse cellulaire (Tampon LYS)
!
Vérifier l’absence de précipité de SDS dans le tampon LYS avant utilisation. Si
un précipité blanc est visible, réchauffer le tampon LYS pendant plusieurs minutes à
30 – 40 °C jusqu’à sa complète dissolution. Laisser le tampon revenir à température
ambiante avant utilisation.
Ajouter le tampon LYS à la suspension.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de tampon LYS si une masse
cellulaire supérieure aux recommandations est utilisée (voir paragraphe 4.8 pour
des informations sur les conditions optimales de lyse).
16 mL
24 mL
Mélanger doucement en retournant le tube 5 fois. Ne pas vortexer, ceci induirait
une fragmentation et un relarguage de l’ADN chromosomique depuis les débris
cellulaires qui contaminerait la suspension.
Incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.
Attention : une exposition prolongée aux conditions alcalines peut dénaturer et
dégrader irréversiblement l’ADN plasmidique et libérer de l’ADN chromosomique
contaminant dans le lysat.
6
Equilibration (Tampon EQU)
Equilibrer la colonne NucleoBond®
Xtra avec son filtre avec le tampon
d’équilibration EQU.
Déposer le tampon sur les bords
supérieurs évasés du filtre comme
indiquer sur le schéma et veiller à
imprégner la totalité du filtre.
Laisser la colonne se vider par gravité.
La colonne ne sèche pas.
30
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
NucleoBond® Xtra Midi/Maxi
7
Midi
Maxi
12 mL
25 mL
Neutralisation (Tampon NEU)
Ajouter le tampon de neutralisation NEU à la suspension et mélanger
immédiatement le lysat en retournant doucement le tube jusqu’à disparition
complète de la coloration bleue ! Ne pas vortexer.
!
La flasque ou le tube utilisé pour cette étape ne doit être rempli à plus de deux tiers
pour permettre un mélange homogène. Veiller à neutraliser la totalité du lysat pour
précipiter toutes les protéines et l’ADN chromosomique. La consistance du lysat doit
passer de visqueuse à une suspension plus fluide, homogène de floculat blanchâtre.
De plus, le réactif LyseControl doit être totalement décoloré sans aucune trace
résiduelle de bleu.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de tampon NEU si la masse
cellulaire utilisée est supérieure aux recommandations du protocole standard (voir
paragraphe 4.8 pour des informations sur les conditions optimales de lyse).
16 mL
24 mL
Poursuivre avec l’étape 8 du protocole standard pour la purification des plasmides
high copy (paragraphe 7.1) si les volumes de tampons de lyse n’ont pas été
significativement augmentés.
Autrement, il est préférable de centrifuger d’abord le précipité afin d’éviter le
colmatage du filtre NucleoBond® Xtra.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
31
NucleoBond® Xtra Midi/Maxi
7.3
Concentration des éluats NucleoBond® Xtra avec les
NucleoBond® Finalizers
Note : L’utilisation des NucleoBond® Finalizers est recommandée uniquement pour les
vecteurs de taille inférieure à 50 kpb.
Midi – NucleoBond®
Finalizer
1
Maxi – NucleoBond®
Finalizer Large
Précipitation
Note : Vérifier par spectrophotométrie la concentration de l’ADN dans les éluats avant
la précipitation. Ceci permet de choisir ensuite le volume d’élution le plus approprié à
l’étape 5 et permet d’évaluer le rendement de l’étape de concentration.
Ajouter 0,7 volumes d’isopropanol à température ambiante (non fourni). Vortexer
efficacement et laisser le mélange incuber pendant 2 minutes.
(Exemple : pour 5 mL d’éluat NucleoBond® Xtra Midi ajouter 3.5 mL d’isopropanol,
pour 15 mL d’éluat NucleoBond® Xtra Maxi, ajouter 10.5 mL d’isopropanol)
3.5 mL pour
5 mL d’éluat
2
10.5 mL pour
15 mL d’éluat
Chargement du filtre seringue
Enlever le piston d’une seringue 30 mL et connecter un NucleoBond® Finalizer
en sortie. Déposer le mélange de précipitation dans la seringue, insérer le piston,
maintenir en position verticale et presser le mélange doucement à travers le
NucleoBond® Finalizer (le mélange doit traverser le NucleoBond® Finalizer au
goutte à goutte). Jeter le filtrat.
3
Lavage
Déconnecter le NucleoBond® Finalizer de la seringue, retirer le piston et reconnecter
le NucleoBond® Finalizer.
Déposer l’éthanol 70 % (non fourni) dans la seringue, insérer le piston, maintenir
la seringue en position verticale et presser doucement l’éthanol à travers le
NucleoBond® Finalizer. Jeter le filtrat.
2 mL
32
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
4 mL
NucleoBond® Xtra Midi/Maxi
Midi – NucleoBond®
Finalizer
4
Maxi – NucleoBond®
Finalizer Large
Séchage
Déconnecter le NucleoBond® Finalizer de la seringue, retirer le piston et reconnecter
le NucleoBond® Finalizer. Presser l’air à travers le NucleoBond® Finalizer aussi
fortement que possible tout en touchant un papier absorbant avec l’embout du
NucleoBond® Finalizer pour absorber l’éthanol.
Répéter cette étape le nombre de fois mentionnées ci-dessous jusqu’à ce que plus
l’éthanol ne sorte plus du NucleoBond® Finalizer.
Note : Une nouvelle seringue peut être utilisée pour accélérer la procédure de
séchage (non incluse).
≥ 6 fois, jusqu’au séchage total
≥ 6 fois, jusqu’au séchage total
®
Optional : vous pouvez incuber le NucleoBond Finalizer pendant 10 minutes à 80 °C
pour minimiser la contamination en éthanol. Cependant, le rendement final peut
s’avérer négativement impacté par un séchage excessif de l’ADN.
5
Elution (tampon TRIS)
Enlever le NucleoBond® Finalizer de la seringue 30 mL, retirer le piston d’une
seringue 1 mL et y connecter le NucleoBond® Finalizer.
Note : Voir le paragraphe 4.13, Tableau 4(Midi) ou 5 (Maxi) pour déterminer le volume
de tampon d’élution le plus approprié.
Déposer le volume adéquat de tampon de dissolution TRIS (Tris/HCl 5 mM, pH
8.5) ou de tampon TE dans la seringue (voir paragraphe 4.13). Ne pas utiliser d’eau
purifier à moins que son pH soit au-delà de pH 7.0. Placer la sortie du NucleoBond®
Finalizer verticalement au-dessus d’un tube neuf (non fourni) éluer l’ADN
plasmidique très doucement, goutte après goutte, en insérant le piston.
200 – 800 µL
400 – 1000 µL
Déconnecter le NucleoBond® Finalizer de la seringue, retirer le piston et reconnecter
le NucleoBond® Finalizer.
Transférer le premier éluat dans la seringue et éluer une seconde fois dans le
même tube collecteur.
Déposer la totalité du premier éluat
Déposer la totalité du premier éluat
En cas de rendement attendu très élevé (> 400 µg pour NucleoBond® Xtra Midi ;
> 1000 µg pour NucleoBond® Xtra Maxi), le rendement final peut être amélioré par
une troisième élution.
Déconnecter le NucleoBond® Finalizer de la seringue, retirer le piston pour aspirer
de l’air, reconnecter le NucleoBond® Finalizer et presser de l’air pour forcer le
maximum d’éluat à sortir du filtre.
Déterminer le rendement d’ADN plasmidique par spectrophotométrie UV et
confirmer l’intégrité de l’ADN plasmidique par électrophorèse sur gel d’agarose (voir
paragraphe 4.14).
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
33
Purification de l’ADN plasmidique
8
Annexes
8.1
Guide de résolution des problèmes
Si vous rencontrez des problèmes de rendement ou de pureté de l’ADN plasmidique obtenu,
il est recommandé de vérifier quelle étape de la procédure peut être en cause.
Premièrement, vérifier la croissance de la culture bactérienne (DO600) et la présence d’un
antibiotique approprié (Tableau 1, paragraphe 4.3). Deuxièmement, des aliquotes de lysat
clarifié, de filtrat, des lavages (tampon EQU et tampon WASH) et des éluats peuvent être
conservés pour une analyse ultérieure par électrophorèse sur gel d’agarose.
Voir le Tableau 6 pour connaître les volumes à prélever pour chaque fraction, de manière
à obtenir environ 5 µg d’ADN plasmidique, en considérant que 250 et 1000 µg d’ADN ont
été déposés respectivement sur une colonne NucleoBond® Xtra Midi ou Max. Précipiter
les acides nucléiques en ajoutant 0,7 volumes d’isopropanol, centrifuger, laver le culot à
l’éthanol 70 %, centrifuger à nouveau, éliminer le surnageant, sécher à l’air pendant 10
minutes, dissoudre l’ADN dans 100 µL de tampon TE (pH 8.0) et déposer 20 µL sur un gel
d’agarose à 1 %.
Tableau 6: Volumes des fractions NucleoBond® Xtra à conserver pour analyse
Volume required [µL]
Echantillon
I
II
III
IV
Etape de la purification
Lysat clarifié
(issu de l’étape 8)
Filtrat
(après l’étape 8)
Filtrat des lavages
(après les étapes 9 et 11)
Eluat
(après l’étape 12)
Midi
Maxi
500
200
500
200
250
200
100
100
Les exemples de gel (Figure 6) vous aideront à cibler votre problématique et à répondre aux
questions du paragraphe suivant plus rapidement et efficacement.
Ce gel est un exemple montrant les bandes dominantes d’ADN plasmidique qui ne doivent
être présentes que dans l’éluat final et le lysat clarifié, prouvant la production de plasmides
dans votre culture (ligne 1). Cependant, de l’ADN plasmidique retrouvé dans la fraction
de filtrat issue des lavages signifierait un problème d’utilisation du mauvais tampon ou de
tampon altéré (exemple : problème de pH, composants précipités, évaporation de liquide lié
à un mauvais stockage).
L’ARN peut être visualisé sous forme de bande diffuse en bas du gel dans les fractions de
lysat et de filtrat obtenu à l’issue de l’étape de fixation de l’ADN (lignes 1 et 2). Il peut aussi se
retrouver dans la fraction correspondant aux lavages mais il doit être absent de l’éluat final.
L’ADN génomique ne devrait pas être visible. Dans le cas contraire, il apparaîtrait dans
les puits du gel ou juste en dessous et serait symptomatique de conditions de lyse trop
drastiques.
34
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
M
1
2
3
4
5
M:
Marqueur λ HindIII
1 : I, lysat clarifié, structures
ccc, linéaire et oc de l’ADN
plasmidique, ARN dégradé
2 : II, filtrat issu de l’étape de fixation,
pas d’ADN plasmidique mais de
l’ARN dégradé
3 :III, filtrat des lavages, pas d’ADN
plasmidique ni d’ARN résiduel
4:
IV, éluat, ADN plasmidique pur
5 : Restriction EcoRI, forme linéarisée
du plasmide
Figure 6 Exemple de contrôle analytique des différentes fractions issues de la procédure
NucleoBond® Xtra Midi Plasmide : pUC18, souche bactérienne : E. coli DH5α®.
Après précipitation, 20 µL de chaque fraction ont été analysés sur gel d’agarose à 1 %.
Des quantités équivalentes d’ADN plasmidique sont visibles avant (ligne 1) et après la
purification avec NucleoBond® Xtra Midi (ligne 4), démontrant un rendement > 90 %.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
35
Purification de l’ADN plasmidique
Problème
Cause possible et suggestions
Pas d’amplification du plasmide
•
Vérifier le contenu en plasmides du lysat clarifié (voir Figure 6).
Utiliser des colonies fraîches pour inoculer le milieu et ajouter un
antibiotique de sélection frais sur les boîtes et milieux de culture.
•
Estimer le contenu en plasmides avant d’effectuer la purification
d’une culture overnight au moyen de minipreps rapides comme
NucleoSpin® Plasmid ou NucleoSpin® Plasmid EasyPure.
Lyse alcaline inefficace
•
Quantité de masse cellulaire excessive. Voir les paragraphes
4.5 – 4.8 à propos des volumes de culture et de réactifs de lyse
recommandés. Vérifier la quantité de plasmides présents dans le
lysat clarifié (voir Figure 6).
•
Vérifier l’absence de précipité de SDS dans le tampon LYS avant
utilisation, en particulier en cas de stockage en deçà de 20°C. Si
nécessaire, incuber le flacon plusieurs minutes à 30 – 40 °C et
mélanger bien jusqu’à complète dissolution du SDS.
Présence de SDS ou autres précipités dans l’échantillon
Rendement
faible ou nul
•
Déposer le lysat sur le filtre NucleoBond® Xtra inséré dans la
colonne NucleoBond® Xtra. Cette filtration permet d’éliminer
totalement les précipités de SDS. L’incubation des lysats clarifiés
pendant une période plus longue peut induire la formation
de nouveaux précipités. Si des précipités sont visibles, il est
recommandé de filtrer et centrifuger de nouveau le lysat avant de le
déposer sur la colonne NucleoBond® Xtra.
Échantillon / lysat trop visqueux
•
Masse cellulaire utilisée excessive. Voir les paragraphes 4.5 – 4.8 à
propos des volumes de culture et de réactifs de lyse recommandés.
•
Veiller à mélanger efficacement après la neutralisation pour
précipiter totalement le SDS et l’ADN chromosomique. Sinon,
l’efficacité de la filtration et le débit d’écoulement diminueront, ainsi
que le rendement car le SDS empêche l’ADN de se fixer sur la
colonne.
pH ou concentration en sel des tampons trop élevés
•
36
Vérifier le contenu en ADN plasmidique dans les fractions de lavage
(voir Figure 6). Conserver tous les flacons bien clos. Vérifier et
ajuster le pH des tampons EQU (pH 6.5), WASH (pH 7.0), et ELU
(pH 9.0) et corriger avec du HCl ou NaOH si nécessaire.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
Problème
Cause possible et suggestions
Volume de culture trop élevé
•
Filtre
NucleoBond®
Xtra colmaté
au cours de la
filtration
Voir les paragraphe 4.5 – 4.8 à propos des volumes de culture et de
l’utilisation de grands volumes de tampon de lyse.
Précipité insuffisamment resuspendu avant l’étape de fixation de l’ADN.
•
Retourner le tube contenant le lysat au moins 3 fois avant de le
déposer dans le filtre.
Précipitation incomplète
•
Veiller à bien mélanger après la neutralisation pour précipiter la
totalité du SDS et de l’ADN chromosomique.
Echantillon trop visqueux
Colonne
NucleoBond®
Xtra colmatée
ou écoulement
très lent
•
NE PAS essayer de purifier l’ADN à partir d’un lysat préparé à partir
d’un volume de culture supérieur aux recommandation mais avec
les volumes de réactifs de lyse du protocole. Une lyse incomplète
peut non seulement colmater les colonnes, mais aussi induire des
rendements significativement réduits. Voir les paragraphes 4.5 et
4.6 pour des recommandations à propos des volumes de culture
et le paragraphe 4.8 pour l’ajustement des volumes de tampons de
lyse.
•
Veiller à bien mélanger après la neutralisation pour précipiter la
totalité du SDS et de l’ADN chromosomique.
Clarification incomplète du lysat
•
Utiliser le filtre NucleoBond® Xtra ou centrifuger à plus haute vitesse
ou pendant plus longtemps.
•
Précipité formé pendant le stockage. Clarifier de nouveau le lysat
avant le dépôt sur la colonne.
Lyse trop drastique
•
Contamination
par de l’ADN
génomique
Veiller à ne pas prolonger la lyse avec le tampon LYS au-delà de
5 min.
Lysat mélangé trop violemment ou vortexé après la lyse
•
Retourner le tube seulement 5 fois. Ne pas vortexer après ajout du
tampon LYS.
•
Utiliser des tubes de plus grand volume ou réduire le volume de
culture afin de permettre un mélange plus efficace et aisé.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
37
Purification de l’ADN plasmidique
Problème
Cause possible et suggestions
Inefficacité de la digestion par la RNase
•
La RNase n’a pas été ajoutée dans le tampon RES ou le tampon a
été mal conservé. Ajouter à nouveau de la RNase dans le tampon
RES. Voir le paragraphe 8.2 pour les ‘informations de commande’.
pH ou concentration en sels trop faible du tampon de lavage
Contamination
de l’ADN
plasmidique
par l’ARN
•
Vérifier la présence d'ARN dans les fractions de lavage (voir Figure
6). Conserver tous les flacons bien clos. Vérifier le pH des tampons
EQU (pH 6.5) et WASH (pH 7.0) et ajuster avec HCl ou NaOH si
nécessaire.
•
Augmenter la stringence du tampon de lavage WASH en ajustant
son pH à 7.5.
Etape de lavage avec le tampon WASH insuffisante
•
Doubler ou tripler le lavage avec le tampon WASH. Le tampon
WASH est disponible séparément (voir ‘Informations de
commande’).
Le filtre NucleoBond® Xtra n’a pas été éliminé avant le second lavage
•
Pureté faible
(A260/A280
< 1.8)
Le contenu en protéines est trop élevé en raison de l’inefficacité
du lavage. Enlever le filtre NucleoBond® Xtra avant d’effectuer le
second lavage avec le tampon WASH.
Le tampon WASH a été utilisé à la place du tampon EQU pour le premier
lavage
•
Le tampon EQU doit être utilisé pour laver le filtre NucleoBond® Xtra
pour éviter le relarguage de SDS.
Quantité minime d’ADN chargée sur la colonne
38
•
Un excès de sites de fixation libres nécessite des lavages plus
importants - doubler l’étape de lavage avec le tampon WASH.
•
Réduire le temps de lyse à < 5 min.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
Problème
Cause possible et suggestions
Perte du culot
•
Absence de
culot d’acides
nucléiques
après la
précipitation
Manipuler le précipité avec soin. Décanter la solution
précautionneusement. Déterminer le rendement dans le tampon
ELU afin de déterminer la quantité d’ADN plasmidique attendue
après la précipitation.
L’ADN plasmidique est étalé sur les parois du tube
•
Dissoudre l’ADN dans un volume suffisant de tampon en faisant
tourner le tube sur lui-même pendant au moins 30 min.
Problème de précipitation des acides nucléiques
•
Vérifier la nature et le volume de solvant utilisé. Veiller à utiliser au
moins 0.7 volume d’isopropanol et mélanger efficacement.
•
Centrifuger à une vitesse supérieure et pendant plus longtemps.
Co-précipitation de sels
Culot d’acides
nucléiques
opaque ou
blanc plutôt
que clair et
vitreux
•
Vérifier la pureté de l’isopropanol et effectuer la précipitation à
température ambiante mais centrifuger à 4 °C. Ne laisser pas l’éluat
tomber directement de la colonne dans l’isopropanol mais ajouter le
à l’éluat et mélanger immédiatement.
•
Essayer de resuspendre le culot dans le tampon WASH et
recharger la même colonne NucleoBond® Xtra. Laver la colonne
plusieurs fois avec le tampon WASH avant de charger.
Séchage excessif du culot
•
Le culot
d’acides
nucléiques ne
se resuspend
pas dans le
tampon
Essayer de le dissoudre à température supérieure pendant plus
longtemps (ex : 2 h à 37 °C ou une nuit TA), de préférence sous
agitation constante (agitateur 3 D).
Co-précipitation de sels ou résidus d’alcool
•
Laver de nouveau le culot avec de l’éthanol 70 % ou augmenter le
volume de tampon de dissolution.
Particules insolubles dans l’ADN dissout
•
Centrifuger la solution d’ADN pour culotter les particules insolubles
et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Les particules
insolubles n’affectent pas la qualité de l’ADN. Sinon les particules
insolubles peuvent facilement être éliminées avec les NucleoBond®
Finalizer (NucleoBond® Xtra Midi) ou les NucleoBond® Finalizer
Large (NucleoBond® Xtra Maxi).
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
39
Purification de l’ADN plasmidique
Problème
Cause possible et suggestions
Rendement faible ou nul dans la fraction éluée de la colonne NucleoBond®
Xtra
•
Voir le chapitre ‘Guide de résolution des problèmes' “rendement
faible ou nul”.
Volume mort trop important
•
Si la concentration d’ADN plasmidique est la priorité, l’élution peut
devoir être effectuée dans un petit volume. Naturellement, une
partie de l’éluat est perdue dans la seringue et le filtre seringue
NucleoBond® Finalizer. Pour minimiser ces pertes lors de la
seconde élution, essayer de récupérer la moindre goutte sortant du
NucleoBond® Finalizer, par exemple en tapotant le NucleoBond®
Finalizer et la seringue sur la paillasse. Ensuite, remplir la seringue
d’air et presser fortement pour expulser les gouttelettes résiduelles
du NucleoBond® Finalizer. Répéter plusieurs fois cette étape. Cette
procédure peut demander un certain entrainement. Le volume
mort considéré comme acceptable pour les NucleoBond® Finalizer
est de 30 µL et de 60 µL pour les NucleoBond® Finalizer et les
NucleoBond® Finalizer Larege respectivement.
Volume d’élution trop faible
Rendement
faible ou
nul après
utilisation du
NucleoBond®
Finalizer
•
Comme les volumes morts sont de l’ordre de 30 µL (NucleoBond®
Finalizer) et 60 µL (NucleoBond® Finalizer Large), les volumes
d’élution minimaux sont de l’ordre de 200 µL (NucleoBond®
Finalizer) et 400 µL (NucleoBond® Finalizer Large). Par ailleurs, des
volumes inférieurs sont insuffisant pour imprégner la totalité de la
membrane et induisent une perte de rendement significative. Voir le
paragraphe 4.13, Tableau 4 et 5 pour estimer le rendement attendu
en fonction du volume de tampon d’élution utilisé.
Elution trop rapide
•
L’ADN plasmidique nécessite un certain temps pour se dissoudre.
Eluer très doucement, au goutte à goutte. Répéter l’étape d’élution
en redéposant le premier éluat.
Omission de la seconde élution
•
Répéter la procédure d’élution une fois avec le premier éluat est
crucial pour des rendements optimaux. Eluer une troisième fois ne
présente pas d’avantage.
Taille des plasmides
•
40
L’efficacité de précipitation est quasiment indépendante de la
taille des plasmides, mais l’élution à partir des NucleoBond®
Finalizers est d’autant plus difficile que les vecteurs sont de grande
taille. Si vous vous confrontez à de faibles rendements avec des
constructions de grande taille comme des cosmides, essayer de
chauffer le NucleoBond® Finalizer, les seringues, et le tampon
d’élution à 70 °C.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
Problème
Cause possible et suggestions
Faible rendement global
•
Voir le chapitre ‘Guide de résolution des problèmes “Rendement
d’ADN plasmidique faible ou nul” et réduire le volume de tampon
d’élution. Voir le paragraphe 4.13, Tableaux 4 et 5 pour estimer les
concentrations d’ADN attendues.
Tampon d’élution frais utilisé pour la seconde étape d’élution
Faible
concentration
d’ADN après
utilisation du
NucleoBond®
Finalizer
•
La seconde étape d’élution est cruciale pour optimiser la
concentration d’ADN, mais doit s’effectuer avec l’éluat issue de la
première étape d’élution.
Quantité d’ADN chargée insuffisante
•
Etant donné le volume minimal d’élution de 200 µL (NucleoBond®
Finalizer) ou 400 µL (NucleoBond® Finalizer Large) lié au format
de la membrane et à la nécessité d’imprégner la totalité de
celle-ci, une quantité minimale d’ADN déposée est nécessaire
pour obtenir la concentration souhaitée. Si possible, combiner
plusieurs précipités sur le même filtre, le rendement d’élution et
la concentration de l’ADN augmentant significativement avec la
quantité d’ADN déposée.
Temps de dissolution trop court
•
Faible taux de
récupération
avec
l'utilisation du
Finalizer
Selon la quantité totale de plasmide précipité, le temps de remise
complète en suspension peut prendre un certain temps. Ce temps
de remise en suspension pour une récupération optimale peut
s’avérer trop court, si le tampon de dissolution est passé trop
rapidement sur la membrane du Finalizer.
Si une récupération élevée est nécessaire, il est recommandé
d'incuber le plasmide précipité avec le tampon de dissolution durant
l'étape d'élution.
Par conséquent, éviter de faire passer le tampon d'élution à
travers le Finalizer en une seule fois, et privilégier une incubation
du tampon de dissolution de 5 min à température ambiante sur la
membrane dès l'apparition de la première goutte avant de terminer
l'étape d'élution.
Rechargez l'éluat sur le Finalizer et répétez la procédure au moins
une fois.
Les recommandations générales doivent être appliquées : faire
passer lentement le tampon de dissolution à travers la membrane,
augmenter le volume d'élution pour obtenir une récupération plus
élevée et minimiser le volume mort en faisant passer de l'air à
travers le Finalizer.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
41
Purification de l’ADN plasmidique
Problème
Cause possible et suggestions
ADN plasmidique contaminé avec de l’ADN chromosomique ou de l’ARN
•
Voir les conseils ci-dessus.
ADN plasmidique contaminé avec de l’éthanol
•
L’ADN
plasmidique
n’est pas
performant
dans les
applications
ultérieures
L’ADN plasmidique n’a pas été séché complètement avant
dissolution. Précipiter à nouveau l’ADN avec 1 / 10ième volume
de NaAc 3M , pH 5.0 et 0.7 volumes d’isopropanol. Effectuer la
procédure de précipitation indiquée dans ce manuel et sécher le
culot d’ADN totalement.
ADN dégradé
•
Veiller à ce que tout l’équipement du laboratoire (pipettes,
centrifugeuse, tubes, etc.) soit propre et exempt de nucléases.
•
Ne pas lyser l’échantillon dans le tampon LYS pendant plus de
5 minutes.
L’ADN est irréversiblement dénaturé
•
8.2
Un plasmide dénaturé peut être visualiser par une bande migrant
sur gel d’agarose légèrement plus vite que la forme surenroulée. Ne
pas prolongée la lyse au-delà de 5 minutes avant ajout du tampon
NEU.
Informations de commande
Produit
NucleoBond® Xtra Midi
®
NucleoBond Xtra Midi Plus
(NucleoBond® Finalizers inclus)
NucleoBond® Xtra Maxi
NucleoBond® Xtra Maxi Plus
(NucleoBond® Finalizers Large inclus)
NucleoBond® Xtra Combi Rack
Référence MN
Conditionnement
740410.10 / .50 / .100
10 / 50 / 100 preps
740412.10 / .50
10 / 50 preps
740414.10 / .50 / .100
10 / 50 / 100 preps
740416.10 / .50
10 / 50 preps
740415
1
740417
1
740363.1000
1000 mL
NucleoBond® Xtra Buffer Set I
(Tampon RES, LYS (avec LyseControl),
NEU, RNase A ; utilisable uniquement
avec les kits NucleoBond® Xtra kits ; pour
12 Xtra Maxi et 18 Xtra Midi))
Tampon RES
42
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
Produit
Référence MN
Conditionnement
Tampon EQU
740317.1000
1000 mL
Tampon WASH
740375.1000
1000 mL
Tampon ELU
740316.600
600 mL
740519.20
20 filtres
2 jeux de seringues
740520.20
20 filtres
20 jeux de seringues
740418.20
20 filtres ‘Large’
2 jeux de seringues
(pour les kits NucleoBond® Xtra Maxi,
Maxi EF, NucleoBond® PC 2000, PC
2000 EF)
740419.20
20 filtres ‘Large’
20 jeux de seringues
RNase A (lyophilisée)
740505.50
740505
50 mg
100 mg
NucleoBond® Finalizer
(pour les kits NucleoBond® Xtra Midi,
Midi EF, NucleoBond® PC 100, PC 500,
PC 500 EF)
NucleoBond® Finalizer Plus
(pour les kits NucleoBond® Xtra Midi,
Midi EF, NucleoBond® PC 100, PC 500,
PC 500 EF)
NucleoBond® Finalizer Large
(pour les kits NucleoBond® Xtra Midi,
Midi EF, NucleoBond® PC 100, PC 500,
PC 500 EF)
NucleoBond® Finalizer Large Plus
Visitez www.mn-net.com pour plus d’informations concernant nos produits.
8.3
Restriction d’utilisation / garantie
Les kits NucleoBond® Xtra Midi / Maxi ont été développés, conçus et vendus UNIQUEMENT
À DES FINS DE RECHERCHE, à l'exception, toutefois, de toute autre fonction du produit
qui est expressément décrite dans les notices originales des produits MACHEREY-NAGEL.
Les produits MACHEREY-NAGEL sont destinés à une utilisation GÉNÉRALE en
LABORATOIRE UNIQUEMENT ! Les produits MACHEREY-NAGEL sont EXCLUSIVEMENT
destinés à un PERSONNEL QUALIFIÉ ! Lorsqu'ils manipulent des produits MACHEREYNAGEL, les utilisateurs doivent toujours porter des VÊTEMENTS DE PROTECTION
adéquats. Pour des informations détaillées, veuillez-vous référer à la fiche de données de
sécurité du produit ! Les produits MACHEREY-NAGEL doivent être utilisés exclusivement
dans un ENVIRONNEMENT DE TEST ADÉQUAT. MACHEREY-NAGEL décline toute
responsabilité pour les dommages dus à une utilisation incorrecte de ses produits dans
tous autres domaines d'application. L'application sur le corps humain est STRICTEMENT
INTERDITE. L'utilisateur est responsable de tous les dommages résultant d’une telle
application.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
43
Purification de l’ADN plasmidique
Les produits de purification d’ADN/ARN/PROTÉINES de MACHEREY-NAGEL conviennent
UNIQUEMENT aux UTILISATIONS IN VITRO !
SEULS les produits MACHEREY-NAGEL portant la mention « IVD » peuvent également
être utilisés pour le diagnostic IN VITRO. Veuillez prêter attention à l'emballage du produit.
La mention « IVD » doit figurer expressément sur l’emballage des produits de diagnostic IN
VITRO.
S'IL N'Y A PAS LA MENTION « IVD », LE PRODUIT NE PEUT PAS ÊTRE UTILISÉ POUR
LE DIAGNOSTIC IN-VITRO !
TOUS LES AUTRES PRODUITS NE PORTANT PAS LA MENTION « IVD » NE SONT PAS
ADAPTÉS À UN USAGE CLINIQUE (Y COMPRIS, MAIS SANS S’Y LIMITER, À UN USAGE
DIAGNOSTIQUE, THÉRAPEUTIQUE ET/OU PRONOSTIQUE).
Aucune revendication ni déclaration n’est prévue concernant son utilisation pour identifier un
organisme spécifique ou pour un usage clinique (y compris, mais sans s’y limiter, à des fins
diagnostiques, pronostiques, thérapeutiques ou dans les banques du sang). Il incombe plutôt
à l’utilisateur ou – dans tous les cas de revente des produits – au revendeur de contrôler et
de veiller à ce que les produits de purification d'ADN/ARN/protéines de MACHEREY-NAGEL
soient utilisés pour une application bien définie et spécifique.
MACHEREY-NAGEL est responsable uniquement des spécifications et des performances
des produits MN conformément aux spécifications de contrôle qualité interne, de la
documentation du produit et du matériel de marketing.
Ce produit MACHEREY-NAGEL est livré avec une documentation précisant les spécifications
et d’autres informations techniques. MACHEREY-NAGEL garantit la conformité du produit
aux spécifications déclarées. La seule obligation de MACHEREY-NAGEL et le seul recours du
client se limitent au remplacement gratuit des produits qui n’offriraient pas les performances
garanties. Il est également fait référence aux conditions générales de MACHEREY-NAGEL,
qui sont imprimées sur la liste tarifaire et dont un exemplaire sera remis sur simple demande.
MACHEREY-NAGEL ne saurait être tenu responsable : des dommages ou défauts se
produisant pendant le transport et la manipulation (hors assurance expédition du client), ou
par suite d’un accident ou d’une utilisation impropre ou anormale du présent produit ; des
défauts des produits ou des composants non fabriqués par MACHEREY-NAGEL ; ni des
dommages résultant de tels produits et composants de fabricants autres que MACHEREYNAGEL ; pour lesquels il n’existe aucune garantie.
MACHEREY-NAGEL n’accorde aucune autre garantie d’aucune sorte, et DÉCLINE
ET EXCLUT SPÉCIFIQUEMENT TOUTE AUTRE GARANTIE DE TOUTE SORTE OU
NATURE QUE CE SOIT, DIRECTEMENT OU INDIRECTEMENT, EXPRESSE OU
IMPLICITE, Y COMPRIS, SANS S’Y LIMITER, RELATIVE AU CARACTÈRE APPROPRIÉ,
À LA REPRODUCTIBILITÉ, LA DURABILITÉ, L’ADAPTATION À UN BUT OU UN USAGE
PARTICULIER, LA QUALITÉ MARCHANDE, L’ÉTAT OU TOUT AUTRE SUJET EN CE QUI
CONCERNE LES PRODUITS MACHEREY-NAGEL.
MACHEREY-NAGEL ne saurait en aucun cas être tenue pour responsable en cas de
réclamations pour tout autre dommage, qu’il soit direct, indirect, fortuit, compensatoire,
prévisible, consécutif ou particulier (y compris, mais sans s’y limiter, la perte d’utilisation,
de revenus ou de profits), que ce soit sur la base d’une garantie, d’un contrat, d’un délit civil
(y compris la négligence) ou d’une responsabilité stricte découlant de la vente ou du défaut
d’exécution d’un produit MACHEREY-NAGEL conformément aux spécifications énoncées.
44
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 17
Purification de l’ADN plasmidique
La garantie est exclusive et MACHEREY-NAGEL ne donne aucune autre garantie expresse
ou implicite.
La garantie fournie dans le présent document et les données, spécifications et descriptions de
ce produit MACHEREY-NAGEL figurant dans les catalogues publiés et la documentation sur
le produit de MACHEREY-NAGEL sont les seules représentations de MACHEREY-NAGEL
concernant le produit et la garantie. Aucune autre déclaration ou représentation, écrite ou
orale, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY-NAGEL, à l’exception
des déclarations écrites signées par un agent dûment agréé par MACHEREY-NAGEL, n’est
autorisée ; le client ne doit pas se fier à de telles déclarations ou représentations, lesquelles
ne font pas partie du contrat de vente ou de la présente garantie.
Les allégations relatives au produit sont susceptibles d’être modifiées. Nous vous invitons par
conséquent à contacter notre service d’assistance technique pour obtenir les informations
les plus récentes sur les produits MACHEREY-NAGEL. Vous pouvez également contacter
votre revendeur habituel, pour obtenir des informations scientifiques à caractère général.
Les applications mentionnées dans la documentation fournie par MACHEREY-NAGEL
le sont uniquement à titre informatif. MACHEREY-NAGEL ne garantit pas que toutes les
applications ont été testées dans les laboratoires de MACHEREY-NAGEL, avec les produits
MACHEREY-NAGEL. MACHEREY-NAGEL ne garantit en aucun cas le caractère correct de
ces applications.
Dernière mise à jour : 07/2010, Rév. 03
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NucleoSpin® est une marque déposée par MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
NucleoBond® est une marque déposée par MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG.
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45
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