Mode opératoire pour la digestion par des enzymes de restriction et l'analyse
Leçon 1 Digestion par enzymes de restriction
1. Se procurer des microtubes qui contiennent chacun une solution de base d’enzyme, de l’ADN lambda (tube rose) et du tampon de restriction (tube bleu). Garder toutes les solutions de base sur de la glace.
2. Se procurer un exemplaire de chaque microtube coloré et étiqueter comme suit :
Tube jaune : L (ADN lambda)
Tube violet : P (lambda digéré avec Pstl)
Tube vert : E (lambda digéré avec EcoRI)
Tube orange : H (lambda digéré avec HindIII)
ADN TR Glace
3. En utilisant un nouveau cône pour chaque
échantillon, pipeter les réactifs dans chacun des tubes conformément au tableau cidessous.
Tube ADN tamponTR PstI EcoRI HindIII
L
P
E
4 µl 6 µl
4 µl 5 µl
4 µl 5 µl
–
1 µl
–
–
–
–
–
1 µl –
H 4 µl 5 µl – – 1 µl
4. Mélanger les composants en donnant de petites chiquenaudes et en tapant délicatement l'extrémité sur la table pour ramener tout le liquide dans le fond du tube.
Centrifuger le tube pour rassembler tout le liquide dans le fond ou le taper délicatement sur l'établi.
5. Placer les tubes dans un support flottant et faire incuber pendant 30 minutes à 37°C ou toute une nuit à température ambiante.
Taper
Centrifuger
Bain-marie
6. Après l’incubation, placer les échantillons dans le réfrigérateur jusqu’au prochain TP ou passer directement à l’étape 2 de la Leçon 2.
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Leçon 2 Électrophorèse sur gel d’agarose
1. Retirer les échantillons d’ADN digérés du réfrigérateur (le cas
échéant).
2. Ajouter 2 µl de tampon de charge
(TC) dans chaque tube. Mélanger le contenu en donnant des petites chiquenaudes. Ramener l’échantillon dans le fond du tube en le tapant délicatement sur la table ou en le centrifugeant.
3. Demander le marqueur ADN (M) à votre professeur.
4. En option : chauffer les échantillons d’ADN à 65°C pendant 5 minutes puis les mettre sur de la glace.
5. Retirer le gel d’agarose du réfrigérateur (le cas échéant) et retirer l’emballage plastique. Remplir la chambre d’électrophorèse et couvrir le gel avec le tampon TAE 1x
(environ 275 ml de tampon).
6. Vérifier que les puits des gels d’agarose sont proches de l’électrode noire (-) et que le bord du bas du gel est proche de l’électrode rouge (+).
7. Déposer 10 µl de chaque échantillon dans les puits séparés dans la chambre de gel dans l’ordre suivant :
2
3
4
Ligne
1
5
Échantillon
M, marqueur (tube clair)
L, ADN lambda non coupé (tube jaune)
P, ADN lambda digéré avec Pstl (tube violet)
E, ADN lambda digéré avec EcoRI (tube vert)
H, ADN lambda digéré avec HindIII (tube orange )
8. Placer délicatement le couvercle sur la chambre d’électrophorèse. Raccorder les fils électriques au générateur : rouge sur rouge et noir sur noir.
9. Mettre sous tension et laisser agir à 100 V pendant 30 minutes.
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Taper
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Visualisation des fragments d’ADN
1. Lorsque l’électrophorèse se termine, couper l’alimentation et retirer le haut de la chambre. Retirer délicatement le gel et le plateau de la chambre. Faire attention, le gel est très glissant.
Faire glisser le gel dans la cuve de coloration.
2. Vous avez deux options pour colorer votre gel :
Coloration rapide (prend 12 à 15 minutes) a. Ajouter 120 ml de colorant Fast Blast 100x dans une cuve de coloration (2 gels par cuve).
b. Colorer les gels pendant 2 minutes en agitant délicatement.
Mettre de côté le colorant utilisé pour une utilisation future.
c. Transférer les gels dans un conteneur de lavage important et les rincer avec de l’eau du robinet chaude (40 à 55°C) pendant environ 10 secondes.
d. Décolorer en lavant deux fois dans de l’eau du robinet chaude pendant 5 minutes en secouant légèrement pour obtenir de meilleurs résultats.
e. Consigner les résultats.
f. Découper et mettre au rebut toutes les lignes non chargées.
g. Sécher à l’air le gel sur la pellicule de support et fixer avec du scotch le gel séché dans votre carnet de laboratoire.
Coloration pendant toute la nuit
a. Ajouter 120 ml de colorant ADN Fast Blast 1x dans la cuve de coloration (2 gels par cuve).
b. Laisser le gel se colorer dans la nuit, en brassant légèrement pour obtenir de meilleurs résultats. Aucune décoloration n’est nécessaire.
c. Verser l'eau dans un bécher à rebut.
d. Consigner les résultats.
e. Découper toutes les lignes non chargées.
f.
Sécher à l’air le gel sur la pellicule de support de gel et coller avec du scotch le gel séché dans votre cahier de laboratoire.
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