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VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe
Cocktail
Guide d’interprétation pour le carcinome mammaire et
gastrique
Images de la page de garde et de la quatrième de couverture :
Grappes de HER2 et de chromosome 17, amplifiées
II
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Table des matières
Introduction1
Description générale du cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail
1
Objectif du Guide d’interprétation
2
Utilisation prévue
2
Que pouvez-vous attendre du test par VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail en termes
de performance dans votre laboratoire ?
3
Identification d’un profil de coloration approprié
4
Statut du gène HER2
4
Conformité des lames
9
Visualisation et comptage des signaux
12
Évaluation des lames
15
Exemples de profils de coloration du gène HER2 et du chromosome 17 dans des cas cliniques
17
Schémas de coloration courants
17
Autres observations
18
Aneusomie du chromosome 17
20
Amplification péricentromérique du chromosome 17
21
Contrôle qualité de la coloration ISH
22
Présence de noyaux de contrôle positif dans chaque échantillon
22
Lames de xénogreffe HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides
22
Éléments à prendre en compte avant l’analyse
24
Fixation24
Épaisseur des échantillons
25
Autres éléments à prendre en compte
26
Résolution des problèmes
27
Références34
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
III
IV
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Introduction
Description générale du cocktail de
sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA
Probe Cocktail
Le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe
Cocktail est conçu pour détecter de manière quantitative, par
microscopie optique, l’amplification du gène HER2 via une
technique d’hybridation in situ (ISH) chromogénique double
couleur dans des échantillons de tissus fixés au formol et inclus
en paraffine, issus de carcinomes mammaires et gastriques
humains, y compris de la jonction gastro-œsophagienne,
après coloration sur les instruments BenchMark IHC/ISH.
Ce produit doit être interprété par un anatomopathologiste
qualifié, en conjonction avec un examen histologique, les
informations cliniques pertinentes et des contrôles appropriés.
Le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe
Cocktail détermine le statut du gène HER2 en détectant : (1)
les copies du gène HER2 via une technique d’hybridation
in situ à l’argent (SISH - Silver In Situ Hybridization) et (2)
les copies du chromosome 17 (Chr17) par hybridation
in situ chromogénique rouge (Red ISH) sur une seule lame.
Avant d’interpréter les résultats, la coloration des noyaux
de contrôle positif interne doit être évaluée par un lecteur
qualifié et expérimenté en interprétation microscopique
des échantillons de carcinomes mammaires et gastriques,
en procédures ISH et en identification de copies uniques et
amplifiées du gène HER2 (qui peuvent nécessiter un examen
microscopique à un grossissement allant de 40x à 60x).
Le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe
Cocktail est un mélange de sondes oligonucléotides qui ciblent
spécifiquement le gène HER2 (également connu sous les
noms de ERBB2 et NEU) situé sur le Chr17 humain (17q12)
et la région centromérique du Chr17 qui sert de référence
pour l’aneusomie. Le produit est un réactif de sonde prédilué
destiné à être utilisé sur les instruments BenchMark IHC/ISH
avec le kit de détection VENTANA Silver ISH DNP Detection Kit,
le kit de détection VENTANA Red ISH DIG Detection Kit
et l’algorithme d’évaluation développé par Ventana.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
1
Objectif du Guide d’interprétation
Utilisation prévue
Ce guide a pour but de fournir aux lecteurs un outil pour faciliter
la détermination du statut du gène HER2 via l’interprétation
des profils de coloration du HER2 et du Chr17 obtenus
à l’aide du cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH
DNA Probe Cocktail. Les cas suivants illustrent la diversité
des profils de coloration susceptibles d’être observés dans
des échantillons de tissu mammaire ou gastrique après
coloration au moyen du cocktail de sondes VENTANA
HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail (Figures 2 à 23).
Consultez la notice du cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual
ISH DNA Probe Cocktail correspondante (réf. 1018383) pour plus
de détails sur l’utilisation prévue de ce produit.
Ces images permettent à un nouvel utilisateur de se
familiariser avec le spectre des profils de coloration
possibles : la coloration d’une copie unique du gène HER2
et du Chr17, la coloration de copies multiples et de
grappes, la polysomie du Chr17, ainsi que la coloration
des artéfacts susceptibles d’être rencontrés. De plus, ces
images aideront à déterminer la conformité des lames, le
comptage des nombres de copies à l’aide d’un algorithme
d’évaluation et la résolution des problèmes liés à l’analyse.
Toute coloration effectuée dans le laboratoire de l’utilisateur final
doit être interprétée en tenant compte des noyaux de contrôle
positif interne qui sont présents dans chaque cas clinique.
Pour plus d’informations, consultez la notice (réf. 1018383)
disponible en ligne (www.ventana.com), ainsi que les sections
Contrôle qualité et Conformité des lames du présent guide.
Les images figurant dans le présent guide d’interprétation
proviennent d’échantillons colorés à l’aide du cocktail de
sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail,
développé et validé sur les BenchMark IHC/ISH Instruments.
2
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Que pouvez-vous attendre du test par
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe
Cocktail en termes de performance dans
votre laboratoire ?
Il est recommandé de fixer les tissus dans du formol neutre
tamponné à 10 % (NBF) pendant 6 à 72 heures, de les inclure
en paraffine et de réaliser des coupes d’environ quatre microns
d’épaisseur.1-2 Les protocoles de coloration spécifiques pour
le carcinome mammaire ou gastrique ont été optimisés pour
ces conditions de fixation ; consultez la notice de la sonde
(réf. 1018383) pour les paramètres du protocole. Des études
indiquent que la majorité des résultats non concluants concernant
le gène HER2 sont liés à des facteurs pré-analytiques, notamment
une sous-fixation et une surfixation3, ainsi qu’un retard de
fixation.4 Bien qu’il soit possible de mettre en œuvre de manière
stricte les conditions de fixation appropriées,3 il est difficile de
contrôler précisément le temps de fixation des tissus dans les
laboratoires de référence recevant des échantillons provenant
de diverses sources. Afin de compenser les variations liées
aux tissus, notamment les facteurs pré-analytiques variables,
cette analyse a été développée avec un certain nombre
d’étapes de protocole personnalisables pour le prétraitement.
Ces options peuvent permettre d’optimiser l’analyse selon les
besoins en tenant compte de la spécificité des échantillons.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
3
Identification d’un profil de coloration
approprié
Statut du gène HER2
Chez l’homme, le gène HER2, situé sur le Chr17, code pour la
protéine HER2. Une amplification du gène HER2 est observée dans
environ 15 à 25 % des cas de carcinome mammaire et est associée
à une agressivité de la tumeur.5-9 De nombreux essais cliniques ont
démontré que l’amplification et/ou la surexpression du gène HER2 sont
corrélées à des résultats cliniques médiocres chez la femme atteinte
d’un carcinome mammaire invasif et rattachées à plusieurs facteurs
pronostiques défavorables, notamment un statut négatif du récepteur
des œstrogènes (ER), une fraction des cellules en phase S importante,
un statut ganglionnaire positif, une mutation de la protéine p53 et
un grade nucléaire élevé.10-11 De plus, de récentes études indiquent
que le gène HER2 est surexprimé dans 24 % des cas de carcinome
gastrique.12 Vous trouverez dans ce guide d’interprétation des
exemples de colorations effectuées avec le cocktail VENTANA HER2
Dual ISH DNA Probe Cocktail sur des carcinomes mammaires
et gastriques (Figures 2 et 3). L’ensemble des instructions sur les
éléments à prendre en compte avant l’analyse, sur le comptage et sur la
résolution de problèmes dont il est question dans ce guide s’applique
aux échantillons tissulaires de carcinomes mammaires et gastriques.
Le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail
a été conçu pour permettre de co-hybrider et de visualiser par
microscopie optique le gène HER2 et le centromère du Chr17 sur
une même lame. Le gène HER2 est détecté par une sonde marquée
au dinitrophényle (DNP) et visualisé à l’aide du kit de détection
VENTANA Silver ISH DNP Detection Kit (Figure 1A). Le centromère
du Chr17 est détecté à l’aide d’une sonde marquée à la digoxygénine
(DIG) et visualisé à l’aide du kit de détection VENTANA Red ISH DIG
Detection Kit (Figure 1B). Consultez les notices des kits de détection
(réf. 1018384 et 1018385) pour de plus amples informations.
Les lames colorées à l’aide du cocktail de sondes VENTANA HER2
Dual ISH DNA Probe Cocktail sont visualisées par microscopie
optique, le gène HER2 apparaissant sous la forme de signaux
noirs distincts (SISH) et le Chr17 apparaissant sous la forme de
signaux rouges (Red ISH) dans les noyaux des cellules normales
(servant de contrôle positif interne pour la coloration), ainsi que
des cellules cancéreuses. Cette stratégie permet de déterminer
le statut du gène HER2 à son état chromosomique, à l’aide d’un
microscope optique standard à grossissement 20x, 40x ou 60x.
Ventana Medical Systems, Inc. (« Ventana ») a développé un
algorithme d’évaluation quantitative permettant de déterminer le statut
du gène HER2 après coloration par le cocktail de sondes VENTANA
HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail. Cet algorithme est décrit de
façon détaillée à la section Évaluation des lames (Figure 7). Le statut
du gène HER2 est déterminé comme une fonction du rapport entre
le nombre de copies du gène HER2 et le nombre de copies du Chr17
dans les noyaux des cellules issues d’un carcinome gastrique ou
mammaire invasif. Le statut du gène HER2 peut être défini comme non
amplifié (ratio HER2/Chr17 < 2,0 : Figure 2, cas 1) ou amplifié (ratio
HER2/Chr17 ≥ 2,0 : Figure 2, cas 3). Il convient d’agir avec précaution
pour les cas dont le ratio se situe entre 1,8 et 2,2.1 Les Figures 2, 3 et
6 reproduisent des exemples illustrant les différents statuts HER2.
Figure 1. Cocktail de sondes et systèmes de détection
A. Sonde HER2 marquée au DNP et VENTANA Silver ISH
B. Sonde Chr17 marquée à la DIG et VENTANA Red ISH DIG
DNP Detection Kit
Detection Kit
3, 4, 5 : Silver Reagents A, B, C
1 : Anticorps
anti-DNP
marqué
à l’HQ
Signal SISH
2 : Anticorps HRP anti-HQ
DNP
Sonde HER2 marquée au DNP
4
3, 4, 5 : pH Enhancer, Naphthol, Fast Red
1 : Anticorps
anti-DIG
marqué
au NP
Signal Red ISH
2 : Anticorps AP anti-NP
DIG
Sonde Chr17 marquée à la DIG
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Figure 2. Cas représentatifs du statut du gène HER2 dans des carcinomes mammaires et gastriques
Cas 1. Carcinome mammaire : gène HER2 non amplifié
H&E 60x
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; des signaux
SISH et Red ISH distincts sont visibles, à raison de 1 à 2 copies par
cellule tumorale.
Cas 2. Carcinome mammaire : non amplifié, plusieurs copies de HER2 et du Chr17
H&E 60x
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; plus de
2 signaux SISH et Red ISH présents dans certaines cellules
tumorales.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
5
Cas 3. Carcinome mammaire : amplifié, avec grappes SISH (HER2)
H&E 60x
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; des grappes
SISH (HER2) sont présentes et évaluées par le lecteur. On observe
1 à 2 copies du signal Red ISH pour le Chr17.
Cas 4. Carcinome mammaire : faiblement amplifié, avec plusieurs copies uniques du gène HER2
H&E 60x
6
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; on observe plus
de 6 copies du gène HER2, mais seulement 1 à 2 copies du Chr17,
en moyenne. Ce cas est faiblement amplifié.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Cas 5. Carcinome gastrique : non amplifié
H&E 60x
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; des signaux
SISH et Red ISH distincts sont visibles, à raison de 1 à 2 copies par
cellule tumorale.
Cas 6. Carcinome gastrique : non amplifié, plusieurs copies de HER2 et du Chr17
H&E 60x
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; plus de
2 copies du gène HER2 et du Chr17 dans certaines cellules.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
7
Cas 7. Carcinome gastrique : amplifié, avec grappes SISH (HER2)
H&E 60x
8
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; des grappes
SISH (HER2) sont présentes et évaluées par le lecteur. On observe
1 à 2 copies du signal Red ISH pour le Chr17.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Conformité des lames
Avant de compter les signaux HER2 et Chr17 pour déterminer le
statut du gène HER2, il est primordial de s’assurer que la zone
cible invasive (tissu lésionnel) est correctement colorée et qu’elle
répond aux critères décrits ci-dessous. Si la cible ne permet pas le
comptage, l’utilisateur doit se reporter à la section Résolution des
problèmes et évaluer les paramètres requis pour procéder à une
nouvelle coloration du tissu du patient.
Critère 1. La coloration des contrôles positifs internes
doit être présente
Les signaux HER2 et Chr17 présents dans les noyaux non
néoplasiques (une à deux copies par cellule visibles sous forme
de coloration de type « copies uniques » distinctes) jouent le
rôle de contrôles positifs internes physiologiques « intra-lame »
et doivent pouvoir être visualisés à un grossissement 20x, 40x
ou 60x. L’utilisation d’un objectif 100x n’est pas recommandée.
Cette coloration nucléaire distincte apparaît généralement
dans les cellules normales situées dans et/ou autour de la zone
cible, notamment dans les fibroblastes stromaux, les cellules
endothéliales, les lymphocytes et les cellules épithéliales normales
(voir Figure 3). Les artéfacts de troncature dans le plan de coupe
ne permettent généralement pas de visualiser les signaux
uniques HER2 ou Chr17 dans toutes les cellules présentes sur la
lame, ni dans toutes les régions du tissu. Cependant, un comptage
précis nécessite que les signaux de copies uniques soient visibles
dans les cellules normales présentes dans et/ou autour de la zone
cible. Au moins 50 % des noyaux cellulaires normaux doivent
comporter au moins un signal SISH et au moins 50 % d’entre eux
doivent comporter au moins un signal Red ISH (les signaux SISH
et Red ISH ne doivent pas nécessairement se trouver dans les
mêmes cellules) pour que la zone cible soit considérée comme
adéquate. Si une zone cible donnée est considérée comme trop
faiblement colorée pour être comptée, il est souvent possible de
procéder au comptage d’une autre zone cible sur la même lame.
Si la coloration de toutes les autres zones de taille supérieure est
insuffisante, la lame est considérée comme inadéquate et ne peut
pas faire l’objet d’un comptage.
Critère 2. La coloration des cellules de carcinome mamaire
ou gastrique invasif présentes dans la zone cible doit
permettre un comptage
À un grossissement 20x, 40x et/ou 60x, les cellules de carcinome
mammaire ou gastrique invasif présentes dans la zone cible
doivent inclure un ensemble comptable de signaux HER2 (SISH)
et Chr17 (Red ISH). En raison de l’hétérogénéité biologique et
du plan de coupe, il est possible que certains noyaux tumoraux
ne contiennent pas de signal. Cependant, il est important que la
zone cible contienne une région acceptable pouvant donner lieu
au comptage. Si une zone cible donnée est considérée comme
étant trop faiblement colorée pour être comptée, il est souvent
possible de procéder au comptage d’une autre zone cible sur
la même lame. Si la coloration de toutes les autres zones de
taille supérieure est insuffisante, la lame est considérée comme
inadéquate et ne peut pas faire l’objet d’un comptage.
Critère 3. Le bruit de fond ne doit pas interférer avec
le comptage
Enfin, tout bruit de fond provenant des systèmes de détection SISH
ou Red ISH devra être évalué pour déterminer s’il interfère avec le
comptage des signaux SISH ou Red ISH spécifiques. Le bruit de
fond associé à la coloration SISH apparaît généralement sous
forme de « poussière » SISH qui se distingue des signaux
spécifiques (Figure 18).
Le fond rouge peut apparaître sous la forme d’une brume rouge
ou, plus rarement, de signaux non spécifiques dont l’intensité est
plus faible par rapport au signal spécifique (Figures 19 et 20).
La Figure 3 contient des exemples de cas présentant une
coloration du contrôle positif interne adéquate, qui serait
considérée comme appropriée pour le comptage.
La Figure 4 présente des exemples de cas inadéquats en raison de
l’absence de coloration SISH ou Red ISH des noyaux de contrôle
positif, ainsi que des noyaux tumoraux. Ces cas exigent donc une
nouvelle coloration avant de procéder au comptage.
La Figure 5 présente un cas inadéquat en raison de l’absence de
coloration dans les noyaux de contrôle positif. Aucun comptage
ne peut donc être effectué sur ce cas, qui doit faire l’objet d’une
nouvelle coloration.
Reportez-vous à la section Résolution des problèmes pour plus
d’informations sur la répétition de la coloration des échantillons
pour lesquels un comptage est impossible.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
9
Figure 3. Coloration adéquate dans les noyaux de contrôle positif interne
Cas 8. Carcinome mammaire : non amplifié
Cas 9. Carcinome mammaire : plusieurs copies du gène HER2
A
A
A
A
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; non amplifié
pour HER2. A : noyaux de contrôle positif interne.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; plusieurs
copies du gène HER2. A : noyaux de contrôle positif interne.
Cas 10. Carcinome mammaire : amplifié
A
A
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; HER2 amplifié
avec des grappes SISH. A : noyaux de contrôle positif interne.
10
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Figure 4. Lame inadéquate en raison de l’absence de coloration SISH ou Red ISH
Cas 11. Carcinome mammaire : coloration Red ISH inadéquate
Cas 12. Carcinome mammaire : coloration SISH inadéquate
A
A
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; lame
inadéquate en raison d’une coloration Red ISH faible ou inexistante
dans les noyaux de contrôle positif interne et les noyaux tumoraux.
A : noyaux de contrôle positif interne.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; lame
inadéquate en raison de l’absence de coloration SISH dans
les noyaux de contrôle positif interne et les noyaux tumoraux.
A : noyaux de contrôle positif interne.
Figure 5. Lame inadéquate en raison de l’absence
de coloration des noyaux de contrôle positif
Cas 13. Carcinome mammaire : coloration SISH et Red ISH
inadéquate
A
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; lame
inadéquate en raison de l’absence de coloration SISH et Red ISH
dans les noyaux de contrôle positif. A : les noyaux de contrôle
positif interne montrent une coloration SISH et Red ISH faible ou
inexistante, bien que les cellules tumorales soient colorées par les
deux sondes. Ce cas ne peut être compté.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
11
Visualisation et comptage des signaux
Figure 6. Visualisation des signaux
Les signaux ISH sont visualisés sous forme de copies uniques,
de copies multiples et de grappes (Figure 6 et Tableau 1).
Les copies uniques présentes dans les cellules normales
sont utilisées comme référence pour compter les signaux
dans le noyau du carcinome. Les signaux doivent être
visualisés à un grossissement 20x, 40x ou 60x. L’utilisation
d’un grossissement 100x n’est pas recommandée.
Cas 14. Carcinome mammaire : copies uniques
Copie unique
Un signal distinct est compté comme une copie unique du
gène HER2 ou du Chr17. Les signaux uniques distincts visualisés
dans les noyaux de contrôle positif interne correspondent
à la taille d’une copie unique dans les cellules cancéreuses
(Figures 2, 3 et 6). Les noyaux de contrôle positif interne se
trouvent dans les cellules stromales normales adjacentes (par
exemple, les fibroblastes/fibrocytes et les cellules endothéliales),
les leucocytes (par exemple, les lymphocytes et les macrophages)
et l’épithélium normal. Il est important de noter que la taille
des signaux distincts correspondant à une copie unique du
gène HER2 ou du Chr17 peut varier d’un échantillon de patient
à un autre. De plus, les signaux SISH (noirs) sont généralement
plus petits en taille et mieux visibles que les signaux Red ISH
(rouges), en raison de différences liées à la taille des cibles et aux
solutions chimiques de détection. C’est pourquoi il est important
d’utiliser les signaux uniques visibles dans les noyaux de contrôle
positif interne (contrôle physiologique) qui se trouvent à côté de
la zone cible (lésion pathologique) comme référence pour évaluer
la taille des signaux. Les signaux Red ISH peuvent apparaître
plus importants que les signaux SISH, et être parfois de forme
allongée ; leur taille peut également varier dans la zone cible et
d’un échantillon à l’autre.
Copies multiples
Comme décrit ci-dessus, les signaux rouges (Red ISH) et les
signaux noirs (SISH) distincts visualisés dans les noyaux de
contrôle positif interne représentent la taille d’une copie unique
dans les cellules de carcinome invasif. Les cas 2, 4, 6, 9, 15 et 18
présentés aux Figures 2, 3, 6 et 8 montrent un certain nombre de
noyaux dans lesquels on observe plusieurs copies distinctes dans
les noyaux du carcinome.
12
du gène HER2, non amplifiées
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; copies uniques
du gène HER2, non amplifiées.
Cas 15. Carcinome mammaire : plusieurs copies uniques du
gène HER2, faiblement amplifiées
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; plusieurs
copies uniques du gène HER2, faiblement amplifiées.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Grappes
Une grappe est définie comme un certain nombre de signaux
SISH se chevauchant dans le noyau et qu’il est difficile de
distinguer individuellement. Comme elles sont difficiles à
compter précisément, le nombre de copies du gène HER2 dans
une grappe peut seulement être estimé. Par exemple, le nombre
de signaux peut être évaluée à 6 dans une petite grappe et à
12 dans une grappe plus grosse. Il est possible d’observer dans
un même noyau plusieurs petites grappes, plusieurs grosses
grappes, un ensemble de petites et de grosses grappes et/ou
des grappes et des signaux uniques. Les cas 3, 7, 10, 16 et 19
des Figures 2, 3, 6 et 8 illustrent des exemples de noyaux dans
lesquels des grappes sont visibles. Plus rarement, des grappes
de signaux Red ISH peuvent être observées, voir la section
« Amplification péricentromérique du chromosome 17 ».
Cas 16. Carcinome mammaire : grappes SISH, HER2 amplifié
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; grappes
SISH, HER2 amplifié.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
13
Tableau 1 : Visualisation des signaux
Si les noyaux se chevauchent, ne pas compter.
Les petites grappes SISH ne peuvent être
estimées que d’après la taille d’un signal
unique. Utiliser les cellules stromales pour
estimer la taille du signal (plus petite cellule).
Par exemple, cette grappe peut être estimée
comme correspondant à 6 signaux SISH ; en
ajoutant les 2 autres signaux isolés, on obtient
un total de 8. Compter comme 2 signaux
rouges. Noter sur la feuille de notation la
présence de grappes pour HER2.
En l’absence de signaux, ne pas compter.
Estimer la grosse grappe. Ici, la grappe
peut être estimée comme correspondant à
12 signaux noirs ; en ajoutant les 4 autres
signaux isolés, on obtient un total de 16.
Compter les signaux rouges comme 2 copies
du Chr17. Noter sur la feuille de notation la
présence de grappes pour HER2.
En présence d’un seul signal ou d’une seule
couleur, ne pas compter.
Un signal rouge proche d’un signal noir doit
être compté comme un signal rouge et un
signal noir. Il peut être nécessaire de recourir
à un grossissement 60x pour distinguer et
compter les signaux. Par conséquent, compter
comme 4 signaux noirs et 2 signaux rouges.
En cas de chevauchement des signaux les
rendant impossibles à distinguer, ne pas
compter ce noyau.
Si les signaux sont à l’extérieur des noyaux,
ne pas compter.
La grappe de signaux noirs assombrit le
signal/les signaux rouge(s). Un grossissement
plus important (60x) peut être utilisé pour
tenter de confirmer la présence ou l’absence
de signaux rouges ; sinon, ne pas compter :
toujours compter les noyaux comportant des
signaux rouges francs. Noter sur la feuille de
notation la présence de grappes SISH. Les
noyaux présentant des signaux rouges visibles
et en nombre plus élevé doivent être comptés
comme des noyaux à grappes SISH.
Compter comme 1 signal noir (HER2)
et 1 signal rouge (Chr17).
Si une « poussière » SISH de fond apparaît
dans les noyaux, compter uniquement si l’on
peut facilement distinguer les signaux noirs
spécifiques (HER2) par rapport au fond.
Compter comme 2 signaux noirs (HER2)
et 2 signaux rouges (Chr17).
Une brume rouge peut être observée mais
ne doit pas être confondue avec des signaux.
De petits signaux Red ISH légers peuvent
être observés et représenter une liaison
non spécifique de la sonde Chr17 à d’autres
chromosomes. L’image montre 2 signaux
rouges (Chr17) distincts et 2 signaux
noirs (HER2).
Compter comme 1 signal noir (HER2) et
2 signaux rouges (Chr17). Le signal noir est un
doublet. Ne compter deux signaux adjacents
de la même couleur que si la distance entre
les signaux est supérieure ou égale au
diamètre d’un seul signal.
14
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Évaluation des lames
Un algorithme d’évaluation quantitative a été développé,
optimisant la précision et l’efficacité de la détermination du
statut du gène HER2. Une fois la zone cible adéquate identifiée,
le lecteur consigne le nombre de copies HER2 et Chr17 présentes
dans 20 noyaux représentatifs. Si le ratio HER2/Chr17 obtenu est
compris entre 1,8 et 2,2 (inclus), il est recommandé au lecteur de
procéder au comptage de 20 autres noyaux afin de calculer ce ratio
sur 40 noyaux au total. Le statut du gène HER2 est alors déclaré
comme non amplifié (HER2/Chr17 < 2,0) ou amplifié (HER2/Chr17
≥ 2,0). La Figure 7 illustre le schéma de principe de l’algorithme
d’évaluation.
Figure 7. Schéma de principe de l’algorithme d’évaluation
Départ
Lame colorée
HER2/Chr17
Lame
conforme ?
Non
Non conforme
Refaire la coloration avec
une nouvelle lame
Oui
Identifier et sélectionner la zone cible
Compter les signaux HER2 et Chr17 dans 20 noyaux
Calculer le ratio HER2/Chr17 en divisant le
nombre total de signaux HER2 dans la zone
cible 1 par le nombre total de signaux Chr17
dans la zone cible 1
Le ratio
HER2/Chr17 est-il
compris entre 1,8 et 2,2
(inclus) ?
Oui
Non
Compter 20 noyaux
supplémentaires dans
la zone cible 2
Calculer le ratio HER2/Chr17
en divisant le nombre total de
signaux HER2 dans les zones
cibles 1 et 2 par le nombre
total de signaux Chr17 dans
les zones cibles 1 et 2
Indiquer les
résultats
Non amplifiés
Ratio HER2/Chr17 < 2,0
Amplifiés
Ratio HER2/Chr17 ≥ 2,0
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
15
Résumé de l’évaluation
Lorsqu’une zone cible présentant une coloration adéquate est
localisée, seules les cellules tumorales invasives et représentatives
contenant à la fois des signaux SISH (HER2) et Red ISH (Chr17)
doivent être comptées. Le comptage des signaux ne doit pas avoir lieu
dans les zones qui présentent les caractéristiques suivantes : faiblesse
ou absence de signaux SISH ou Red ISH, absence de coloration
des cellules de contrôle interne, compression ou superposition des
noyaux, présence d’un bruit de fond Red ISH ou SISH excessif ou
d’une nécrose. De plus, le comptage des signaux ne doit pas être
effectué dans les noyaux non représentatifs de la population générale
des noyaux tumoraux invasifs dans la zone cible. Par exemple, les
noyaux anormalement gros (taille deux fois supérieure ou plus aux
autres noyaux tumoraux présents dans le champ) ou trop petits
(environ deux fois moins gros que les autres noyaux tumoraux) ne
doivent pas être pris en compte. Enfin, compter uniquement les
noyaux représentatifs des noyaux de carcinome invasif avec le plus
grand nombre moyen de signaux SISH et Red ISH. L’hétérogénéité
est discutée plus en détails à la section Autres observations.
gène HER2 et du Chr17.
3. Pour chaque échantillon, identifiez au sein de la région invasive
20 noyaux représentatifs ayant les caractéristiques suivantes :
• Les noyaux ne sont pas significativement plus gros ou plus
petits que le diamètre médian des noyaux tumoraux moyens.
• Les cellules choisies ne doivent pas se superposer à d’autres
cellules, mais peuvent présenter un chevauchement minime.
• En cas de chevauchement des signaux Red ISH et SISH,
le lecteur peut être amené à examiner ces signaux à un
grossissement 60x pour pouvoir les discerner.
• Les noyaux trop digérés, qui présentent des « bulles »,
ou qui se trouvent dans des zones présentant une coloration
non spécifique sur la lame, susceptibles de gêner le
Pour évaluer une lame colorée avec le cocktail de sondes VENTANA
HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, procédez comme suit :
comptage, ne doivent pas être pris en compte. Reportez-
1. Examinez la lame colorée à l’hématoxyline-éosine (H&E) afin
illustrations de ces types de noyaux. Consultez également
de localiser les zones contenant des cellules de carcinome
mammaire ou gastrique invasif.
2. Examinez la lame colorée HER2 Dual ISH correspondant à
la coloration H&E et identifiez une zone cible contenant des
cellules de carcinome mammaire ou gastrique invasif dans
laquelle :
vous à la section Résolution des problèmes pour voir des
la section Facteurs pré-analytiques.
• Les noyaux sont représentatifs des noyaux de carcinome
invasif avec le plus grand nombre moyen de signaux
SISH et Red ISH.
• Notez la présence de grappes HER2 et estimez le nombre
• la majorité des cellules de la zone choisie présentent des
de copies d’après la taille d’une copie unique. Notez que le
signaux d’hybridation SISH et Red ISH non obscurcis par un
nombre le plus élevé de signaux Red ISH visibles dans les
bruit de fond non spécifique ;
noyaux incluant des grappes SISH doit être comptabilisé.
• on observe des cellules du contrôle positif interne dans
4. Déterminez le nombre total de copies du gène HER2 et du
chaque zone adjacente à la zone tumorale à évaluer
Chr17 et calculez le ratio correspondant. Si le rapport est
(Remarque : la coloration des cellules du contrôle positif
compris entre 1,8 et 2,2 (inclus), vous devez procéder à un
interne ne s’applique pas aux xénogreffes, car les xénogreffes
nouveau comptage sur 20 autres noyaux, afin de calculer
sont constituées de lignées de cellules tumorales humaines
le ratio sur la base de 40 noyaux.
cultivées chez la souris. Par conséquent, les cellules
non tumorales sont des cellules de souris contenant des
séquences HER2 et de Chr17 de souris qui ne seront
détectées par aucune des deux sondes.) ;
• la zone est considérée comme adaptée au comptage si
plusieurs cellules normales (y compris les fibroblastes
stromaux, les cellules endothéliales, les lymphocytes et autres
cellules non néoplasiques) présentent une à deux copies du
16
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Exemples de profils de coloration du gène HER2
et du chromosome 17 dans des cas cliniques
Les images suivantes (Figures 8 à 11) sont fournies pour illustrer
divers profils de coloration susceptibles d’être obtenus au
moyen du cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA
Probe Cocktail sur des échantillons de carcinome mammaire
ou gastrique. Ces images ont pour but de permettre au nouvel
utilisateur du test de se familiariser avec les divers schémas de
coloration qu’il est susceptible de rencontrer. Toute coloration
réalisée dans le laboratoire de l’utilisateur final doit être interprétée
par rapport aux noyaux de contrôle positif interne et aux contrôles
effectués sur les cas cliniques au moment de leur évaluation (voir
la section Contrôle qualité).
Schémas de coloration courants
Figure 8. Cas amplifiés, non amplifiés et copies multiples
Cas 17. Carcinome mammaire : non amplifié
H&E 60x
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; copies uniques
du gène HER2, non amplifiées.
Cas 18. Carcinome mammaire : plusieurs copies
H&E 60x
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; plusieurs copies
uniques du gène HER2, plusieurs copies distinctes du gène HER2
et du Chr17 qui doivent faire l’objet d’un comptage minutieux.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
17
Cas 19. Carcinome mammaire : amplifié
H&E 60x
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; grappes HER2,
amplifiées.
Autres observations
Les observations différant des schémas de coloration courants
(Figure 8) pour la coloration du gène HER2 et du Chr17 peuvent
être significatives d’un point de vue clinique et doivent être
notées sous forme de commentaires dans le compte-rendu de
l’anatomopathologiste.
Hétérogénéité
Les échantillons de tissu peuvent contenir des noyaux tumoraux
mammaires ou gastriques présentant une hétérogénéité génétique
du nombre de copies du gène HER2. Dans ces cas, on peut
observer un mélange de noyaux amplifiés pour le gène HER2 et
non amplifiés pour le gène HER2 (Figure 9). Ceci peut se voir parmi
les cellules cancéreuses dans la même zone cible ou entre deux
zones cibles différentes dans le tissu. Il est recommandé de choisir
les noyaux présentant le plus grand nombre de copies HER2
pour le comptage. Une attention particulière doit également être
accordée à la sélection des cellules présentant des nombres
représentatifs de copies du Chr17. L’hétérogénéité du nombre
relatif de copies doit être notée dans le rapport du patient.
Figure 9. Hétérogénéité
Cas 20. Carcinome mammaire
A
B
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; nombre de
copies HER2 hétérogène dans une zone cible. A : grand nombre de
copies du gène HER2 et polysomie apparente du Chr17. B : faible
nombre de copies du gène HER2.
Carcinome mammaire invasif et carcinome canalaire in situ
D’un point de vue clinique, les copies du gène HER2 et du
Chr17 ne doivent être comptées qu’en cas de carcinome invasif.
La coloration d’un carcinome canalaire in situ (DCIS) dans des
tissus mammaires ne doit pas faire l’objet d’un comptage. Il est
conseillé au lecteur de se reporter à la lame H&E correspondante
pour déterminer les zones cibles à compter sur la lame colorée
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail (Figure 10).
18
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Figure 10. Carcinome invasif et carcinome canalaire in situ dans des tissus mammaires
Cas 21. Carcinome mammaire
A
B
H&E 4x ; carcinome canalaire in situ et carcinome invasif.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 4x ; carcinome
canalaire in situ (A) et carcinome invasif (B).
(A) Carcinome canalaire in situ
(B) Carcinome invasif
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; HER2 amplifié.
Le carcinome canalaire in situ ne doit pas faire l’objet d’un
comptage.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; HER2 amplifié.
Le comptage est effectué dans le carcinome invasif.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
19
Aneusomie du chromosome 17
Monosomie
La monosomie est un état dans lequel le noyau tumoral ne
contient en moyenne qu’une seule copie du Chr17.
On observe environ une copie du gène HER2 dans le cas 22
(Figure 11), mais il est à noter que Chr17 est également
monosomique. Il s’agit donc ici d’une perte de matériel génétique
du chromosome. Le compte-rendu du cas 22 doit donc
mentionner une monosomie 17.
Polysomie
La polysomie est un état dans lequel le noyau tumoral contient au
moins une copie excédentaire du chromosome par rapport à un
noyau normal.13 Ces noyaux polysomiques peuvent inclure trois
copies ou plus du Chr17 (Figure 11, cas 23). Ils ne doivent pas être
confondus avec les noyaux diploïdes en division présents dans
tout le tissu et qui contiennent trois à quatre copies du Chr17. Le
cas 23 présente plusieurs copies du gène HER2, mais on observe
également une polysomie du Chr17 concomitante.
Figure 11. Aneusomie du chromosome 17
Cas 22. Carcinome mammaire
Cas 23. Carcinome mammaire
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; monosomie. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; polysomie,
Perte d’une copie de Chr17 et du gène HER2 associé.
plusieurs copies distinctes du gène HER2 et du Chr17. Le comptage
de ce cas en vue de déterminer le statut d’amplification doit être
effectué avec précaution.
20
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Amplification péricentromérique
du chromosome 17
Des cas d’« amplification » apparente, de grappes ou de
polysomie du Chr17 (avec ou sans grappes HER2 évidentes)
ont été signalés.13-14 Dans le cas 24, le gène HER2 est
manifestement amplifié et le Chr17 montre également un profil
de coloration en grappes pour le signal Red ISH (Figure 11).
Même si le gène HER2 et le Chr17 apparaissent sous forme de
grappes, il faut veiller à ne pas considérer ce cas comme une
non‑amplification du gène HER2 avec un ratio d’environ 1,0.
Dans les cas d’amplification évidente du Chr17, le lecteur doit
indiquer le score VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail
et les profils de coloration associés aux deux sondes, mais il
doit également se reporter à l’immunohistochimie (IHC) lors
de la consignation des résultats. D’après notre expérience,
la majorité de ces cas où HER2 et Chr17 apparaissent en
grappes ont tendance à présenter une surexpression de la
protéine (3+ par coloration IHC), voir la Figure 11, cas 24b.
Figure 11. Aneusomie du chromosome 17 (suite)
Cas 24a. Carcinome mammaire
Cas 24b. Carcinome mammaire
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; HER2 amplifié
avec amplification péricentromérique du Chr17.
IHC 60x ; coloration HER2/neu 4B5, 3+ par IHC, HER2 surexprimé.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
21
Contrôle qualité de la coloration ISH
Présence de noyaux de contrôle positif
dans chaque échantillon
Lames de xénogreffe HER2 Dual ISH
3-in-1 Xenograft Slides
Comme indiqué à la section Conformité des lames, les signaux
normaux associés au gène HER2 (SISH) et au Chr17 (Red ISH)
(une à deux copies par cellule) jouent le rôle de contrôles
positifs internes « intra-lame » pour chaque cas et doivent être
visibles dans l’échantillon. La coloration nucléaire spécifique du
gène HER2 et du Chr17 doit être repérable dans diverses cellules,
notamment les fibroblastes stromaux, les cellules endothéliales,
les lymphocytes et les cellules épithéliales non néoplasiques.
Néanmoins, il est possible que certaines cellules ne présentent
pas de copies uniques du gène compte tenu de l’hétérogénéité
biologique et du plan de coupe. Comme le gène HER2 et le
Chr17 sont présents dans chaque cellule humaine, il n’y a
pas de véritable contrôle négatif interne.
Les lames de xénogreffe HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides
doivent être utilisées lors de la première mise en place du test et/
ou lors des opérations de résolution de problèmes en association
avec le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe
Cocktail sur les appareils BenchMark IHC/ISH.
Un contrôle positif peut être inclus dans chaque cycle de
coloration réalisé si l’utilisateur le souhaite. Les contrôles
permettent de s’assurer que les réactifs et l’appareil fonctionnent
correctement. Il est important de définir les conditions de
coloration optimales sur des échantillons de contrôle avant
d’analyser les échantillons prélevés sur le patient. Les contrôles
positifs peuvent inclure des échantillons préparés de la même
façon que les échantillons des patients à tester. Ces échantillons
peuvent être utiles car ils servent de contrôles qualité à chaque
étape de la procédure, de la préparation des échantillons
pré-analytiques au processus de coloration. L’utilisation d’un
échantillon préparé différemment des échantillons analysés
fournira un contrôle pour les réactifs, l’instrument et les
procédures employés, mais pas pour la fixation ni le traitement
de l’échantillon. Ces contrôles ne doivent pas remplacer
l’évaluation adaptée des contrôles positifs internes dans
chaque échantillon de patient.
Les lames de xénogreffe HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides
contiennent trois noyaux xénogreffés différents fixés au formol
et inclus dans un seul bloc de paraffine (Figure 12). Les lignées
cellulaires (Calu-3, ZR-75-1 et MCF-7) ont été sélectionnées en
fonction de leur caractérisation moléculaire du nombre de copies
du gène HER2 et des taux de protéine (d’après la littérature) et
correspondent à la plage des copies HER2 observées dans les
échantillons cliniques (Figure 13). Notez que les xénogreffes
contiennent une alternance de cellules hôtes de souris et de
cellules cancéreuses humaines. Ces cellules ne se colorent pas
de façon spécifique, le gène HER2 et le Chr17 humains n’étant pas
détectables dans les cellules de souris.
Les lames de xénogreffe peuvent être utilisées pour la résolution
des problèmes liés aux instruments ou aux réactifs (voir la notice
réf. 1004915 pour plus de détails).
Figure 12. Présentation schématique d’une HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slide
+
22
ZR-75-1
MCF 7
HER2 Dual ISH 3-in-1
Xenograft Slide
+
Calu 3
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Figure 13. Profil de coloration caractéristique des lames de xénogreffe HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; Calu-3, amplifié
pour HER2.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; ZR-75-1, environ
3 copies du gène HER2.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; MCF-7, environ
2 copies du gène HER2.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
23
Éléments à prendre en compte avant
l’analyse
La préparation de l’échantillon avant l’analyse est un facteur
essentiel à prendre en compte avant d’utiliser un test d’hybridation
in situ.1-4 Concernant le test réalisé avec le cocktail de sondes
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, il est recommandé
de fixer le tissu au formol neutre tamponné à 10 % (NBF) pendant
6 à 72 heures, puis de l’inclure en paraffine et de réaliser des
coupes d’environ quatre microns d’épaisseur. Le cocktail de sondes
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail a été développé
avec des options de prétraitement supplémentaires qui peuvent
contribuer à optimiser l’analyse dans les différents laboratoires
et à résoudre des problèmes rencontrés avec des tissus ou lames
particuliers présentant une coloration sous-optimale. Il est conseillé
à chaque laboratoire de procéder à des analyses nominales sur des
échantillons de contrôle représentatifs, préparés dans les mêmes
conditions que les échantillons cliniques à analyser. Cela permet
d’optimiser les conditions de coloration spécifiques des différents
laboratoires car les procédures exactes de préparation des
échantillons peuvent varier. Il est possible que le test ne permette
jamais une coloration adéquate de l’échantillon, si celui-ci est
préparé dans des conditions non conformes aux recommandations.
Pour toute information générale supplémentaire sur les étapes
à réaliser avant l’analyse, reportez-vous aux recommandations
ASCO/CAP Guideline Recommendations for HER2 Testing.1-2
Des études ont démontré que la majorité des résultats « non
concluants » obtenus par hybridation in situ fluorescente (FISH) sur
le gène HER2 sont liés à des facteurs pré-analytiques, notamment
à une surfixation et à une sous-fixation,3 ainsi qu’à un retard
de fixation.4 L’application stricte de procédures de fixation (par
exemple, un processeur dédié visant à garantir une durée minimum
de fixation de 6 h) a permis de réduire de 64 % le nombre de cas
« non concluants », faisant chuter le taux d’échec de 10,8 % à 3,4 %.3
Fixation
Pour les échantillons de biopsie fixés au NBF à 10 %, inclus en paraffine
et coupés à environ 4 µm, une exposition au réactif Ventana ISH
Protease 3 est recommandée pendant 20 minutes (c.-à-d. la condition
pour des analyses nominales). Il est recommandé de procéder à
la fixation uniquement avec du NBF à 10 % car certains fixateurs
produisent une coloration variable avec les tests basés sur l’ISH (y
compris le liquide de Bouin et l’alcool-formol-acide acétique (AFA)).
Il convient de noter que l’hétérogénéité biologique et les différences
de préparation des échantillons peuvent également avoir une
incidence sur l’intensité du signal (c.-à-d. sur la taille des signaux SISH
ou Red ISH). Ainsi, l’intensité du signal peut varier d’un cas à l’autre ou
d’une sonde à l’autre sur un même cas. Pour chaque lame, les cellules
de contrôle interne adjacentes à la zone cible et/ou qui se trouvent à
l’intérieur servent de référence pour définir la taille des signaux, et la
présence d’une à deux copies colorées du gène HER2 et du Chr17 doit
être utilisée pour déterminer la conformité de la lame.
24
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Épaisseur des échantillons
Des coupes dont l’épaisseur est supérieure à 4 μm peuvent exiger
un prétraitement par protéase plus important, par exemple laisser
incuber avec le réactif ISH Protease 3 pendant plus de 20 minutes.
L’allongement de la durée d’incubation par protéase permet une
détection plus efficace de l’ADN sur les échantillons les plus
épais. Les coupes plus fines peuvent nécessiter un traitement par
protéase plus doux (par ex., ISH Protease 3 pendant 8 minutes)
en cas d’observation d’une coloration de fond excessive ou d’une
digestion excessive au sein des noyaux (voir la section Résolution des
problèmes). De plus, les coupes de plus de 4 µm peuvent présenter
un plus grand nombre de « bulles dans les noyaux » que les coupes
plus fines, en raison d’un excès de paraffine dans le tissu (Figure 14).
Comme illustré à la Figure 15, la formation de bulles dans les
noyaux peut se produire dans le contexte d’une sous-fixation (par
ex., 1 à 3 heures avec du formol) qui est une bulle moins visible
et plus « floue ». Il est possible de remédier à ce problème dans
le cas d’une fixation de 3 heures en modifiant le traitement par
conditionnement cellulaire/protéase, mais une fixation d’une
heure seulement est probablement irrémédiable. Des bulles
peuvent se former dans les noyaux dans des proportions
moindres assez fréquemment, ce qui n’affecte généralement
pas le comptage.
Figure 14. Incidence de l’épaisseur du tissu sur la coloration
Cas 25 : Carcinome mammaire
A
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; épaisseur de VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; deux fois
coupe recommandée de 4 μm.
l’épaisseur recommandée (8 μm) : bulles dans les noyaux. Notez
que la formation de bulles est plus importante sur la coupe épaisse
en raison de l’excédent de paraffine.
Figure 15. Exemple de « bulles dans les noyaux »
Cas 26. Carcinome mammaire
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; « bulles dans
les noyaux ».
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
25
Autres éléments à prendre en compte
Type d’échantillon
Qualité générale de l’échantillon
Il est important de prendre en compte le type d’échantillon qui
sera testé (par exemple, du tissu provenant d’une ponctionbiopsie ou d’une excision-biopsie). Il peut être nécessaire
d’optimiser le pré-traitement ISH sur chaque type d’échantillon si
des différences en termes de qualité de coloration sont observées.
La qualité de la coloration peut être médiocre si les tissus
contiennent des zones d’artéfacts d’écrasement, des portions
nécrosées ou si la morphologie tissulaire est globalement
mauvaise. Il est recommandé de vérifier la coloration H&E de
chaque cas afin d’évaluer la morphologie globale de l’échantillon.
Figure 16. Morphologie nucléaire de mauvaise qualité due à une
Équilibre entre morphologie nucléaire et
fixation insuffisante et à une digestion excessive par la protéase
intensité des signaux
Cas 27. Carcinome mammaire
Sur des échantillons préparés différemment de la procédure
recommandée, il est souvent possible de pouvoir obtenir une
coloration adéquate en optimisant simplement le traitement par
ISH Protease et/ou les temps de conditionnement cellulaire. Il se
peut toutefois que l’utilisation prolongée d’ISH Protease 3 affecte
négativement la morphologie du noyau et entraîne une contrecoloration faible du noyau. Le lecteur doit avoir conscience de cela
et juger de l’intensité des signaux par rapport à la morphologie
et à la contre-coloration des noyaux. Par ailleurs, l’intensité
de la coloration du gène HER2 ou du Chr17 peut faiblir en cas
d’application d’un traitement par protéase trop fort.
A
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; digestion
excessive. A : noyaux trop digérés.
26
Une morphologie nucléaire de basse qualité due à une digestion
excessive par la protéase (Figure 16) est généralement liée à une
« sous-fixation » (< 6 heures) Ceci peut entraîner une perte de
signal due à la digestion du matériel nucléaire.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Résolution des problèmes
Coloration faible ou inexistante
• Les cas qui ne présentent aucune coloration ou une faible
coloration du gène HER2 et du Chr17, au point d’empêcher le
comptage des signaux, indiquent généralement un ou plusieurs
problème(s) lié(s) à la préparation pré-analytique de l’échantillon.
Assurez-vous que la durée de fixation, le type d’échantillon et
l’épaisseur de coupe sont appropriés. Si les noyaux sont intacts,
prolongez le temps d’incubation en prétraitement.
• Si la coloration de l’échantillon est satisfaisante pour une sonde
mais pas pour l’autre (le gène HER2 est bien coloré mais le
Chr17 ne présente qu’une coloration pâle ou inexistante), ceci
peut indiquer un problème lié aux réactifs utilisés. Dans ce cas,
assurez-vous que les distributeurs ne sont pas obstrués et que les
conteneurs de liquide en vrac étaient correctement remplis lors de
l’analyse. Vérifiez également que la procédure de déshydratation
suivie était appropriée, les bains d’alcool, l’acétone et les
incubations longues au xylène étant connus pour dissoudre les
signaux Red ISH. Si les signaux SISH sont faibles ou flous, assurezvous qu’un milieu de montage compatible a bien été utilisé pour
préserver les signaux (voir la notice des sondes réf. 1018383).
• Après avoir écarté ces facteurs, les paramètres de pré-traitement
liés aux durées d’incubation par protéase et/ou aux temps
de conditionnement cellulaire proposés par le protocole de
coloration peuvent être corrigés à la hausse, car ces paramètres
sont généralement la méthode la plus efficace pour remédier
à une coloration insuffisante (Figure 17). Les temps de prétraitement ne doivent être prolongés que si les noyaux semblent
intacts et si une contre-coloration des cellules cancéreuses est
visible. Si les noyaux montrent une digestion excessive et une
perte de signal liées à cet effet, diminuez la durée d’incubation par
protéase (exposition à ISH Protease 3 pendant 8 ou 12 minutes).
Figure 17. Exemple de coloration répétée réussie après prolongation du traitement par protéase
Cas 28. Carcinome mammaire
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; coloration Red
ISH inadéquate.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; coloration
inadéquate. La prolongation de l’incubation par la protéase
« démasque » l’ADN cible.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; incubation
excessive par la protéase entraînant une digestion excessive des
noyaux.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
27
Absence régulière de coloration permettant un
Figure 18. Poussière SISH
comptage dans les cellules de contrôle positif
Cas 29. Carcinome mammaire
interne
Tous les échantillons humains contiennent des cellules normales
qui servent de contrôles positifs internes (reportez-vous à la section
Conformité des lames). La présence d’une coloration appropriée
dans ces cellules normales (contrôle « intra-lame ») indique une
coloration adéquate. De nombreux échecs de coloration impliquant
une absence totale de coloration, y compris dans ces noyaux de
contrôle positif interne, peuvent indiquer un problème au niveau
de l’appareil ou des réactifs. Lorsqu’un problème de ce type est
suspecté, il est conseillé de lancer une analyse des échantillons de
contrôle positif ou des lames de xénogreffe HER2 Dual ISH 3-in-1
Xenograft Slides afin de résoudre le problème.
Coloration non spécifique et bruit de fond
Certains cas présentent un niveau acceptable de bruit de fond
Red ISH ou SISH, qui n’interfère pas avec le comptage des signaux
spécifiques (Figures 18 et 19). Toutefois, si les lames montrent
un bruit de fond excessif qui gêne le comptage des signaux
spécifiques (c. -à-d. poussière ou brume dans les noyaux), il
est conseillé de recourir à un traitement par protéase plus doux
(par exemple, ISH Protease 3 pendant 8 minutes ou 12 minutes).
Si le signal SISH est fort, accompagné de poussière ou de brume
rouge, et/ou si les noyaux présentent également des signaux
Red ISH non spécifiques d’intensité nettement plus faible que
les signaux Red ISH spécifiques (Figure 19), l’augmentation de
la température de lavage stringent à 76 °C ou 78 °C atténue le
bruit de fond rouge non spécifique (brume rouge). La brume
rouge se remarque particulièrement dans les tissus « sous-fixés ».
La Figure 19 illustre un niveau modéré à sévère de poussière ou
de brume rouge dans le noyau ou autour de celui-ci. Il existe
également de petits signaux rouges non spécifiques qui ne
doivent pas être inclus dans le comptage.
C
B
A
B
B
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; exemple de
poussière SISH dans le noyau, qui masque partiellement le noyau
(A). De nombreux noyaux ne sont pas concernés et peuvent
facilement être comptés (C). Il existe également une coloration
SISH et Red ISH non spécifique de cellules nécrosées (B), qui
peuvent être ignorées.
Figure 19. Bruit de fond rouge/brume rouge non spécifique
Cas 30. Carcinome mammaire
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; brume/bruit de
fond rouge non spécifique.
28
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
La Figure 20 illustre un bruit de fond rouge non spécifique sous
forme de signal nucléaire dans les cellules tumorales et dans les
cellules normales. Ce signal est plus faible que le signal Red ISH
spécifique pour le Chr17, mais son extension significative interfère
avec le comptage des signaux Red ISH spécifiques. Même si
une coloration nucléaire est observée, Ventana recommande
d’identifier une autre zone pour le comptage.
Figure 20. Bruit de fond rouge non spécifique
Cas 31. Carcinome mammaire
A
B
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; bruit de fond
rouge non spécifique sous la forme d’un signal nucléaire dans les
cellules tumorales (A) et dans les cellules normales (B). Ce signal
est plus faible que le signal Red ISH spécifique pour le Chr17, mais
son extension significative interfère avec le comptage des signaux
Red ISH spécifiques.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
29
Précipitation des lames
Si des zones de précipitations brunes ou noires marquées
sont visibles sur ou autour des noyaux, Ventana recommande
d’identifier une autre zone pour le comptage ou de colorer une
deuxième lame (Figure 21). Certains artéfacts de précipitation
peuvent être provoqués par un mauvais positionnement de
l’étiquette de la lame. Les étiquettes de lames à code-barres
doivent être appliquées sans dépasser du bord de la lame en verre.
Il faut éviter d’effectuer un double étiquetage ou de réappliquer
l’étiquette sur la lame. Vérifiez que l’appareil et les distributeurs
de réactifs fonctionnent correctement et que les conteneurs des
réactifs en vrac sont bien remplis. Assurez-vous également que les
distributeurs sont munis de leur couvercle car l’acétate d’argent
s’oxyde avec le temps. Le Tableau 2 vous aidera à résoudre
certains des problèmes décrits ci-dessus en vous fournissant
davantage d’explications. Pour de plus amples informations,
consultez la procédure étape par étape du manuel de l’opérateur
de l’instrument ou contactez votre représentant local.
Figure 21. Précipitation
Cas 32a. Carcinome mammaire
Cas 32b. Carcinome mammaire
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; précipitation
modérée autour des noyaux.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 20x ; zone de noncoloration adjacente à la zone de précipitation.
Cas 33a. Carcinome mammaire
Cas 33b. Carcinome mammaire
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; précipitation
marquée autour des noyaux.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 20x ; précipitation
sur une grande surface de la lame.
30
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Tableau 2. Description d’une coloration sous-optimale et suggestions de modification du test
En cas de
coloration faible
Modification(s) nécessaire(s) au niveau de la procédure pour obtenir la coloration voulue
ou inexistante
1.
2.
Coloration
Red faible ou
inexistante
3.
4.
5.
6.
1.
2.
Coloration
SISH faible ou
inexistante
3.
4.
5.
6.
Si un bruit de fond
est visible
2.
3.
1.
Bruit de fond SISH
non spécifique
Précipitation
Formation de bulles
Vérifiez que les distributeurs de réactifs fonctionnent correctement (c. -à-d. qu’ils ne sont ni
obstrués ni vides) et que les conteneurs de solution en vrac sont remplis.
Si la coloration est toujours faible ou inexistante, passez à l’étape 2.
Assurez-vous que le type de fixation, la durée de traitement et l’épaisseur des coupes sont adaptés
à un test ISH.
Assurez-vous d’utiliser un milieu de montage SISH compatible (voir la notice des sondes)
afin de préserver le signal SISH.
Si la coloration est toujours faible ou inexistante, passez à l’étape 4.
Augmentez la durée de CC1 au-delà de 16 min.
Augmentez la durée de CC2 au-delà de 16 min pour le carcinome gastrique et au-delà de 24 min
pour le carcinome mammaire.
Augmentez la durée du traitement par ISH Protease 3 au-delà de 16 min pour le carcinome
gastrique et au-delà de 20 min pour le carcinome mammaire si la morphologie nucléaire est intacte.
Modification(s) nécessaire(s) au niveau de la procédure pour obtenir la coloration voulue
1.
Bruit de fond Red
ISH non spécifique
Vérifiez que les distributeurs de réactif fonctionnent correctement (c. -à-d. qu’ils ne sont ni obstrués
ni vides) et que les conteneurs de solution en vrac sont remplis.
Si la coloration est toujours faible ou inexistante, passez à l’étape 2.
Assurez-vous que les lames colorées n’ont pas été déshydratées dans des bains d’alcool ou des
lavages longs au xylène, ces procédures dégradant les signaux Red ISH.
Si la coloration est toujours faible ou inexistante, passez à l’étape 3.
Assurez-vous que le type de fixation, la durée de traitement et l’épaisseur des coupes sont adaptés
à un test ISH.
Augmentez la durée de CC1 au-delà de 16 min.
Augmentez la durée de CC2 au-delà de 16 min pour le carcinome gastrique et au-delà de 24 min
pour le carcinome mammaire.
Augmentez la durée du traitement par ISH Protease 3 au-delà de 16 min pour le carcinome
gastrique et au-delà de 20 min pour le carcinome mammaire si la morphologie nucléaire est intacte.
2.
3.
1.
2.
Assurez-vous que les lames utilisées sont des lames chargées positivement (Superfrost Plus ou
équivalent) et que l’échantillon est fixé et coupé de façon adéquate pour effectuer un test ISH.
Si le bruit de fond Red ISH peut être distingué des signaux Red ISH spécifiques, procédez au
comptage de la lame sans prendre en compte les signaux Red ISH non spécifiques.
Si le bruit de fond Red ISH dans le noyau interfère avec le comptage, recommencez la coloration
en appliquant une température de lavage stringent de 76 °C ou 78 °C. La diminution du
conditionnement cellulaire ou du temps d’incubation par protéase permet également d’atténuer
le bruit de fond rouge.
Assurez-vous que les lames utilisées sont des lames chargées positivement (Superfrost Plus ou
équivalent) et que l’échantillon est fixé et coupé de façon adéquate pour effectuer un test ISH.
Si le bruit de fond SISH peut être distingué des signaux SISH spécifiques, procédez au comptage
de la lame sans prendre en compte les signaux SISH non spécifiques.
Si le bruit de fond SISH dans le noyau interfère avec le comptage, recommencez la coloration
en raccourcissant le traitement par protéase ou le conditionnement cellulaire.
Si des artéfacts de précipitation gênent le comptage, recommencez la coloration.
Assurez-vous que les étiquettes à code-barres des lames sont centrées et appliquées sur la lame en
verre sans dépasser. Ne pas étiqueter en double ni réappliquer les étiquettes à code-barres.
Si la présence de bulles gêne le comptage, assurez-vous que l’épaisseur des coupes et les
procédures effectuées avant l’analyse sont conformes aux recommandations.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
31
Tableau 3. Modification des options de procédure logicielle de coloration et incidence sur le test
Plage de réglage associée
Option de procédure disponible
à l’option de procédure
Résultat de la modification du réglage
logicielle de coloration
Coché/non coché
La cuisson peut favoriser l’adhérence des tissus
fraîchement coupés sur la lame.
16 à 40 min
L’augmentation de la durée de cycle entraîne
une intensification de la coloration des signaux
Red ISH et SISH.
La diminution de la durée entraîne un
affaiblissement de l’intensité des signaux.
16 à 40 min
L’augmentation de la durée de cycle entraîne
une intensification de la coloration des signaux
Red ISH et SISH.
La diminution de la durée entraîne un
affaiblissement de l’intensité des signaux.
ISH-Protease 3
8 à 24 min
Augmente la coloration des signaux Red ISH et
SISH, mais les longues durées peuvent influer
sur la morphologie. La diminution de la durée
affaiblit le bruit de fond et le signal.
Température de lavage stringent
72 °C à 78 °C
Une température de 76 °C ou 78 °C réduit les
signaux Red ISH non spécifiques.
Cuisson
Cell Conditioning 1
Cell Conditioning 2
Atténuation du signal SISH
Formation de bulles dans les noyaux
L’oxydation (qui se manifeste par un changement de couleur du
noir à l’orange), l’atténuation et/ou la disparition des signaux SISH
peuvent être liées à l’utilisation de certaines marques de milieu de
montage. Les milieux de montage suivants sont connus pour leur
pouvoir oxydant : EUKITT (EMS), Entellan (Merck), Entellan NEW
(Merck), HSR (Sysmex) et Malinol (Muto Chemical). Reportezvous à la notice des sondes pour en savoir plus sur la compatibilité
des milieux de montage. Si le milieu de montage que vous utilisez
ne figure pas dans cette liste, nous vous conseillons de vérifier sa
compatibilité avec la technique de détection SISH avant de vous
en servir sur des échantillons de patient. Des études internes ont
démontré que l’atténuation des signaux SISH apparaît généralement
dans un délai allant de quelques heures à une semaine.
Comme décrit à la section Autres éléments à prendre en compte
avant l’analyse, certains noyaux peuvent présenter des « bulles ».
Ceci peut se produire à des niveaux relativement bas de fixation
et sur un grand nombre de cas différents, est généralement dû
à un excédent de paraffine et/ou à des différences en termes
de traitements pré-analytiques, et n’a aucune incidence sur
le comptage. La formation de bulles dans les noyaux est plus
fréquente sur les coupes plus épaisses (> 6 μm).
Contre-coloration faible ou inexistante
Pour les cas qui ne présentent pas de contre-coloration nucléaire ou
présentent une coloration faible (ce qui rend difficile le discernement
des bords des noyaux), recommencez la coloration avec une nouvelle
lame et utilisez un prétraitement plus doux (p. ex. , ISH Protease 3
pendant 8 ou 12 min ou un conditionnement cellulaire plus court).
Une contre-coloration faible peut indiquer que l’échantillon n’a pas
été préparé comme recommandé (c. -à-d. une digestion excessive
due à une sous-fixation). Reportez-vous également à la section Autres
éléments à prendre en compte avant l’analyse pour plus d’informations
sur l’équilibre entre la morphologie des noyaux et l’intensité des signaux.
32
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
Zones faiblement ou non colorées
Dans certains cas, la lame peut comporter des zones
présentant une faible coloration ou une absence de coloration.
Si la zone est limitée et si la lame comporte d’autres zones
de coloration adéquates, procéder au comptage dans ces
zones (Figure 22).
Figure 22.
Cas 35. Carcinome mammaire
A
A
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 20x ; zone sans
coloration (A). D’autres zones correctement colorées peuvent être
présentes et c’est là qu’il faut procéder au comptage.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 40x ; zone sans
coloration (A). D’autres zones correctement colorées peuvent être
présentes et c’est là qu’il faut procéder au comptage.
Chevauchement des signaux
Figure 23.
Comme indiqué dans le Tableau 1, certains signaux peuvent
être important et se chevaucher. Le signal Red ISH en particulier
peut être important et provoquer un chevauchement, ce qui
rend les signaux Chr17 indiscernables et complique le comptage
(Figure 23). Le comptage doit cibler les noyaux présentant des
signaux Chr17 distincts.
Cas 36. Carcinome mammaire
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; signaux Red ISH
importants, se chevauchant parfois. Compter les noyaux présentant
des signaux Chr17 distincts.
VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique
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31-03-2019

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