GUIDE COMPLEMENTAIRE VetMAX™ BHV Type 4 Kit Protocoles de purification d'acides nucléiques En association avec la Référence Catalogue BHV450 Partie Nº 100021146 Pub. Nº MAN0008668 Rév. B.0 Espèce(s) Bovins Isolation des acides nucléiques à partir des matrices Ecouvillon (cervical ou naso-pharyngé) Mucus vaginal Aspiration Trans-Trachéale (ATT) Sperme Organe (avorton ou poumon) Test Individuel Sommaire Purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques ............................................................................... 2 Contenu de ce manuel.................................................................................................................................................................................. 2 Choix des échantillons ................................................................................................................................................................................. 2 Conservation des échantillons ..................................................................................................................................................................... 2 Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fournis dans le kit ............................................................................................................. 3 Protocoles d’extraction de l’ADN ................................................................................................................................................................. 3 Extraction de l’ADN ......................................................................................................................................................... 4 Préparation des échantillons avant extraction ........................................................................................................................................... 4 Extraction avec le QIAamp™ DNA Mini Kit ................................................................................................................................................... 5 Extraction avec le kit NucleoSpin™ Tissue................................................................................................................................................... 6 Documentation et support ............................................................................................................................................... 8 Service clientèle et assistance technique ................................................................................................................................................... 8 Garantie produit limitée ............................................................................................................................................................................... 8 AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Pour usage en laboratoire. Purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques Contenu de ce manuel Ce manuel a pour objectif de présenter des protocoles de purification des ADN viraux du Bovine Herpes Virus Type 4 (BoHV-4) compatibles avec Applied Biosystems™ VetMAX™ BHV Type 4 Kit. Choix des échantillons Type d’analyse Quantité requise et matériel de prélèvement Ecouvillon (cervical ou naso-pharyngé) Individuelle Ecouvillon stérile Mucus vaginal Individuelle 200 µL de mucus vaginal Lavage pulmonaire Individuelle 10 mL de lavage pulmonaire Semence Individuelle 5 mL de semences Organe (avorton ou poumon) Individuelle 20 à 30 mg de tissu Matrice Conservation des échantillons Il est nécessaire de s’assurer de la qualité des échantillons avant leur entrée dans le processus analytique. Ecouvillon (cervical ou naso-pharyngé) Suite au prélèvement, maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation, dans un délai maximum de 24 heures après prélèvement. Après élution de l'écouvillon, utiliser directement l'éluât pour réaliser la PCR. Placer le reste d'éluât en dessous de −16°C pour conservation jusqu'à 1 an ou en dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 an. Mucus vaginal Suite au prélèvement, maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation, dans un délai maximum de 8 jours après prélèvement. Après utilisation ou passé le délai de 8 jours, congeler en dessous de −16°C pour conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 an. Semence Selon le type de semence : • Si la semence est pure et fraîche, maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation, dans un délai maximum de 8 jours après prélèvement. • S’il s’agit d’une semence commerciale, maintenir dans les conditions de conservation (température et durée) préconisées par le fournisseur jusqu’à utilisation. Lavage pulmonaire Suite au prélèvement, maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation, dans un délai maximum de 8 jours après prélèvement. Après utilisation ou passé le délai de 8 jours, congeler en dessous de −16°C pour conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 an. Organe Suite au prélèvement, selon le cas de figure : • Si l’analyse est effectuée dans les 24 heures suivant le prélèvement : maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation. • Si l’analyse est effectuée au-delà des 24 heures suivant le prélèvement : congeler en dessous de −16°C jusqu’à utilisation. Dans les deux cas, après utilisation ou passé le délai de 24 heures, congeler en dessous de −16°C pour conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 an. 2 VetMAX™ BHV Type 4 Kit Guide Complémentaire Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fournis dans le kit Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. Matériel et réactifs nécessaires à la préparation des échantillons pour analyse • Poste de sécurité microbiologique (PSM) de type II • Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre • Un vortex ou équivalent • Une centrifugeuse pour microtubes de 1.5 mL et 2 mL • Balance de précision • Optionnel : un broyeur de laboratoire pour le broyage mécanique des organes • Billes de verre de 3 mm • Microtubes DNase/RNase-free de 1.5 mL et 2 mL • Tampon PBS 1X ou milieu MEM • Eau DNase/RNase-free Kits, réactifs et matériels pour l’extraction et la purification des ADN des échantillons Tous les matériels et réactifs requis pour la préparation des échantillons pour analyse sont susceptibles d’être utilisés pour cette étape. S’assurer en plus de disposer des éléments suivants : • Ethanol 96–100% ou éthanol 80% selon l’extraction réalisée • • Extraction manuelle sur colonnes de silice en format individuel : – QIAamp™ DNA Mini Kit (QIAGEN™) ou kit NucleoSpin™ Tissue (MACHEREY-NAGEL) – Une centrifugeuse pour microtubes Extraction automatisée en billes magnétiques : – MagVet™ Universal Isolation Kit (Réf. MV384) – Automate d’extraction : renseignements disponibles sur demande au Support Technique. Protocoles d’extraction de l’ADN Kits d’extraction recommandés Ecouvillon (cervical ou naso-pharyngé), mucus vaginal, lavage pulmonaire, organe (avorton ou poumon), semence VetMAX™ BHV Type 4 Kit Guide Complémentaire QIAamp™ DNA Mini Kit NucleoSpin™ Tissue 3 Extraction de l’ADN Préparation des échantillons avant extraction Organes 1. Dilacérer finement le morceau d'organe dans une boîte de Pétri stérile à l’aide de pinces et bistouri stériles. 2. Dans un microtube, peser 20 à 30 mg de l’organe préalablement dilacéré à l’aide d’une balance de précision. 3. Procéder à l’extraction à partir de ces 20 à 30 mg d’organe dilacéré. Mucus vaginal L’extraction est réalisée directement à partir de 200 µL de liquide. Ecouvillons cervicaux 1. Eluer l’écouvillon avec du PBS 1X selon une des méthodes suivantes : – Soit déposer directement 1 mL de PBS 1X sur l’écouvillon placé dans son tube de transport. – Soit placer l’écouvillon dans un microtube (après avoir coupé la tige pour permettre la fermeture du tube) et le recouvrir de 1 mL de PBS 1X. 2. Vortexer l’écouvillon dans le PBS 1X. 3. Enlever l’écouvillon en l’écrasant sur la paroi du tube pour bien l’essorer. L’extraction sera réalisée à partir de 200 µL d’éluât. 4. Prélever le reste du volume disponible, le déposer dans un tube de stockage adéquat et stocker en dessous de −16ºC. Ecouvillons nasaux 1. Eluer l’écouvillon avec du PBS 1X selon une des méthodes suivantes : – Soit déposer directement 500 µL de PBS 1X sur l’écouvillon placé dans son tube de transport. – Soit placer l’écouvillon dans un microtube (après avoir coupé la tige pour permettre la fermeture du tube) et le recouvrir de 500 µL de PBS 1X. 2. Vortexer l’écouvillon dans le PBS 1X. 3. Enlever l’écouvillon en l’écrasant sur la paroi du tube pour bien l’essorer. L’extraction sera réalisée à partir de 200 µL d’éluât. 4. Prélever le reste du volume disponible, le déposer dans un tube de stockage adéquat et stocker en dessous de −16ºC. Lavages pulmonaires 1. Transferer le lavage pulmonaire dans un tube à fond conique et centrifuger 5 minutes à 1500 × g. 2. Eliminer le surnageant tout en conservant environ 100 µL de liquide pour ne pas éliminer de cellules. L’extraction sera réalisée sur ce culot cellulaire resuspendu dans 100 µL de surnageant. Semences 1. Transferer 5 mL de semences dans un tube à fond conique. 2. Centrifuger 5 minutes à 1500 × g. Trois phases sont ainsi obtenues : le liquide séminal, les leucocytes et cellules épithéliales et les spermatozoïdes. 4 3. Récupérer la phase contenant les leucocytes et cellules épithéliales. 4. L’extraction sera réalisée sur le culot cellulaire (leucocytes et cellules épithéliales). VetMAX™ BHV Type 4 Kit Guide Complémentaire Extraction avec le QIAamp™ DNA Mini Kit Avant de commencer • Reconstitution Buffer AW1 et AW2 : Ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la première utilisation. • Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins négatifs). Protocole 1. Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous : Organe Eluât d’écouvillon, mucus Lavage pulmonaire, semence NCS Solution de lyse 180 µL de Buffer ATL + 20 µL de protéinase K 180 µL de Buffer ATL + 20 µL de protéinase K 180 µL de Buffer ATL + 20 µL de protéinase K 180 µL de Buffer ATL + 20 µL de protéinase K Prise d’essai 20 à 30 mg d’organe 200 µL d’échantillon Culot cellulaire 200 µL de PBS 1X 2. Vortexer immédiatement pendant 15 secondes. 3. Incuber 30 minutes à 70°C. 4. Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture. 5. Ajouter 200 µL de buffer AL et vortexer pendant 15 secondes. 6. Incuber 10 minutes à 70°C. 7. Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture. 8. Ajouter dans chaque tube 200 µL d’éthanol 96–100% - Homogénéiser en vortexant pendant 15 secondes - Centrifuger rapidement le tube avant ouverture. On obtient le lysat de l’échantillon. 9. Prendre une mini-colonne du QIAamp™ DNA Mini Kit - Identifier la colonne. 10. Transférer la totalité du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 10000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 11. Distribuer 500 µL de buffer AW1 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 10000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 12. Distribuer 500 µL de buffer AW2 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 10000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 13. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 3 minutes à 15000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 14. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 200 µL de buffer AE - Boucher. 15. Incuber 1 minute à température ambiante. 16. Centrifuger 1 minute à 1000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube. Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C. VetMAX™ BHV Type 4 Kit Guide Complémentaire 5 Extraction avec le kit NucleoSpin™ Tissue Avant de commencer • Reconstitution Buffer B5 : Ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la première utilisation. • Reconstitution de la protéinase K : Ajouter la quantité requise de buffer PB selon les recommandations du fournisseur avant la première utilisation. • Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins négatifs). Protocole 1. Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous : Organe Eluât d’écouvillon, Mucus Lavage pulmonaire, Semence NCS Solution de lyse 180 µL de Buffer T1 + 25 µL de protéinase K 180 µL de Buffer T1 + 25 µL de protéinase K 180 µL de Buffer T1 + 25 µL de protéinase K 180 µL de Buffer T1 + 25 µL de protéinase K Prise d’essai 20 à 30 mg d’organe 200 µL d’échantillon Culot cellulaire 200 µL de PBS 1X 2. Vortexer immédiatement pendant 15 secondes. 3. Incuber 30 minutes à 70°C. 4. Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture. 5. Ajouter 200 µL de buffer B3 et vortexer pendant 15 secondes. 6. Incuber 10 minutes à 70°C. 7. Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture. 8. Ajouter dans chaque tube 200 µL d’éthanol 96–100% - Homogénéiser en vortexant pendant 15 secondes - Centrifuger rapidement le tube avant ouverture. On obtient le lysat de l’échantillon. 9. Prendre une mini-colonne du kit NucleoSpin™ Tissue - Identifier la colonne. 10. Transférer la totalité du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 11000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 11. Distribuer 500 µL de buffer BW (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 11000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 12. Distribuer 600 µL de buffer B5 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 11000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 13. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 3 minutes à 11000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 14. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 200 µL de buffer BE - Boucher. 15. Incuber 1 minute à température ambiante. 16. Centrifuger 1 minute à 11000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube. Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C. 6 VetMAX™ BHV Type 4 Kit Guide Complémentaire Cette page est délibérément vide. VetMAX™ BHV Type 4 Kit Guide Complémentaire 7 Documentation et support Service clientèle et assistance technique Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique, notamment : • Numéros de téléphone partout dans le monde • Commande et Support web • Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles • Certificats d’analyse • Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques)) Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant. Garantie produit limitée Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support. Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008668 (français) Révision Date B.0 3 mai 2017 Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos. Description A.0 24 mars 2014 Base de référence pour l’historique de révision Personne morale : Life Technologies Corporation | Carlsbad, CA 92008 États-Unis | Numéro gratuit aux États-Unis 1 800 955 6288 ©2017 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. NucleoSpin est une marque de MACHEREY-NAGEL GMBH & Co. QIAamp et QIAGEN sont des marques de QIAGEN GmbH. thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 3 mai 2017 ">
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