Macherey-Nagel NucleoSpin RNA XS, Micro kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d’utilisation
Extraction des ARN
n NucleoSpin® RNA XS
Mai 2023 / ​Rev. 12
www.mn-net.com
www.mn-net.com
Extraction des ARN
Résumé du protocole (Rev. 12)
XS
NucleoSpin® RNA XS
1
Préparation de l’échantillon
2
Lyse et homogénéisation des cellules
Utiliser jusqu’à 10⁵ cellules en culture ou
5 mg tissus
100 μL RA1
2 μL TCEP
Mélanger
3
Ajout d’ARN Carrier
5 μL de solution d’ARN Carrier
Mélanger
4
Filtration du lysat (optionnel)
11,000 x g,
30 s
5
6
100 μL Ethanol 70 %
Ajustement les conditions de fixation de
l’ARN
Mélanger
Fixation de l’ARN
Charger le lysat
11,000 x g,
30 s
7
Dessalage de la membrane de silice
100 μL MDB
11,000 x g,
30 s
8
Digestion de l’ADN
25 μL de mélange réactionnel de rDNase
TA, 15 min
9
Lavage et séchage de la membrane de
silice
1er lavage
100 μL RA2
2ième lavage
400 μL RA3
lavage
200 μL RA3
3
1 et 2
11,000 x g,
30 s
3ième
11,000 x g,
2 min
er
9
ième
ième
Elution d’ARN purifié
10 μL RNase-free H₂O
11,000 x g,
30 s
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com
Extraction des ARN
Sommaire
1 Composition du kit
4
1.1 Composants
4
1.2 Réactifs, consommables et équipements complémentaires requis
5
1.3 À propos de ce manuel d’utilisation
5
2 Description du produit
6
2.1 Le principe de base
6
2.2 Caractéristiques du kit
6
2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons
9
2.4 Procédures d’élution
10
2.5 Stabilité de l’ARN purifié
10
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
11
4 Instructions de sécurité
13
4.1 Elimination des déchets
5 Protocoles
13
14
5.1 Purification d’ARN à partir de cellules en culture, de cellules isolées par capture
laser ou de cryosections microdisséquées
14
5.2 Purification de l’ARN de tissus
17
5.3 Purification et concentration de l’ARN
20
5.4 Digestion en solution avec la rDNase
22
6 Annexes
24
6.1 Guide de résolution des problèmes
24
6.2 Informations de commande
28
6.3 Références
29
6.4 Restrictions d’utilisation / ​garantie
30
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
3
Extraction des ARN
1
Composition du kit
1.1
Composants
NucleoSpin® RNA XS
10 préps
740902.10
50 préps
740902.50
250 préps
740902.250
Tampon de lyse RA1
6 mL
25 mL
125 mL
Tampon de lavage RA2
2 × 1 mL
15 mL
2 × 15 mL
Tampon de lavage RA3
(Concentré)*
6 mL
12 mL
50 mL
Tampon de dessalage de la
membrane MDB
10 mL
10 mL
50 mL
Tampon de réaction pour la
rDNase
7 mL
7 mL
30 mL
rDNase, exempte de RNase
(lyophilisée)*
1 flacon
(taille A)
1 flacon
(taille C)
2 flacons
(taille D)
ARN Carrier*
300 µg
300 µg
300 µg
Agent réducteur TCEP*
14 mg
3 × 14 mg
2 × 107 mg
H2O RNase-free
13 mL
13 mL
13 mL
NucleoSpin® Filters (anneaux
violets)
10
50
250
Colonnes NucleoSpin® RNA
XS (anneaux bleus - plus tubes
collecteurs)
10
50
250
Tubes collecteurs (2 mL)
30
150
750
Tubes d’élution (1,5 mL)
10
50
250
Manuel d’utilisation
1
1
1
REF
* Pour la préparationdes reactifs et des conditions de stockage, voir le chapitre 3.
4
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
Extraction des ARN
1.2
Réactifs, consommables et équipements
complémentaires requis
Réactifs
•
Éthanol à 96 – 100 % (pour préparer le tampon de lavage RA3 et pour la procédure de
purification, chapitre 5.3)
•
Éthanol à 70 % (pour ajuster les conditions de fixation de l’ARN)
Consommables
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL
Cônes stériles, exempts de RNases
Equipements
•
Pipettes manuelles
•
Centrifugeuse pour microtubes
•
Vortex
•
Équipement de protection individuelle (par exemple, blouse de laboratoire, gants, lunettes)
1.3
À propos de ce manuel d’utilisation
Il est fortement recommandé de lire les protocoles détaillés de ce manuel d'utilisation si le kit
NucleoSpin® RNA XS est utilisé pour la première fois. Les utilisateurs expérimentés peuvent
toutefois se référer au résumé du protocole. Celui-ci est conçu pour repérer aisément le
déroulement de la procédure en rappelant la chronologie des différentes étapes.
Toute la littérature technique est disponible sur notre site www.mn-net.com.
Merci de contacter notre support technique pour toute information concernant les changements
éventuels entre cette version du manuel et les précédentes versions.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
5
Extraction des ARN
2
Description du produit
2.1
Le principe de base
Un des aspects les plus important lors de l’extraction de l’ARN concerne la prévention de
sa dégradation. Avec les méthodes NucleoSpin® RNA, les cellules sont lysées par incubation
dans une solution contenant une forte concentration d’ions chaotropiques. Ce tampon de lyse
inactive immédiatement les RNases – omniprésentes dans quasiment tous les échantillons
biologiques – et crée les conditions favorables pour la fixation de l’ARN à la membrane de
silice. L’ADN contaminant, également fixé à la membrane de silice, est éliminé par digestion au
moyen d’une solution de rDNase directement appliquée sur la membrane de silice pendant la
procédure (la rDNase RNase-Free est incluse dans le kit). De simples étapes de lavages avec
deux tampons différents permettent d’éliminer les sels, les métabolites et autres composants
cellulaires macromoléculaires. L’ARN purifié est finalement élué dans de l’H2O exempte de
RNases (fournie dans le kit).
La préparation de l’ARN avec les kits de la gamme NucleoSpin® RNA peut être effectuée
à TA. Cependant, une fois élué, l’éluat doit être traité avec précaution en raison de sa forte
vulnérabilité vis-à-vis des RNases, souvent présentes sur le matériel, les traces de doigts et la
poussière. Pour garantir la stabilité de l’ARN, conserver le congelé à -20 °C pour un stockage à
court terme ou à -70 °C pour un stockage à long terme.
2.2
Caractéristiques du kit
•
Le kit NucleoSpin® RNA XS est recommandé pour l’extraction d’ARN de très petits
échantillon, par exemple de petites quantités de cellules (jusqu’à 10⁵) et de tissus (jusqu’à
5 mg) sous forme de culots, de cellules isolées par capture laser, de cryosections
microdisséquées, de biopsies, des biopsies aspirées dans des aiguilles et des cellules
triées au cytomètre de flux (Tableau 1, page 8).
•
Le design innovant de la colonne, avec une bague de sécurité en entonnoir et une
membrane de faible surface permettent d’éluer l’ARN dans un volume réduit de 5 – 30 μL.
Ainsi, l’ARN purifié est élué avec une forte concentration, et est prêt à l’emploi pour les
applications (ex : RT‑PCR)
•
Le rendement ARN dépend fortement de la nature de l’échantillon, de sa qualité et de la
quantité utilisée (voir Tableau 2, page 8 pour plus de détails).
•
L’ARN de haut intégrité est obtenu (RNA Integrity Number (RIN) > 9 selon la méthode
Agilent 2100 Bioanalyzer) aussi bien pour de petits échantillons (par ex. 10³ cellules, ou
0.1 mg de tissus) que pour des quantités de matériel biologique plus importantes (ex :
10⁵ cellules, 5 mg de tissus). Le ratio ARNr (28S / ​18S) est généralement de 1.8 – 2.0. La
qualité de l’ARN est toutefois très liée à la qualité des échantillons (voir Chapitre 6.3).
•
Le kit NucleoSpin® RNA XS permet la purification de l’ARN avec un ratio A₂₆₀/A₂₈₀
généralement supérieur à 1.9 (mesuré en tampon TE pH 7.5). Etant donné la pureté
élevée de l’ARN obtenu, une grande partie de la fraction éluée peut être utilisée
comme matrice pour les RT-PCR sans inhibition (ex : 8 μL sur 10 μL d’éluat total utilisé
comme matrice dans un mix de qRT-PCR de 20 µL génère un signal plus important en
6
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
Extraction des ARN
comparaison à des réactions menées avec une quantité moindre de matrice (PCR en
LightCycler avec un kit Sigma SYBR Green de RT-PCR Quantitative).
•
La durée de la procédure est d’environ 45 minutes pour 12 échantillons.
•
Le kit contient un agent réducteur, le TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine). Le TCEP est
inodore, plus stable, plus spécifique des ponts disulfures et moins toxique que les autres
agents réducteurs utilisés habituellement.
•
L’ARN Carrier (ARN poly(-A) : sel de potassium poly(A), préparé à partir d’ADP avec la
polynucléotide phosphorylase) est inclus dans le kit pour des performances optimales sur
les plus petits échantillons.
L’utilisation de l’ARN Carrier est recommandée par ajout au lysat (20 ng par échantillon).
Une telle petite quantité n’interfère pas dans les applications de RT-PCR, même lors
de l’utilisation d’amorces oligo-dT. La faible quantité d’ARN Carrier transférée dans
la réaction de RT-PCR est généralement sans influence sur le résultat de la réaction,
en raison du large excès d’amorces oligo-dT. Le bénéfice lié à l’ajout de l’ARN Carrier
au lysat dépend du type d’échantillon, de la quantité initialement utilisée et du type
d’analyse en aval de l’ARN. L’ARN Carrier devra être omis pour les applications suivantes :
- si une purification spécifique de l’ARN poly-A est ensuite effectuée.
- si l’ARN est ensuite soumis à un séquençage
•
La rDNase est fournie dans le kit. Les contaminants en ADN sont éliminés lors d’une
digestion avec la rDNase directement appliquée sur la membrane de silice. Pour les
applications les plus sensibles aux contaminations résiduelles en ADN, (ex : analyse de
l’expression de gènes à partir de cellules transfectées avec des plasmides, analyse de
gènes plastidiaux ou mitochondriaux) une digestion supplémentaire utilisant la rDNase en
solution dans l’éluat est possible.
•
Réservé à l’usage de la recherche
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
7
Extraction des ARN
Tableau 1 : Résumé des caractéristiques du kit
Paramètres
NucleoSpin® RNA XS
Format
Colonne Mini à centrifuger – Design XS
Echantillon
Petites quantités d’échantillon
< 5 mg de tissus,
< 100 000 cellules en culture
Taille des fragments
> 200 nt
Rendement
Voir les exemples des données dans le tableau 2
A₂₆₀/A₂₈₀
1.9 – 2.1
RIN
(RNA integrity number)
> 9 (selon la qualité de l’échantillon)
Volume d’élution
5 – 30 µL
Temps de préparation
35 min/6 preps
Capacité de fixation
110 µg
Tableau 2 : Aperçu des rendements moyens en ARN obtenus à l’aide du
NucleoSpin® RNA XS
Echantillon
Rendement moyen
5
1000 – 1500 ng
4
10 cellules HeLa
100 – 150 ng
103 cellules HeLa
10 – 15 ng
102 cellules HeLa
0.1 – 1.5 ng
5 mg de foie de souris
5 – 8 µg
1 mg de foie de souris
2 µg
10 cellules HeLa
8
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
Extraction des ARN
2.3
Manipulation, préparation et stockage des échantillons
Environnement de travail
Maintenir un environnement de travail exempt de RNases. Porter des gants à tout moment
pendant la préparation. Changer de gants fréquemment.
Stockage des échantillons et inhibition des RNases
Les RNases peuvent dégrader rapidement l’ARN contenu dans les échantillons si ceux-ci
ne sont pas protégés de l’activité des RNases après la collecte. Utiliser l’une des méthodes
suivantes pour éviter la dégradation de l’ARN :
•
Utiliser un échantillon fraîchement prélevé pour une lyse immédiate et une purification de
l’ARN.
•
Immerger et conserver les échantillons dans du NucleoProtect® RNA ou dans des
solutions de stabilisation similaires. Veiller à ce que l’échantillon soit complètement
imprégné de la solution de stabilisation avant de le congeler. Retirer l’excès de solution
de stabilisation de l’échantillon avant l’isolement de l’ARN conformément au manuel
d’utilisation de la solution de stabilisation.
•
Congeler rapidement l’échantillon dans de l’azote liquide immédiatement après la récolte
et le conserver à -70 °C. Les échantillons congelés sont stables jusqu’à 6 mois. Un
mortier et un pilon peuvent être utilisés pour pulvériser l’échantillon à l’état congelé. Veiller
à ce que l’échantillon ne soit pas décongelé avant d’entrer en contact avec le tampon de
lyse.
•
Conserver les échantillons dans le tampon de lyse RA1 après le broyage à -70 °C jusqu’à
un an, à 4 °C jusqu’à 24 heures ou à température ambiante pendant quelques heures.
Les échantillons congelés dans le tampon de lyse RA1 doivent être décongelés lentement
avant de commencer l’extraction de l’ARN.
Broyage et homogénéisation de l’échantillon
•
Cellules cultivées en suspension :
Récolter les cellules par centrifugation, éliminer le surnageant et ajouter immédiatement le
tampon de lyse RA1 conformément à l’étape 2 du protocole standard (voir les chapitres
5.1, 6.1).
•
Culture de cellules adhérentes (lyse en boîte de culture) :
Aspirer complètement le milieu de culture. Ajouter immédiatement le tampon de lyse RA1
à la boîte de culture cellulaire. Éliminer complètement le milieu de culture afin de permettre
une lyse complète par le tampon de lyse. Poursuivre par la filtration du lysat (étape 3 du
protocole standard).
•
Culture de cellules adhérentes (lyse après trypsinisation) :
Aspirer le milieu de culture et laver les cellules avec du PBS. Aspirer le PBS. Ajouter
0,1 – 0,3 % de trypsine dans du PBS et incuber pendant une durée appropriée pour
détacher les cellules de la surface de la boîte. Après le décollement des cellules, ajouter
du milieu, transférer les cellules dans un tube approprié (non fourni) et les culotter par
centrifugation pendant 5 minutes à 300 x g. Éliminer le surnageant et ajouter le tampon
de lyse RA1 au culot cellulaire.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
9
Extraction des ARN
•
Tissus d’animaux :
Pour une préparation efficace de l’ARN, il est essentiel que tout l’ARN contenu dans
l’échantillon soit libéré des cellules par broyage et que la viscosité de l’échantillon soit
réduite par homogénéisation. La décongélation des échantillons de tissus non broyés
doit être effectuée uniquement en présence du tampon de lyse RA1 et pendant le
broyage mécanique, par exemple avec un broyeur à rotor-stator ou un système à billes.
Ceci garantit que l’ARN n’est pas dégradé par des RNases avant même de débuter la
procédure de purification.
Les techniques courantes de broyage des tissus d’animaux sont, par exemple, la
méthode ’pilon et mortier’ ou l’utilisation de seringues et aiguilles, permettant, après
de multiples passages du lysat, d’homogénéiser l’échantillon. Cependant, les échantillons
utilisables avec le kit NucleoSpin® RNA XS étant de petite taille, ces méthodes de
broyage sont souvent inapplicables.
2.4
Procédures d’élution
Une concentration élevée de l’ARN purifié est généralement souhaitée pour les applications
avales. En particulier en raison du volume limité des réactions effectuées, la concentration de
l’ARN analysé peut être déterminante. A cause d’un volume d’élution minimal élevé, les kits
standards produisent généralement un ARN faiblement concentré si de petits échantillons
biologiques sont utilisés pour l’extraction. De telles concentrations nécessitent souvent une
étape de concentration supplémentaire de l’ARN afin de rendre l’analyse possible.
Contrairement aux kits standards, le kit NucleoSpin® RNA XS permet une élution performante
dans un volume final réduit, induisant une concentration élevée de l’ARN purifié.
Des volumes d’élution de 5 – 30 μL sont recommandés, le volume d’élution préconisé par
défaut est de 10 μL.
2.5
Stabilité de l’ARN purifié
L’ARN purifié doit être immédiatement placé et conservé sur la glace pour une stabilité optimale.
La contamination par des RNases quasiment omniprésentes (matériel, traces de doigts,
poussières) constitue une menace pour l’ARN extrait. Pour un stockage à court terme, congeler
l’ARN à -20 °C ou à -70 °C pour une conservation de longue durée.
10
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
Extraction des ARN
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention : Les tampons RA1, RA2 et MDB contiennent un sel chaotropique et des détergents.
Porter des gants et des lunettes de protection !
ATTENTION : les tampons RA1, RA2 et MDB contiennent du thiocyanate de guanidine pouvant
induire la formation de composés hautement réactifs en présence de Javel (hypochlorite de
sodium). NE PAS ajouter de Javel ou de solutions acides directement dans les déchets liquides
issus de la procédure.
•
Stocker la rDNase lyophilisée, l’agent réducteur TCEP, et l’ARN Carrier à 4 °C à
réception du kit (stabilité pendant 1 an maximum).
•
Tous les autres constituants du kit doivent être stockés entre 15 – 25 °C et sont stables
jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Le stockage à des températures inférieures peut entraîner
la précipitation de sels.
•
Vérifier la disponibilité de l’éthanol 70 % pour l’ajout au lysat de l’échantillon dans le
tampon RA1 pour l’étape de création des conditions de fixation de l’ARN.
•
Vérifier la disponibilité de l’éthanol 96 – 100 % (pour le protocole de purification de l’ARN
seulement).
Avant de débuter la procédure NucleoSpin® RNA XS, préparez :
•
rDNase : Ajouter le volume indiqué sur le flacon (ou voir tableau ci-dessous) d’H2O
RNase-Free dans le flacon de rDNase lyophilisée et incuber pendant 1 min à température
ambiante. Retourner doucement le flacon pour dissoudre totalement la rDNase. Veiller
à ne pas mélanger la rDNase vigoureusement, l’enzyme étant sensible à l’agitation
mécanique. Distribuer en aliquotes et stocker -20 °C. La solution congelée est stable
pendant 6 mois. Ne pas congeler/décongeler les aliquotes plus de trois fois.
•
Agent réducteur TCEP : Ajouter le volume indiqué d’H2O RNase-Free dans le flacon et
incuber quelques minutes à température ambiante. Mélanger pour dissoudre totalement
le TCEP. Stocker le TCEP dissout à -20 °C.
•
ARN Carrier : Préparer une solution stock à la première utilisation. Dissoudre l’ARN
Carrier dans 750 μL de tampon RA1 de manière à obtenir une solution stock à
400 ng/μL. Préparer une solution de travail avant l’extraction de l’ARN : diluer à 1 :100
avec le tampon RA1 (ex : 1 μL de solution stock d’ARN Carrier + 99 μL de tampon RA1)
afin d’obtenir une solution de travail à 4 ng/μL. Utiliser ensuite 5 μL de cette solution de
travail (20 ng de carrier ARN) dans chaque lysat (étape 3 du protocole, voir chapitre 5).
Conserver la solution stock à -20 °C ; ne pas préparer à l’avance la solution de travail,
celle-ci doit être préparée fraichement avant chaque utilisation.
Note : En raison du mode de production, l’ARN Carrier lyophilisé peut être difficilement
visible dans le flacon.
•
Tampon de lavage RA3 : Ajouter le volume indiqué d’éthanol 96 – 100 % dans le tampon
RA3 concentré. Indiquer sur le flacon l’ajout de l’éthanol. Conserver le tampon de
lavage RA3 à 15 – 25 °C pendant au plus 1 an.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
11
Extraction des ARN
NucleoSpin® RNA XS
10 préps
740902.10
50 préps
740902.50
250 préps
740902.250
Tampon de lavage
RA3 (Concentré)
6 mL
Ajouter 24 mL
d’éthanol
12 mL
Ajouter 48 mL
d’éthanol
50 mL
Add 200 mL ethanol
to each bottle
rDNase,
exempt de RNase
(lyophilisée)
1 tube (taille A)
Ajouter 55 µL
d’H₂O RNase-free
1 tube (taille C)
Ajouter 230 µL
d’H₂O RNase-free
2 tube (taille D)
Ajouter 540 µL
d’H₂O RNase-free
à chaque tube
300 µg
300 µg
300 µg
REF
ARN Carrier
Ajouter 750 μL de tampon RA1 pour obtenir une solution stock
concentrée.
Diluer 1:100 avec le tampon RA1 pour obtenir la solution de travail.
Agent réducteur
TCEP
12
14 mg
Ajouter 100 µL
d’H₂O RNase-free
3 × 14 mg
Ajouter 100 µL
d’H₂O RNase-free
à chaque tube
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
2 × 107 mg
Ajouter 750 µL
d’H₂O RNase-free
à chaque tube
Extraction des ARN
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® RNA XS, porter des vêtements de protection
appropriés (par exemple : une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de
protection). Pour plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité appropriées
(FDS disponibles en ligne sur www.mn‑net.com/msds).
Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans les tampons RA1 et RA2 peuvent former des
composés hautement réactifs lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de Javel ! Par conséquent,
n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement dans les déchets liquides issus
de la procédure.
Les déchets générés par le kit NucleoSpin® RNA XS n’ont pas été testés pour la présence de
matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux
résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement dénaturant et du
traitement à la protéinase K mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les
déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés
conformément aux réglementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions réglementaires locales.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
13
Extraction des ARN
5
Protocoles
5.1
Purification d’ARN à partir de cellules en culture, de
cellules isolées par capture laser ou de cryosections
microdisséquées
Avant de débuter la préparation :
•
1
Vérifier que le TCEP, l’ARN Carrier, la rDNase et le tampon de lavage RA3 ont bien été
préparés selon les indications du chapitre 3.
Préparer l’échantillon
Préparer un échantillon tel qu’un culot de cellules en culture
(10⁵ maximum), de cellules isolées ou des cryosections
microdisséquées) dans un microtube (non fourni).
Pour des détails sur les quantités d’échantillon appropriées,
voir le paragraphe 2.2.
2
Lyser et homogénéiser les cellules
Ajouter 100 μL de tampon RA1 et 2 μL de TCEP à
l’échantillon puis vortexer vigoureusement (2 × 5 s).
+ 100 µL RA1
+ 2 µL TCEP
Si des séries d’échantillons sont traitées, la préparation d’un
prémix est recommandée (par ex : 1,1 mL de tampon de lyse
RA1 et 22 µL de TCEP pour 10 préparations en parallèle.
Utiliser pour chaque échantillon, 102 µL de ce mélange).
La procédure suffit généralement pour homogénéiser les
cellules en culture, les cellules isolées par capture laser ou
les cryosections microdisséquées. Pour plus de détails
concernant les méthodes d’homogénéisation, voir le
paragraphe 2.3.
3
Ajouter l’ARN Carrier
Ajouter 5 µL de solution de travail d’ARN Carrier (20 ng) au
lysat. Mélanger en vortexant (2 × 5 s). Centrifuger brièvement
(environ 1 s 1000 x g) pour nettoyer le bouchon.
+ 5 µL
ARN Carrier
Mélanger
Pour la préparation de la solution de travail de l’ARN Carrier,
voir le chapitre 3
4
Filtrer le lysat (optionnel)
Placer une colonne NucleoSpin® Filter (bague violette) dans
un tube collecteur (2 mL ; fourni), déposer le mélange et
centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g.
Cette étape peut être omise pour les échantillons de petite
taille, par exemple, inférieurs à 10⁵ cellules.
14
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
11,000 x g
30 s
Extraction des ARN
5
Ajuster les conditions de fixation de l’ARN
Jeter le NucleoSpin® Filter (bague violette). Ajouter 100 μL
d’éthanol (70 %) au lysat homogénéisé et mélanger par
pipetage (5 fois).
+ 100 µL
70 % EtOH
Mélanger
Autrement, ajouter 100 µL d’éthanol (70 %) à l’échantillon
dans un tube 1,5 mL (non fourni) et mélanger en vortexant
(2 × 5 s). Centrifuger brièvement (environ 1 s à 1000 x g)
pour nettoyer le bouchon. Pipeter le lysat 2 fois avant de
charger le lysat.
6
Fixer l’ARN
Pour chaque préparation, prendre une colonne
NucleoSpin® RNA XS (bague bleue claire) et placer dans un
tube collecteur. Charger le lysat sur la colonne. Centrifuger
pendant 30 s à 11,000 × g.
Placer la colonne dans un nouveau tube collecteur 2 mL.
®
Le volume maximal de la colonne NucleoSpin RNA XS
est de 600 μL. Répéter la procédure si un volume de lysat
supérieur est utilisé.
7
11,000 x g
30 s
Dessaler la membrane de silice
Ajouter 100 μL de tampon MDB (Tampon de dessalage
de la membrane) et centrifuger à 11,000 × g pendant 30 s
pour sécher la membrane. Il n’est pas nécessaire d’utiliser un
nouveau tube collecteur après cette étape de centrifugation.
L’élimination des sels rend le traitement à la rDNase beaucoup
plus efficace. Si, pour quelque raison, l’embout de sortie de la
colonne est entré en contact avec le filtrat, jeter le liquide et
centrifuger à nouveau 30 s à 11,000 × g.
8
Charger le
lysate
+ 100 µL MDB
11,000 x g
30 s
Digérer l’ADN
Préparer le mélange réactionnel de rDNase dans un
microtube stérile (non inclus) : pour chaque préparation,
ajouter 3 μL de rDNase reconstituée (voir chapitre 3) à
27 μL de tampon de réaction pour la rDNase. Mélanger
en tapotant le tube
Déposer 25 μL de mélange réactionnel de rDNase
directement au centre de la membrane de silice. Refermer la
colonne. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
+ 25 µL
Mélange
réactionel
rDNase
TA
15 min
Il n’est pas nécessaire de changer le tube collecteur après
l’étape d’incubation.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
15
Extraction des ARN
9
Laver et sécher la membrane de silice
+ 100 µL RA2
1er lavage
Ajouter 100 µL de tampon RA2 dans la colonne
NucleoSpin® RNA XS. Incuber pendant 2 min à TA.
Centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g.
Placer la colonne dans un nouveau tube collecteur (2 mL).
TA
2 min
11,000 x g
30 s
Le tampon RA2 inactivate la rDNase.
2ième lavage
+ 400 µL RA3
Ajouter 400 µL de tampon RA3 dans la colonne
NucleoSpin® RNA XS Centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g.
Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur.
11,000 x g
30 s
Note : veiller à éliminer avec le tampon RA3 les résidus de
tampons des étapes précédentes, en particulier si le lysat
est entré en contact avec l’ouverture de la colonne pendant
l’étape de chargement du lysat sur la colonne. Pour un lavage
efficace, rincer l’ouverture avec le tampon RA3.
+ 200 µL RA3
3ième lavage
11,000 x g
2 min
Ajouter 200 µL de tampon RA3 dans la colonne
NucleoSpin® RNA XS. Centrifuger 2 min à 11,000 x g pour
sécher la membrane. Placer la colonne dans un tube d’élution
exempt de nucléases (1.5 mL ; founi).
Si, pour quelque raison, l’embout de sortie de la colonne est
entré en contact avec le filtrat, jeter le liquide et centrifuger à
nouveau 30 s à 11,000 x g.
10
Eluer l’ARN purifié
Eluer l’ARN dans 10 µL H2O (RNase-free ; fourni) et
centrifuger à 11,000 x g pour 30 s.
Si une concentration supérieure ou encore un volume final
supérieur sont souhaités, le volume peut être ajusté de 5 à
30 μL.
Pour plus de détails voir le paragraphe 2.4.
16
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
+ 10 µL RNasefree H2O
11,000 x g
30 s
Extraction des ARN
5.2
Purification de l’ARN de tissus
Avant de débuter la préparation :
•
1
Vérifier que le TCEP, l’ARN Carrier, la rDNase et le tampon de lavage RA3 ont bien été
préparés selon les indications du chapitre 3.
Préparer l’échantillon
Préparer un échantillon tel qu’une biopsie dans un
microtube (non fourni).
Pour les quantités de tissus recommandées, voir le
paragraphe 2.2.
2
Lyser et homogénéiser les tissus
Ajouter 200 μL de tampon RA1 et 4 μL de TCEP à
l’échantillon et vortexer vigoureusement (2 × 5 s).
+ 200 µL RA1
+ 4 µL TCEP
L’utilisation d’un broyeur à rotor-stator ou d’un système
à billes sont des méthodes recommandées pour
l’homogénéisation des échantillons de tissus. Pour plus de
remarques concernant les méthodes d’homogénéisation,
voir le paragraphe 2.3.
Si les échantillons sont traités en série, la préparation d’un
prémix est recommandée (ex : 2.2 mL de tampon RA1 et
44 μL de TCEP pour 10 préparations). Utiliser 204 μL de ce
mélange par échantillon.
3
Ajouter l’ARN Carrier
Ajouter 5 µL de solution de travail d’ARN Carrier (20 ng)
au lysat. Mélanger en vortexant (2 × 5 s). Centrifuger
brièvement (environ 1 s à 1000 x g) pour nettoyer le
bouchon.
Voir le chapitre 3 pour la préparation de l’ARN Carrier.
4
+ 5 µL
ARN Carrier
Mélanger
Filtrer le lysat
Reduire la viscosité et clarifier le lysat par filtration à travers un
NucleoSpin® Filter (bague violette) : placer le NucleoSpin®
Filter dans un tube collecteur 2 mL (fourni), déposer
l’échantillon et centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g.
11,000 x g
30 s
Si un culot visible se forme (en fonction de la nature et la
quantité d’échantillon), transférer le surnageant dans un
nouveau tube 1,5 mL (non fourni) en évitant tout matériel
insoluble.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
17
Extraction des ARN
5
Ajuster les conditions de fixation de l’ARN
Jeter le NucleoSpin® Filter (bague violette), ajouter 200 µL
d’éthanol (70 %) au lysat homogénéisé et mélanger en
pipetant (5 fois).
+ 200 µL
70 % EtOH
Mélanger
Autrement, transférer le filtrat dans un nouveau tube 1,5 mL
(non fourni), ajouter 200 μL d’éthanol (70 %), et mélanger
en vortexant (2 × 5 s). Centrifuger brièvement (environ 1 s
à 1000 x g) pour nettoyer le bouchon. Pipeter le lysat deux
fois pour le mélanger avant de le transférer.
Après ajout d’’éthanol, un précipité filandreux peut
apparaître, ceci n’affectera pas la procédure d’extraction
de l’ARN. Veiller à désagréger totalement ce précipité en
mélangeant et charger l’ensemble sur la colonne comme
indiqué à l’étape 6. Ne pas centrifuger le lysat après ajout
de l’éthanol et avant chargement de la colonne afin d’éviter
de culotter le précipité.
6
Fixer l’ARN
Pour chaque échantillon, prendre une colonne
NucleoSpin® RNA XS (bague bleue) placée dans son
tube collecteur et charger le lysat. Centrifuger pendant
30 s à 11,000 x g. Placer la colonne dans un nouveau tube
collecteur (2 mL).
Le volume utile de la colonne NucleoSpin® RNA XS est de
600 µL. Répéter cette étape si un volume de lysat supérieur
est utilisé.
7
11,000 x g
30 s
Dessaler la membrane de silice
Ajouter 100 µL de tampon MDB (Tampon de dessalage
de la membrane) et centrifuger à 11,000 x g pendant
30 s pour sécher la membrane. Il n’est pas nécessaire
d’utiliser un nouveau tube collecteur après cette étape de
centrifugation.
L’élimination des sels rend le traitement à la rDNase
beaucoup plus efficace. Si, pour quelque raison, l’embout
de sortie de la colonne est entré en contact avec le filtrat,
jeter le liquide et centrifuger à nouveau.
18
Charger le lysat
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
+ 100 µL MDB
11,000 x g
30 s
NucleoSpin® RNA XS
8
Digérer l’ADN
Préparer le mélange réactionnel de rDNase dans un
microtube stérile (non inclus) : pour chaque préparation,
ajouter 3 μL de rDNase reconstituée (voir le chapitre 3) à
27 μL de tampon de réaction pour la rDNase. Mélanger
en tapotant le tube.
Déposer 25 μL de mélange réactionnel de rDNase
directement au centre de la membrane de silice. Refermer
la colonne. Incuber à température ambiante pendant
15 min.
+ 25 µL
Mélange
réactionnel
rDNase
TA
15 min
Il n’est pas nécessaire de changer le tube collecteur après
l’étape d’incubation.
9
Laver et sécher la membrane de silice
Ajouter 100 µL de tampon RA2 dans la colonne
NucleoSpin® RNA XS. Incuber pendant 2 min à TA.
Centrifuger pendant 30 s à 1 g.
Placer la colonne dans un tube collecteur 2 mL
Le tampon RA2 inactive la rDNase.
Ajouter 400 µL de tampon RA3 dans la colonne
NucleoSpin® RNA XS. Centrifuger pendant 30 s à
11,000 × g. Jeter le filtrat et replacer la colonne sur un tube
collecteur.
Ajouter 200 µL de tampon RA3 dans la colonne
NucleoSpin® RNA XS. Centrifuger pendant 2 min à
11,000 x g pour sécher la membrane. Placer la colonne
dans un tube d’élution exempt de nucléases (1.5 mL ;
fourni).
Si, pour quelque raison, l’embout de sortie de la colonne est
entré en contact avec le filtrat, jeter le liquide et centrifuger
à nouveau 30 s à 11,000 × g.
10
+ 100 µL RA2
TA
2 min
11,000 x g
30 s
+ 400 µL RA3
11,000 x g
30 s
+ 200 µL RA3
11,000 x g
2 min
Eluer l’ARN purifié
Eluer l’ARN dans 10 µL d’H2O (RNase-free ; fournie) et
centrifuger à 11,000 × g pendant 30 s.
Si des concentrations en ARN supérieures ou encore un
volume final supérieur sont souhaités, le volume d’élution
utilisé peut être ajusté de 5 à 30 µL.
+ 10 µL RNasefree H2O
11,000 x g
30 s
Pour plus de détails concernant les procédures alternatives
d’élution, voir le paragraphe 2.4.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
19
NucleoSpin® RNA XS
5.3
Purification et concentration de l’ARN
Avant de débuter la préparation :
•
1
Vérifier que le tampon de lavage RA3 a bien été préparé selon les indications du chapitre
3.
Préparer l’échantillon
Fournir jusqu’à 300 µL d’échantillon comme de l’ARN
purifié (ex : purifié au phénol) ou de mélange réactionnel
d’ARN (ex : réaction de marquage) dans un microtube (non
fourni).
Echantillon
Voir le paragraphe 2.2 pour plus de détails sur les quantités
d’échantillon initial.
2
Préparer le mélange de lyse - fixation
Pour chaque fraction de 100 µL d’échantillon, mélanger
25 μL de tampon RA1 et 75 μL d’éthanol (96 – 100 %).
Si des séries d’échantillons sont à traiter, préparer un
prémix (1 volume de tampon RA1 plus 3 volumes d’éthanol
96 – 100 %).
+ 25 µL RA1
+ 75 µL EtOH
(96 – 100 %)
par 100 µL
d’échantillon
Mélanger
3
Ajouter l’ARN Carrier
Inutile !
4
Filtrer le lysat
Inutile !
5
Ajuster les conditions de fixation de l’ARN
Ajouter un volume de prémix à l’échantillon (ex : 100 µL
de prémix à 100 µL d’échantillon) et mélanger en vortexant
(2 × 5 s). Si nécessaire, centrifuger brièvement (environ 1 s
à 1000 x g) pour nettoyer le bouchon.
6
Mélanger
Fixer l’ARN
Pour chaque échantillon, prendre une colonne
NucleoSpin® RNA XS (bague bleue claire) placée dans
son tube collecteur 2 mL et charger le lysat dans la
colonne. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g. Pour les
échantillons de volume > 300 µL, charger la colonne en
deux fois.
Replacer la colonne dans un tube collecteur 2 mL neuf.
Pour les applications les plus exigeantes, le rendement de
purification peut être accru ainsi : centrifuger 30 s à 2,000
x g avant la centrifugation de 30 s à 11,000 x g.
20
Ajouter 1 vol. de
prémix à 1 vol
d’échantillon
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
Charger le lysat
11,000 x g
30 s
NucleoSpin® RNA XS
7
Dessalage de la membrane
Inutile !
8
Digestion de l’ADN
Inutile !
9
Laver et sécher la membrane de silice
+ 400 µL RA3
1er lavage
Déposer 400 μL de tampon RA3 dans la colonne
NucleoSpin® RNA XS. Centrifuger pendant 30 s à
11,000 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le
tube collecteur.
2ième lavage
11,000 x g
30 s
+ 200 µL RA3
Déposer 200 µL de tampon RA3 dans la colonne
NucleoSpin® RNA XS. Centrifuger pendant 2 min à
11,000 x g pour sécher la membrane. Placer la colonne
dans un tube d’élution exempt de nucléases (1,5 mL ;
fourni).
11,000 x g
2 min
Si, pour quelque raison, l’embout de sortie de la colonne
est entré en contact avec le filtrat, jeter le liquide et
centrifuger à nouveau 30 s à 11,000 x g.
10
Eluer l’ARN purifié
Eluer l’ARN dans 10 μL d’H2O (RNase-free ; fournie) et
centrifuger à 11,000 x g pendant 30 s.
Si des concentrations supérieures en ARN ou encore un
volume final supérieur sont souhaités, le volume d’élution
utilisé peut être ajusté de 5 à 30 µL.
+ 10 µL RNasefree H2O
11,000 x g
30 s
Pour plus de détails concernant les procédures alternatives
d’élution, voir le paragraphe 2.4.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
21
NucleoSpin® RNA XS
5.4
Digestion en solution avec la rDNase
La digestion effectuée selon la procédure standard directement sur la colonne est très efficace
et induit une contamination en ADN résiduel minime. Cet ADN résiduel ne sera pas détectable
dans la plupart des applications. Cependant, l’élimination de l’ADN à un niveau totalement
indétectable est difficile et l’efficacité de la digestion sur la membrane peut s’avérer parfois
perfectible pour certaines applications très sensible à la moindre trace d’ADN résiduel.
Parmi les applications sensibles figurent les réactions de RT-PCR utilisant des amorces
ne différenciant pas les ADNc (dérivés de l’ARN) et l’ADN génomique contaminant. Plus
particulièrement si :
•
des cibles présentes en grands nombre de copies sont analysées (ex : familles
multigéniques, cibles mitochondriales, plastidiales ou plasmidiques (après transfections
des cellules))
•
le gène cible a un niveau d’expression très faible.
•
l’amplicon est plutôt petit (< 200 bp).
La digestion de l’ADN en solution peut efficacement détruire l’ADN contaminant. Cependant,
un contrôle strict des RNases et une nouvelle étape de purification de l’ARN (afin d’éliminer les
tampons, les sels, la rDNase et l’ADN digéré) sont habituellement nécessaires.
La DNase recombinante de haute qualité, exempte de RNase, incluse dans le kit
NucleoSpin® RNA XS facilite la digestion en solution de manière à éliminer toute trace d’ADN
contaminant.
22
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
NucleoSpin® RNA XS
A
Digérer l’ADN (Préparation de la réaction)
Préparer un prémix enzyme-tampon : ajouter 1 μL de rDNase à 10 μL de tampon de
réaction pour la rDNase.
Ajouter 1/10 volume de mélange enzyme-tampon à l’ARN élué (par ex : à 10 µL
d’ARN, ajouter 1 µL de prémix contenant l’enzyme et le tampon).
B
Incuber l’échantillon
Incuber pendant 10 min à 37 °C.
C
Repurifier l’ARN
Repurifier l’ARN avec une procédure appropriée, par exemple en utilisant une
précipitation à l’éthanol ou un kit dédié NucleoSpin® RNA Clean-up XS (voir les
Informations de commande).
Précipitation à l’éthanol, exemple :
Ajouter 0.1 volume d’acétate de sodium 3 M, pH 5.2 et 2.5 volume d’éthanol
96 – 100 % à un volume d’échantillon. Mélanger précautionneusement.
Incuber pendant une durée de plusieurs minutes à plusieurs heures respectivement à
-20 °C ou à 4 °C.
Note : Choisir une durée d’incubation élevée si l’échantillon contient peu d’ARN. Une
incubation courte est généralement suffisante si l’échantillon est fortement concentré
en ARN.
Centrifuger pendant 10 min à vitesse maximale.
Laver le culot avec de l’éthanol 70 %.
Sécher le culot d’ARN et resuspendre dans de l’eau RNase-free.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
23
NucleoSpin® RNA XS
6
Annexes
6.1
Guide de résolution des problèmes
Problèmes
Causes possible et suggestions
Contamination en RNases
•
ARN dégradé / ​
rendement nul
Créer un environnement de travail RNase-Free. Porter des gants
pendant toute la procédure et les changer fréquemment. Utiliser
des tubes jetables stériles en polypropylène. Conserver les tubes
clos aussi souvent que possible pendant l’extraction. Les éventuels
contenants en verre devront avoir été soumis à un traitement
thermique d’au moins 2 heures à 250 °C avant utilisation.
Mauvaise utilisation ou préparation des réactifs
•
Réactifs mal préparés. Ajouter le volume indiqué d’H2O RNaseFree au flacon de rDNase et d’éthanol 96 % au tampon de lavage
concentré RA3 et mélanger. Reconstituer et stocker la rDNase
lyophilisée selon les instructions du chapitre 3.
•
Echantillons et réactifs mal homogénéisés. Toujours vortexer
vigoureusement après l’ajout d’un réactif.
•
Omission de l’ajout d’éthanol après la lyse. La fixation de l’ARN à la
membrane de silice n’est efficace qu’en présence d’éthanol.
Stockage du kit
ARN de
faible qualité / ​
rendement faible
•
Reconstituer et stocker la rDNase lyophilisée selon les instructions
du chapitre 3.
•
Stocker les autres composants du kit à température ambiante.
La conservation à des températures inférieures peut induire la
précipitation de sels.
•
Conserver les flacons bien clos afin de prévenir l’évaporation ou la
contamination des solutions.
Influence de la force ionique et du pH sur l’absorption A₂₆₀ et donc sur le
ratio A₂₆₀/A₂₈₀
•
24
Pour la mesure de l’absorption, utiliser du Tris 5 mM pH 8,5 comme
diluant. Voir aussi :
- Manchester, K L. 1995. Value of A₂₆₀ / A₂₈₀ ratios for measurement
of purity of nucleic acids. Biotechniques 19, 208 – 209.
- Wilfinger, W W, Mackey, K and Chomczyski, P. 1997. Effect of pH
and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic
acid purity. Biotechniques 22, 474 – 481.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
NucleoSpin® RNA XS
Problèmes
Causes possible et suggestions
Echantillons
•
Mauvaises conditions de stockage des échantillons. Autant que
possible, utiliser du matériel frais. Sinon, congeler les échantillons
dans l’azote liquide dès la collecte. Les échantillons doivent être
stockés à -70 °C. Ne jamais laisser les tissus décongeler avant ajout
du tampon RA1. Procéder au broyage immédiatement après ajout
du tampon RA1.
•
Broyage et/ou homogénéisation de l’échantillon insuffisants.
Veiller à un broyage complet et utiliser les NucleoSpin® Filters pour
homogénéiser facilement le lysat.
ARN de
faible qualité / ​
rendement faible
(Suite)
Contamination par le thiocyanate de guanidine
Faible ratio A₂₆₀/
A230
•
Déposer précautionneusement le lysat dans la colonne NucleoSpin®
RNA XS en essayant d’éviter de contaminer l’ouverture supérieur de
la colonne et le bouchon.
•
Veiller à éliminer le tampon de lavage RA2 avec le tampon suivant
RA3. Déposer le RA3 de manière à rincer toute la surface interne de
la colonne.
Echantillons
•
Colonne
NucleoSpin®
RNA colmatée / ​
Faible rendement
•
et/ou qualité
Quantité excessive de matériel initial. La surcharge entraîne un
rendement amoindri. Réduire la quantité d’échantillon ou utiliser un
volume supérieur de RA1.
Broyage et/ou homogénéisation de l’échantillon insuffisants.
Veiller à un broyage complet et utiliser les NucleoSpin® Filters pour
homogénéiser facilement le lysat.
rDNase insuffisament active
•
Contamination
de l’ARN
par l’ADN
génomique
Reconstituer et stocker la rDNase lyophilisée selon les instructions
du chapitre 3.
Mauvaise utilisation de la rDNase
•
Déposer la solution de rDNase directement au centre de la
membrane de silice et fermer le bouchon.
Quantité d’échantillon excessive
•
Réduire la quantité de cellules ou de tissus utilisée.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
25
NucleoSpin® RNA XS
Problèmes
Causes possible et suggestions
Système de détection de l’ADN trop sensible
•
Contamination
de l’ARN
par l’ADN
génomique
(suite)
La contamination en ADN est efficacement réduite par la digestion
à la rDNase effectuée sur la membrane. Cependant, il est difficile de
garantir l’élimination totale de l’ADN, aussi, pour des applications
très sensibles, il peut parfois s’avérer possible de détecter de l’ADN
résiduel.
La probabilité de détection d’ADN par PCR augmente avec .
- le nombre de copies d’ADN par préparation : cible monocopie < cible
plastidiale/mitochondriale < cible plasmidique (après transfection)
- la réduction de la taille de l’amplicon.
•
Utiliser si possible des cibles de PCR plus grandes (ex : > 500 bp)
ou des amorces couvrant les introns.
•
Utiliser le protocole additionnel 5.4 pour mener une digestion
supplémentaire en solution avec la rDNase.
Contamination par de l’éthanol ou des sels
Performance
suboptimale de
l’ARN dans les
applications
•
Ne pas laisser l’embout de sortie de la colonne entrer en contact
avec le filtrat après le second lavage avec le tampon RA3. Veiller
à centrifuger à la vitesse et pendant la durée recommandée afin
d’éliminer totalement le tampon éthanolique RA3.
•
Vérifier que le tampon RA3 est bien à température ambiante. Le
lavage avec le tampon à température inférieure réduit l’efficacité de
dessalage du tampon RA3.
•
En fonction de la robustesse du système de RT-PCR utilisé, la
réaction peut être inhibée si la totalité de l’éluat est utilisée comme
matrice pour la RT-PCR. Utiliser un volume moindre d’éluat.
Conserver l’ARN proprement
•
26
L’ARN élué doit être conservé sur la glace pour garantir sa stabilité
en raison de l’omniprésence des traces de RNases (matériel du
laboratoire, traces de doigts, poussières) susceptibles de dégrader
l’ARN purifié. Pour un stockage à court terme, stocker à -20 °C et à
-70 °C pour une conservation à long terme.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
NucleoSpin® RNA XS
Problèmes
Causes possible et suggestions
Abrasion de la silice
•
Discordance
entre la
quantification
par mesure
de l'A₂₆₀ et la
quantification par
PCR
En raison du faible contenu en ARN des très petits échantillons
extraits, induisant une faible quantité d’ARN purifié, la quantification
de l’ARN par mesure de l’absorption A₂₆₀ est souvent altérée en
raison de la faible sensibilité de la mesure. Lorsque l’absorption
mesurée est proche de la limite de détection du spectrophotomètre,
la mesure est sensible à de minimes traces d’abrasion de silice. Afin
de prévenir ce type de mesures incohérentes lors de la quantification
par mesure de A₂₆₀ de faibles quantités d’ARN, centrifuger l’éluat
pendant 30 s à > 11.000 × g et prélever un aliquote sans perturber
le moindre sédiment éventuel. Autrement, privilégier une méthode
insensible à la présence de résidus de silice (ex : Ribogreen).
Mesure hors de la limite de détection du spectrophotomètre
Ratio A₂₆₀ / A₂₈₀
inattendu
•
Afin que la mesure du ratio A₂₆₀/A₂₈₀ soit significative, il est
nécessaire que les valeurs A₂₆₀ et A₂₈₀ soit suffisamment supérieures
à la limite de détection du photomètre utilisé. Une valeur A₂₈₀
proche du bruit de fond de l’appareil entraîne des ratios A₂₆₀/A₂₈₀
incohérents.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
27
NucleoSpin® RNA XS
6.2
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoSpin RNA XS
740902.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® RNA Clean‑up XS
740903.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® totalRNA FFPE XS
740969.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin RNA
740955.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoZOL
740404.200
200 mL
NucleoSpin® RNA Blood
740200.10 / .50
10 / 50
NucleoSpin® totalRNA FFPE
®
®
740982.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
®
740962.20
20
®
NucleoSpin RNA/Protein
740933.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® TriPrep
740966.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® RNA Clean‑up
740948.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin RNA/DNA Buffer Set
740944
Convient pour 100
préparations
Tampon RA1
740961
740961.500
60 mL
500 mL
rDNase Set
740963
1 set
Reducing Agent TCEP
NucleoSpin RNA Midi
®
740395.107
107 mg
®
NucleoSpin Filters
740606
50
Tubes collecteurs (2 mL)
740600
1000
NucleoProtect® RNA
740400.50 / .250 / .500
50 / 250 / 500 mL
Visitez notre site www.mn-net.com pour plus d’informations sur nos produits.
28
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
Extraction des ARN
6.3
Références
Fleige S, Pfaffl MW. : RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol
Aspects Med. 2006 Apr-Jun ; 27(2 – 3) :126 – 39. Epub 2006 Feb 15. Review.
Imbeaud S, Graudens E, Boulanger V, Barlet X, Zaborski P, Eveno E, Mueller O, Schroeder
A, Auffray C. : Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent
classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 2005 Mar 30 ;33(6) :e56.
Miller CL, Diglisic S, Leister F, Webster M, Yolken RH. : Evaluating RNA status for RT-PCR in
extracts of postmortem human brain tissue. Biotechniques. 2004 Apr ; 36(4) :628 – 33.
Schoor O, Weinschenk T, Hennenlotter J, Corvin S, Stenzl A, Rammensee HG, Stevanovic
S. : Moderate degradation does not preclude microarray analysis of small amounts of RNA.
Biotechniques. 2003 Dec ; 35(6) :1192 – 6, 1198 – 201.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12
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Extraction des ARN
6.4
Restrictions d’utilisation / ​garantie
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sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description
de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits
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est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente
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société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent,
veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus
récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre
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