MACHEREY-NAGEL Biologie moléculaire Bioanalysis User manual Manuel d’utilisation Extraction des ARN n NucleoSpin® RNA XS Mai 2023 / Rev. 12 www.mn-net.com www.mn-net.com Extraction des ARN Résumé du protocole (Rev. 12) XS NucleoSpin® RNA XS 1 Préparation de l’échantillon 2 Lyse et homogénéisation des cellules Utiliser jusqu’à 10⁵ cellules en culture ou 5 mg tissus 100 μL RA1 2 μL TCEP Mélanger 3 Ajout d’ARN Carrier 5 μL de solution d’ARN Carrier Mélanger 4 Filtration du lysat (optionnel) 11,000 x g, 30 s 5 6 100 μL Ethanol 70 % Ajustement les conditions de fixation de l’ARN Mélanger Fixation de l’ARN Charger le lysat 11,000 x g, 30 s 7 Dessalage de la membrane de silice 100 μL MDB 11,000 x g, 30 s 8 Digestion de l’ADN 25 μL de mélange réactionnel de rDNase TA, 15 min 9 Lavage et séchage de la membrane de silice 1er lavage 100 μL RA2 2ième lavage 400 μL RA3 lavage 200 μL RA3 3 1 et 2 11,000 x g, 30 s 3ième 11,000 x g, 2 min er 9 ième ième Elution d’ARN purifié 10 μL RNase-free H₂O 11,000 x g, 30 s MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com Extraction des ARN Sommaire 1 Composition du kit 4 1.1 Composants 4 1.2 Réactifs, consommables et équipements complémentaires requis 5 1.3 À propos de ce manuel d’utilisation 5 2 Description du produit 6 2.1 Le principe de base 6 2.2 Caractéristiques du kit 6 2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons 9 2.4 Procédures d’élution 10 2.5 Stabilité de l’ARN purifié 10 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs 11 4 Instructions de sécurité 13 4.1 Elimination des déchets 5 Protocoles 13 14 5.1 Purification d’ARN à partir de cellules en culture, de cellules isolées par capture laser ou de cryosections microdisséquées 14 5.2 Purification de l’ARN de tissus 17 5.3 Purification et concentration de l’ARN 20 5.4 Digestion en solution avec la rDNase 22 6 Annexes 24 6.1 Guide de résolution des problèmes 24 6.2 Informations de commande 28 6.3 Références 29 6.4 Restrictions d’utilisation / garantie 30 MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 3 Extraction des ARN 1 Composition du kit 1.1 Composants NucleoSpin® RNA XS 10 préps 740902.10 50 préps 740902.50 250 préps 740902.250 Tampon de lyse RA1 6 mL 25 mL 125 mL Tampon de lavage RA2 2 × 1 mL 15 mL 2 × 15 mL Tampon de lavage RA3 (Concentré)* 6 mL 12 mL 50 mL Tampon de dessalage de la membrane MDB 10 mL 10 mL 50 mL Tampon de réaction pour la rDNase 7 mL 7 mL 30 mL rDNase, exempte de RNase (lyophilisée)* 1 flacon (taille A) 1 flacon (taille C) 2 flacons (taille D) ARN Carrier* 300 µg 300 µg 300 µg Agent réducteur TCEP* 14 mg 3 × 14 mg 2 × 107 mg H2O RNase-free 13 mL 13 mL 13 mL NucleoSpin® Filters (anneaux violets) 10 50 250 Colonnes NucleoSpin® RNA XS (anneaux bleus - plus tubes collecteurs) 10 50 250 Tubes collecteurs (2 mL) 30 150 750 Tubes d’élution (1,5 mL) 10 50 250 Manuel d’utilisation 1 1 1 REF * Pour la préparationdes reactifs et des conditions de stockage, voir le chapitre 3. 4 MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 Extraction des ARN 1.2 Réactifs, consommables et équipements complémentaires requis Réactifs • Éthanol à 96 – 100 % (pour préparer le tampon de lavage RA3 et pour la procédure de purification, chapitre 5.3) • Éthanol à 70 % (pour ajuster les conditions de fixation de l’ARN) Consommables Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL Cônes stériles, exempts de RNases Equipements • Pipettes manuelles • Centrifugeuse pour microtubes • Vortex • Équipement de protection individuelle (par exemple, blouse de laboratoire, gants, lunettes) 1.3 À propos de ce manuel d’utilisation Il est fortement recommandé de lire les protocoles détaillés de ce manuel d'utilisation si le kit NucleoSpin® RNA XS est utilisé pour la première fois. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Celui-ci est conçu pour repérer aisément le déroulement de la procédure en rappelant la chronologie des différentes étapes. Toute la littérature technique est disponible sur notre site www.mn-net.com. Merci de contacter notre support technique pour toute information concernant les changements éventuels entre cette version du manuel et les précédentes versions. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 5 Extraction des ARN 2 Description du produit 2.1 Le principe de base Un des aspects les plus important lors de l’extraction de l’ARN concerne la prévention de sa dégradation. Avec les méthodes NucleoSpin® RNA, les cellules sont lysées par incubation dans une solution contenant une forte concentration d’ions chaotropiques. Ce tampon de lyse inactive immédiatement les RNases – omniprésentes dans quasiment tous les échantillons biologiques – et crée les conditions favorables pour la fixation de l’ARN à la membrane de silice. L’ADN contaminant, également fixé à la membrane de silice, est éliminé par digestion au moyen d’une solution de rDNase directement appliquée sur la membrane de silice pendant la procédure (la rDNase RNase-Free est incluse dans le kit). De simples étapes de lavages avec deux tampons différents permettent d’éliminer les sels, les métabolites et autres composants cellulaires macromoléculaires. L’ARN purifié est finalement élué dans de l’H2O exempte de RNases (fournie dans le kit). La préparation de l’ARN avec les kits de la gamme NucleoSpin® RNA peut être effectuée à TA. Cependant, une fois élué, l’éluat doit être traité avec précaution en raison de sa forte vulnérabilité vis-à-vis des RNases, souvent présentes sur le matériel, les traces de doigts et la poussière. Pour garantir la stabilité de l’ARN, conserver le congelé à -20 °C pour un stockage à court terme ou à -70 °C pour un stockage à long terme. 2.2 Caractéristiques du kit • Le kit NucleoSpin® RNA XS est recommandé pour l’extraction d’ARN de très petits échantillon, par exemple de petites quantités de cellules (jusqu’à 10⁵) et de tissus (jusqu’à 5 mg) sous forme de culots, de cellules isolées par capture laser, de cryosections microdisséquées, de biopsies, des biopsies aspirées dans des aiguilles et des cellules triées au cytomètre de flux (Tableau 1, page 8). • Le design innovant de la colonne, avec une bague de sécurité en entonnoir et une membrane de faible surface permettent d’éluer l’ARN dans un volume réduit de 5 – 30 μL. Ainsi, l’ARN purifié est élué avec une forte concentration, et est prêt à l’emploi pour les applications (ex : RT‑PCR) • Le rendement ARN dépend fortement de la nature de l’échantillon, de sa qualité et de la quantité utilisée (voir Tableau 2, page 8 pour plus de détails). • L’ARN de haut intégrité est obtenu (RNA Integrity Number (RIN) > 9 selon la méthode Agilent 2100 Bioanalyzer) aussi bien pour de petits échantillons (par ex. 10³ cellules, ou 0.1 mg de tissus) que pour des quantités de matériel biologique plus importantes (ex : 10⁵ cellules, 5 mg de tissus). Le ratio ARNr (28S / 18S) est généralement de 1.8 – 2.0. La qualité de l’ARN est toutefois très liée à la qualité des échantillons (voir Chapitre 6.3). • Le kit NucleoSpin® RNA XS permet la purification de l’ARN avec un ratio A₂₆₀/A₂₈₀ généralement supérieur à 1.9 (mesuré en tampon TE pH 7.5). Etant donné la pureté élevée de l’ARN obtenu, une grande partie de la fraction éluée peut être utilisée comme matrice pour les RT-PCR sans inhibition (ex : 8 μL sur 10 μL d’éluat total utilisé comme matrice dans un mix de qRT-PCR de 20 µL génère un signal plus important en 6 MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 Extraction des ARN comparaison à des réactions menées avec une quantité moindre de matrice (PCR en LightCycler avec un kit Sigma SYBR Green de RT-PCR Quantitative). • La durée de la procédure est d’environ 45 minutes pour 12 échantillons. • Le kit contient un agent réducteur, le TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine). Le TCEP est inodore, plus stable, plus spécifique des ponts disulfures et moins toxique que les autres agents réducteurs utilisés habituellement. • L’ARN Carrier (ARN poly(-A) : sel de potassium poly(A), préparé à partir d’ADP avec la polynucléotide phosphorylase) est inclus dans le kit pour des performances optimales sur les plus petits échantillons. L’utilisation de l’ARN Carrier est recommandée par ajout au lysat (20 ng par échantillon). Une telle petite quantité n’interfère pas dans les applications de RT-PCR, même lors de l’utilisation d’amorces oligo-dT. La faible quantité d’ARN Carrier transférée dans la réaction de RT-PCR est généralement sans influence sur le résultat de la réaction, en raison du large excès d’amorces oligo-dT. Le bénéfice lié à l’ajout de l’ARN Carrier au lysat dépend du type d’échantillon, de la quantité initialement utilisée et du type d’analyse en aval de l’ARN. L’ARN Carrier devra être omis pour les applications suivantes : - si une purification spécifique de l’ARN poly-A est ensuite effectuée. - si l’ARN est ensuite soumis à un séquençage • La rDNase est fournie dans le kit. Les contaminants en ADN sont éliminés lors d’une digestion avec la rDNase directement appliquée sur la membrane de silice. Pour les applications les plus sensibles aux contaminations résiduelles en ADN, (ex : analyse de l’expression de gènes à partir de cellules transfectées avec des plasmides, analyse de gènes plastidiaux ou mitochondriaux) une digestion supplémentaire utilisant la rDNase en solution dans l’éluat est possible. • Réservé à l’usage de la recherche MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 7 Extraction des ARN Tableau 1 : Résumé des caractéristiques du kit Paramètres NucleoSpin® RNA XS Format Colonne Mini à centrifuger – Design XS Echantillon Petites quantités d’échantillon < 5 mg de tissus, < 100 000 cellules en culture Taille des fragments > 200 nt Rendement Voir les exemples des données dans le tableau 2 A₂₆₀/A₂₈₀ 1.9 – 2.1 RIN (RNA integrity number) > 9 (selon la qualité de l’échantillon) Volume d’élution 5 – 30 µL Temps de préparation 35 min/6 preps Capacité de fixation 110 µg Tableau 2 : Aperçu des rendements moyens en ARN obtenus à l’aide du NucleoSpin® RNA XS Echantillon Rendement moyen 5 1000 – 1500 ng 4 10 cellules HeLa 100 – 150 ng 103 cellules HeLa 10 – 15 ng 102 cellules HeLa 0.1 – 1.5 ng 5 mg de foie de souris 5 – 8 µg 1 mg de foie de souris 2 µg 10 cellules HeLa 8 MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 Extraction des ARN 2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons Environnement de travail Maintenir un environnement de travail exempt de RNases. Porter des gants à tout moment pendant la préparation. Changer de gants fréquemment. Stockage des échantillons et inhibition des RNases Les RNases peuvent dégrader rapidement l’ARN contenu dans les échantillons si ceux-ci ne sont pas protégés de l’activité des RNases après la collecte. Utiliser l’une des méthodes suivantes pour éviter la dégradation de l’ARN : • Utiliser un échantillon fraîchement prélevé pour une lyse immédiate et une purification de l’ARN. • Immerger et conserver les échantillons dans du NucleoProtect® RNA ou dans des solutions de stabilisation similaires. Veiller à ce que l’échantillon soit complètement imprégné de la solution de stabilisation avant de le congeler. Retirer l’excès de solution de stabilisation de l’échantillon avant l’isolement de l’ARN conformément au manuel d’utilisation de la solution de stabilisation. • Congeler rapidement l’échantillon dans de l’azote liquide immédiatement après la récolte et le conserver à -70 °C. Les échantillons congelés sont stables jusqu’à 6 mois. Un mortier et un pilon peuvent être utilisés pour pulvériser l’échantillon à l’état congelé. Veiller à ce que l’échantillon ne soit pas décongelé avant d’entrer en contact avec le tampon de lyse. • Conserver les échantillons dans le tampon de lyse RA1 après le broyage à -70 °C jusqu’à un an, à 4 °C jusqu’à 24 heures ou à température ambiante pendant quelques heures. Les échantillons congelés dans le tampon de lyse RA1 doivent être décongelés lentement avant de commencer l’extraction de l’ARN. Broyage et homogénéisation de l’échantillon • Cellules cultivées en suspension : Récolter les cellules par centrifugation, éliminer le surnageant et ajouter immédiatement le tampon de lyse RA1 conformément à l’étape 2 du protocole standard (voir les chapitres 5.1, 6.1). • Culture de cellules adhérentes (lyse en boîte de culture) : Aspirer complètement le milieu de culture. Ajouter immédiatement le tampon de lyse RA1 à la boîte de culture cellulaire. Éliminer complètement le milieu de culture afin de permettre une lyse complète par le tampon de lyse. Poursuivre par la filtration du lysat (étape 3 du protocole standard). • Culture de cellules adhérentes (lyse après trypsinisation) : Aspirer le milieu de culture et laver les cellules avec du PBS. Aspirer le PBS. Ajouter 0,1 – 0,3 % de trypsine dans du PBS et incuber pendant une durée appropriée pour détacher les cellules de la surface de la boîte. Après le décollement des cellules, ajouter du milieu, transférer les cellules dans un tube approprié (non fourni) et les culotter par centrifugation pendant 5 minutes à 300 x g. Éliminer le surnageant et ajouter le tampon de lyse RA1 au culot cellulaire. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 9 Extraction des ARN • Tissus d’animaux : Pour une préparation efficace de l’ARN, il est essentiel que tout l’ARN contenu dans l’échantillon soit libéré des cellules par broyage et que la viscosité de l’échantillon soit réduite par homogénéisation. La décongélation des échantillons de tissus non broyés doit être effectuée uniquement en présence du tampon de lyse RA1 et pendant le broyage mécanique, par exemple avec un broyeur à rotor-stator ou un système à billes. Ceci garantit que l’ARN n’est pas dégradé par des RNases avant même de débuter la procédure de purification. Les techniques courantes de broyage des tissus d’animaux sont, par exemple, la méthode ’pilon et mortier’ ou l’utilisation de seringues et aiguilles, permettant, après de multiples passages du lysat, d’homogénéiser l’échantillon. Cependant, les échantillons utilisables avec le kit NucleoSpin® RNA XS étant de petite taille, ces méthodes de broyage sont souvent inapplicables. 2.4 Procédures d’élution Une concentration élevée de l’ARN purifié est généralement souhaitée pour les applications avales. En particulier en raison du volume limité des réactions effectuées, la concentration de l’ARN analysé peut être déterminante. A cause d’un volume d’élution minimal élevé, les kits standards produisent généralement un ARN faiblement concentré si de petits échantillons biologiques sont utilisés pour l’extraction. De telles concentrations nécessitent souvent une étape de concentration supplémentaire de l’ARN afin de rendre l’analyse possible. Contrairement aux kits standards, le kit NucleoSpin® RNA XS permet une élution performante dans un volume final réduit, induisant une concentration élevée de l’ARN purifié. Des volumes d’élution de 5 – 30 μL sont recommandés, le volume d’élution préconisé par défaut est de 10 μL. 2.5 Stabilité de l’ARN purifié L’ARN purifié doit être immédiatement placé et conservé sur la glace pour une stabilité optimale. La contamination par des RNases quasiment omniprésentes (matériel, traces de doigts, poussières) constitue une menace pour l’ARN extrait. Pour un stockage à court terme, congeler l’ARN à -20 °C ou à -70 °C pour une conservation de longue durée. 10 MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 Extraction des ARN 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention : Les tampons RA1, RA2 et MDB contiennent un sel chaotropique et des détergents. Porter des gants et des lunettes de protection ! ATTENTION : les tampons RA1, RA2 et MDB contiennent du thiocyanate de guanidine pouvant induire la formation de composés hautement réactifs en présence de Javel (hypochlorite de sodium). NE PAS ajouter de Javel ou de solutions acides directement dans les déchets liquides issus de la procédure. • Stocker la rDNase lyophilisée, l’agent réducteur TCEP, et l’ARN Carrier à 4 °C à réception du kit (stabilité pendant 1 an maximum). • Tous les autres constituants du kit doivent être stockés entre 15 – 25 °C et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Le stockage à des températures inférieures peut entraîner la précipitation de sels. • Vérifier la disponibilité de l’éthanol 70 % pour l’ajout au lysat de l’échantillon dans le tampon RA1 pour l’étape de création des conditions de fixation de l’ARN. • Vérifier la disponibilité de l’éthanol 96 – 100 % (pour le protocole de purification de l’ARN seulement). Avant de débuter la procédure NucleoSpin® RNA XS, préparez : • rDNase : Ajouter le volume indiqué sur le flacon (ou voir tableau ci-dessous) d’H2O RNase-Free dans le flacon de rDNase lyophilisée et incuber pendant 1 min à température ambiante. Retourner doucement le flacon pour dissoudre totalement la rDNase. Veiller à ne pas mélanger la rDNase vigoureusement, l’enzyme étant sensible à l’agitation mécanique. Distribuer en aliquotes et stocker -20 °C. La solution congelée est stable pendant 6 mois. Ne pas congeler/décongeler les aliquotes plus de trois fois. • Agent réducteur TCEP : Ajouter le volume indiqué d’H2O RNase-Free dans le flacon et incuber quelques minutes à température ambiante. Mélanger pour dissoudre totalement le TCEP. Stocker le TCEP dissout à -20 °C. • ARN Carrier : Préparer une solution stock à la première utilisation. Dissoudre l’ARN Carrier dans 750 μL de tampon RA1 de manière à obtenir une solution stock à 400 ng/μL. Préparer une solution de travail avant l’extraction de l’ARN : diluer à 1 :100 avec le tampon RA1 (ex : 1 μL de solution stock d’ARN Carrier + 99 μL de tampon RA1) afin d’obtenir une solution de travail à 4 ng/μL. Utiliser ensuite 5 μL de cette solution de travail (20 ng de carrier ARN) dans chaque lysat (étape 3 du protocole, voir chapitre 5). Conserver la solution stock à -20 °C ; ne pas préparer à l’avance la solution de travail, celle-ci doit être préparée fraichement avant chaque utilisation. Note : En raison du mode de production, l’ARN Carrier lyophilisé peut être difficilement visible dans le flacon. • Tampon de lavage RA3 : Ajouter le volume indiqué d’éthanol 96 – 100 % dans le tampon RA3 concentré. Indiquer sur le flacon l’ajout de l’éthanol. Conserver le tampon de lavage RA3 à 15 – 25 °C pendant au plus 1 an. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 11 Extraction des ARN NucleoSpin® RNA XS 10 préps 740902.10 50 préps 740902.50 250 préps 740902.250 Tampon de lavage RA3 (Concentré) 6 mL Ajouter 24 mL d’éthanol 12 mL Ajouter 48 mL d’éthanol 50 mL Add 200 mL ethanol to each bottle rDNase, exempt de RNase (lyophilisée) 1 tube (taille A) Ajouter 55 µL d’H₂O RNase-free 1 tube (taille C) Ajouter 230 µL d’H₂O RNase-free 2 tube (taille D) Ajouter 540 µL d’H₂O RNase-free à chaque tube 300 µg 300 µg 300 µg REF ARN Carrier Ajouter 750 μL de tampon RA1 pour obtenir une solution stock concentrée. Diluer 1:100 avec le tampon RA1 pour obtenir la solution de travail. Agent réducteur TCEP 12 14 mg Ajouter 100 µL d’H₂O RNase-free 3 × 14 mg Ajouter 100 µL d’H₂O RNase-free à chaque tube MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 2 × 107 mg Ajouter 750 µL d’H₂O RNase-free à chaque tube Extraction des ARN 4 Instructions de sécurité Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® RNA XS, porter des vêtements de protection appropriés (par exemple : une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection). Pour plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne sur www.mn‑net.com/msds). Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans les tampons RA1 et RA2 peuvent former des composés hautement réactifs lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement dans les déchets liquides issus de la procédure. Les déchets générés par le kit NucleoSpin® RNA XS n’ont pas été testés pour la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement dénaturant et du traitement à la protéinase K mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux réglementations de sécurité locales. 4.1 Elimination des déchets Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions réglementaires locales. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 13 Extraction des ARN 5 Protocoles 5.1 Purification d’ARN à partir de cellules en culture, de cellules isolées par capture laser ou de cryosections microdisséquées Avant de débuter la préparation : • 1 Vérifier que le TCEP, l’ARN Carrier, la rDNase et le tampon de lavage RA3 ont bien été préparés selon les indications du chapitre 3. Préparer l’échantillon Préparer un échantillon tel qu’un culot de cellules en culture (10⁵ maximum), de cellules isolées ou des cryosections microdisséquées) dans un microtube (non fourni). Pour des détails sur les quantités d’échantillon appropriées, voir le paragraphe 2.2. 2 Lyser et homogénéiser les cellules Ajouter 100 μL de tampon RA1 et 2 μL de TCEP à l’échantillon puis vortexer vigoureusement (2 × 5 s). + 100 µL RA1 + 2 µL TCEP Si des séries d’échantillons sont traitées, la préparation d’un prémix est recommandée (par ex : 1,1 mL de tampon de lyse RA1 et 22 µL de TCEP pour 10 préparations en parallèle. Utiliser pour chaque échantillon, 102 µL de ce mélange). La procédure suffit généralement pour homogénéiser les cellules en culture, les cellules isolées par capture laser ou les cryosections microdisséquées. Pour plus de détails concernant les méthodes d’homogénéisation, voir le paragraphe 2.3. 3 Ajouter l’ARN Carrier Ajouter 5 µL de solution de travail d’ARN Carrier (20 ng) au lysat. Mélanger en vortexant (2 × 5 s). Centrifuger brièvement (environ 1 s 1000 x g) pour nettoyer le bouchon. + 5 µL ARN Carrier Mélanger Pour la préparation de la solution de travail de l’ARN Carrier, voir le chapitre 3 4 Filtrer le lysat (optionnel) Placer une colonne NucleoSpin® Filter (bague violette) dans un tube collecteur (2 mL ; fourni), déposer le mélange et centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g. Cette étape peut être omise pour les échantillons de petite taille, par exemple, inférieurs à 10⁵ cellules. 14 MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 11,000 x g 30 s Extraction des ARN 5 Ajuster les conditions de fixation de l’ARN Jeter le NucleoSpin® Filter (bague violette). Ajouter 100 μL d’éthanol (70 %) au lysat homogénéisé et mélanger par pipetage (5 fois). + 100 µL 70 % EtOH Mélanger Autrement, ajouter 100 µL d’éthanol (70 %) à l’échantillon dans un tube 1,5 mL (non fourni) et mélanger en vortexant (2 × 5 s). Centrifuger brièvement (environ 1 s à 1000 x g) pour nettoyer le bouchon. Pipeter le lysat 2 fois avant de charger le lysat. 6 Fixer l’ARN Pour chaque préparation, prendre une colonne NucleoSpin® RNA XS (bague bleue claire) et placer dans un tube collecteur. Charger le lysat sur la colonne. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 × g. Placer la colonne dans un nouveau tube collecteur 2 mL. ® Le volume maximal de la colonne NucleoSpin RNA XS est de 600 μL. Répéter la procédure si un volume de lysat supérieur est utilisé. 7 11,000 x g 30 s Dessaler la membrane de silice Ajouter 100 μL de tampon MDB (Tampon de dessalage de la membrane) et centrifuger à 11,000 × g pendant 30 s pour sécher la membrane. Il n’est pas nécessaire d’utiliser un nouveau tube collecteur après cette étape de centrifugation. L’élimination des sels rend le traitement à la rDNase beaucoup plus efficace. Si, pour quelque raison, l’embout de sortie de la colonne est entré en contact avec le filtrat, jeter le liquide et centrifuger à nouveau 30 s à 11,000 × g. 8 Charger le lysate + 100 µL MDB 11,000 x g 30 s Digérer l’ADN Préparer le mélange réactionnel de rDNase dans un microtube stérile (non inclus) : pour chaque préparation, ajouter 3 μL de rDNase reconstituée (voir chapitre 3) à 27 μL de tampon de réaction pour la rDNase. Mélanger en tapotant le tube Déposer 25 μL de mélange réactionnel de rDNase directement au centre de la membrane de silice. Refermer la colonne. Incuber à température ambiante pendant 15 min. + 25 µL Mélange réactionel rDNase TA 15 min Il n’est pas nécessaire de changer le tube collecteur après l’étape d’incubation. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 15 Extraction des ARN 9 Laver et sécher la membrane de silice + 100 µL RA2 1er lavage Ajouter 100 µL de tampon RA2 dans la colonne NucleoSpin® RNA XS. Incuber pendant 2 min à TA. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g. Placer la colonne dans un nouveau tube collecteur (2 mL). TA 2 min 11,000 x g 30 s Le tampon RA2 inactivate la rDNase. 2ième lavage + 400 µL RA3 Ajouter 400 µL de tampon RA3 dans la colonne NucleoSpin® RNA XS Centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. 11,000 x g 30 s Note : veiller à éliminer avec le tampon RA3 les résidus de tampons des étapes précédentes, en particulier si le lysat est entré en contact avec l’ouverture de la colonne pendant l’étape de chargement du lysat sur la colonne. Pour un lavage efficace, rincer l’ouverture avec le tampon RA3. + 200 µL RA3 3ième lavage 11,000 x g 2 min Ajouter 200 µL de tampon RA3 dans la colonne NucleoSpin® RNA XS. Centrifuger 2 min à 11,000 x g pour sécher la membrane. Placer la colonne dans un tube d’élution exempt de nucléases (1.5 mL ; founi). Si, pour quelque raison, l’embout de sortie de la colonne est entré en contact avec le filtrat, jeter le liquide et centrifuger à nouveau 30 s à 11,000 x g. 10 Eluer l’ARN purifié Eluer l’ARN dans 10 µL H2O (RNase-free ; fourni) et centrifuger à 11,000 x g pour 30 s. Si une concentration supérieure ou encore un volume final supérieur sont souhaités, le volume peut être ajusté de 5 à 30 μL. Pour plus de détails voir le paragraphe 2.4. 16 MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 + 10 µL RNasefree H2O 11,000 x g 30 s Extraction des ARN 5.2 Purification de l’ARN de tissus Avant de débuter la préparation : • 1 Vérifier que le TCEP, l’ARN Carrier, la rDNase et le tampon de lavage RA3 ont bien été préparés selon les indications du chapitre 3. Préparer l’échantillon Préparer un échantillon tel qu’une biopsie dans un microtube (non fourni). Pour les quantités de tissus recommandées, voir le paragraphe 2.2. 2 Lyser et homogénéiser les tissus Ajouter 200 μL de tampon RA1 et 4 μL de TCEP à l’échantillon et vortexer vigoureusement (2 × 5 s). + 200 µL RA1 + 4 µL TCEP L’utilisation d’un broyeur à rotor-stator ou d’un système à billes sont des méthodes recommandées pour l’homogénéisation des échantillons de tissus. Pour plus de remarques concernant les méthodes d’homogénéisation, voir le paragraphe 2.3. Si les échantillons sont traités en série, la préparation d’un prémix est recommandée (ex : 2.2 mL de tampon RA1 et 44 μL de TCEP pour 10 préparations). Utiliser 204 μL de ce mélange par échantillon. 3 Ajouter l’ARN Carrier Ajouter 5 µL de solution de travail d’ARN Carrier (20 ng) au lysat. Mélanger en vortexant (2 × 5 s). Centrifuger brièvement (environ 1 s à 1000 x g) pour nettoyer le bouchon. Voir le chapitre 3 pour la préparation de l’ARN Carrier. 4 + 5 µL ARN Carrier Mélanger Filtrer le lysat Reduire la viscosité et clarifier le lysat par filtration à travers un NucleoSpin® Filter (bague violette) : placer le NucleoSpin® Filter dans un tube collecteur 2 mL (fourni), déposer l’échantillon et centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g. 11,000 x g 30 s Si un culot visible se forme (en fonction de la nature et la quantité d’échantillon), transférer le surnageant dans un nouveau tube 1,5 mL (non fourni) en évitant tout matériel insoluble. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 17 Extraction des ARN 5 Ajuster les conditions de fixation de l’ARN Jeter le NucleoSpin® Filter (bague violette), ajouter 200 µL d’éthanol (70 %) au lysat homogénéisé et mélanger en pipetant (5 fois). + 200 µL 70 % EtOH Mélanger Autrement, transférer le filtrat dans un nouveau tube 1,5 mL (non fourni), ajouter 200 μL d’éthanol (70 %), et mélanger en vortexant (2 × 5 s). Centrifuger brièvement (environ 1 s à 1000 x g) pour nettoyer le bouchon. Pipeter le lysat deux fois pour le mélanger avant de le transférer. Après ajout d’’éthanol, un précipité filandreux peut apparaître, ceci n’affectera pas la procédure d’extraction de l’ARN. Veiller à désagréger totalement ce précipité en mélangeant et charger l’ensemble sur la colonne comme indiqué à l’étape 6. Ne pas centrifuger le lysat après ajout de l’éthanol et avant chargement de la colonne afin d’éviter de culotter le précipité. 6 Fixer l’ARN Pour chaque échantillon, prendre une colonne NucleoSpin® RNA XS (bague bleue) placée dans son tube collecteur et charger le lysat. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g. Placer la colonne dans un nouveau tube collecteur (2 mL). Le volume utile de la colonne NucleoSpin® RNA XS est de 600 µL. Répéter cette étape si un volume de lysat supérieur est utilisé. 7 11,000 x g 30 s Dessaler la membrane de silice Ajouter 100 µL de tampon MDB (Tampon de dessalage de la membrane) et centrifuger à 11,000 x g pendant 30 s pour sécher la membrane. Il n’est pas nécessaire d’utiliser un nouveau tube collecteur après cette étape de centrifugation. L’élimination des sels rend le traitement à la rDNase beaucoup plus efficace. Si, pour quelque raison, l’embout de sortie de la colonne est entré en contact avec le filtrat, jeter le liquide et centrifuger à nouveau. 18 Charger le lysat MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 + 100 µL MDB 11,000 x g 30 s NucleoSpin® RNA XS 8 Digérer l’ADN Préparer le mélange réactionnel de rDNase dans un microtube stérile (non inclus) : pour chaque préparation, ajouter 3 μL de rDNase reconstituée (voir le chapitre 3) à 27 μL de tampon de réaction pour la rDNase. Mélanger en tapotant le tube. Déposer 25 μL de mélange réactionnel de rDNase directement au centre de la membrane de silice. Refermer la colonne. Incuber à température ambiante pendant 15 min. + 25 µL Mélange réactionnel rDNase TA 15 min Il n’est pas nécessaire de changer le tube collecteur après l’étape d’incubation. 9 Laver et sécher la membrane de silice Ajouter 100 µL de tampon RA2 dans la colonne NucleoSpin® RNA XS. Incuber pendant 2 min à TA. Centrifuger pendant 30 s à 1 g. Placer la colonne dans un tube collecteur 2 mL Le tampon RA2 inactive la rDNase. Ajouter 400 µL de tampon RA3 dans la colonne NucleoSpin® RNA XS. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 × g. Jeter le filtrat et replacer la colonne sur un tube collecteur. Ajouter 200 µL de tampon RA3 dans la colonne NucleoSpin® RNA XS. Centrifuger pendant 2 min à 11,000 x g pour sécher la membrane. Placer la colonne dans un tube d’élution exempt de nucléases (1.5 mL ; fourni). Si, pour quelque raison, l’embout de sortie de la colonne est entré en contact avec le filtrat, jeter le liquide et centrifuger à nouveau 30 s à 11,000 × g. 10 + 100 µL RA2 TA 2 min 11,000 x g 30 s + 400 µL RA3 11,000 x g 30 s + 200 µL RA3 11,000 x g 2 min Eluer l’ARN purifié Eluer l’ARN dans 10 µL d’H2O (RNase-free ; fournie) et centrifuger à 11,000 × g pendant 30 s. Si des concentrations en ARN supérieures ou encore un volume final supérieur sont souhaités, le volume d’élution utilisé peut être ajusté de 5 à 30 µL. + 10 µL RNasefree H2O 11,000 x g 30 s Pour plus de détails concernant les procédures alternatives d’élution, voir le paragraphe 2.4. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 19 NucleoSpin® RNA XS 5.3 Purification et concentration de l’ARN Avant de débuter la préparation : • 1 Vérifier que le tampon de lavage RA3 a bien été préparé selon les indications du chapitre 3. Préparer l’échantillon Fournir jusqu’à 300 µL d’échantillon comme de l’ARN purifié (ex : purifié au phénol) ou de mélange réactionnel d’ARN (ex : réaction de marquage) dans un microtube (non fourni). Echantillon Voir le paragraphe 2.2 pour plus de détails sur les quantités d’échantillon initial. 2 Préparer le mélange de lyse - fixation Pour chaque fraction de 100 µL d’échantillon, mélanger 25 μL de tampon RA1 et 75 μL d’éthanol (96 – 100 %). Si des séries d’échantillons sont à traiter, préparer un prémix (1 volume de tampon RA1 plus 3 volumes d’éthanol 96 – 100 %). + 25 µL RA1 + 75 µL EtOH (96 – 100 %) par 100 µL d’échantillon Mélanger 3 Ajouter l’ARN Carrier Inutile ! 4 Filtrer le lysat Inutile ! 5 Ajuster les conditions de fixation de l’ARN Ajouter un volume de prémix à l’échantillon (ex : 100 µL de prémix à 100 µL d’échantillon) et mélanger en vortexant (2 × 5 s). Si nécessaire, centrifuger brièvement (environ 1 s à 1000 x g) pour nettoyer le bouchon. 6 Mélanger Fixer l’ARN Pour chaque échantillon, prendre une colonne NucleoSpin® RNA XS (bague bleue claire) placée dans son tube collecteur 2 mL et charger le lysat dans la colonne. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g. Pour les échantillons de volume > 300 µL, charger la colonne en deux fois. Replacer la colonne dans un tube collecteur 2 mL neuf. Pour les applications les plus exigeantes, le rendement de purification peut être accru ainsi : centrifuger 30 s à 2,000 x g avant la centrifugation de 30 s à 11,000 x g. 20 Ajouter 1 vol. de prémix à 1 vol d’échantillon MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 Charger le lysat 11,000 x g 30 s NucleoSpin® RNA XS 7 Dessalage de la membrane Inutile ! 8 Digestion de l’ADN Inutile ! 9 Laver et sécher la membrane de silice + 400 µL RA3 1er lavage Déposer 400 μL de tampon RA3 dans la colonne NucleoSpin® RNA XS. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. 2ième lavage 11,000 x g 30 s + 200 µL RA3 Déposer 200 µL de tampon RA3 dans la colonne NucleoSpin® RNA XS. Centrifuger pendant 2 min à 11,000 x g pour sécher la membrane. Placer la colonne dans un tube d’élution exempt de nucléases (1,5 mL ; fourni). 11,000 x g 2 min Si, pour quelque raison, l’embout de sortie de la colonne est entré en contact avec le filtrat, jeter le liquide et centrifuger à nouveau 30 s à 11,000 x g. 10 Eluer l’ARN purifié Eluer l’ARN dans 10 μL d’H2O (RNase-free ; fournie) et centrifuger à 11,000 x g pendant 30 s. Si des concentrations supérieures en ARN ou encore un volume final supérieur sont souhaités, le volume d’élution utilisé peut être ajusté de 5 à 30 µL. + 10 µL RNasefree H2O 11,000 x g 30 s Pour plus de détails concernant les procédures alternatives d’élution, voir le paragraphe 2.4. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 21 NucleoSpin® RNA XS 5.4 Digestion en solution avec la rDNase La digestion effectuée selon la procédure standard directement sur la colonne est très efficace et induit une contamination en ADN résiduel minime. Cet ADN résiduel ne sera pas détectable dans la plupart des applications. Cependant, l’élimination de l’ADN à un niveau totalement indétectable est difficile et l’efficacité de la digestion sur la membrane peut s’avérer parfois perfectible pour certaines applications très sensible à la moindre trace d’ADN résiduel. Parmi les applications sensibles figurent les réactions de RT-PCR utilisant des amorces ne différenciant pas les ADNc (dérivés de l’ARN) et l’ADN génomique contaminant. Plus particulièrement si : • des cibles présentes en grands nombre de copies sont analysées (ex : familles multigéniques, cibles mitochondriales, plastidiales ou plasmidiques (après transfections des cellules)) • le gène cible a un niveau d’expression très faible. • l’amplicon est plutôt petit (< 200 bp). La digestion de l’ADN en solution peut efficacement détruire l’ADN contaminant. Cependant, un contrôle strict des RNases et une nouvelle étape de purification de l’ARN (afin d’éliminer les tampons, les sels, la rDNase et l’ADN digéré) sont habituellement nécessaires. La DNase recombinante de haute qualité, exempte de RNase, incluse dans le kit NucleoSpin® RNA XS facilite la digestion en solution de manière à éliminer toute trace d’ADN contaminant. 22 MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 NucleoSpin® RNA XS A Digérer l’ADN (Préparation de la réaction) Préparer un prémix enzyme-tampon : ajouter 1 μL de rDNase à 10 μL de tampon de réaction pour la rDNase. Ajouter 1/10 volume de mélange enzyme-tampon à l’ARN élué (par ex : à 10 µL d’ARN, ajouter 1 µL de prémix contenant l’enzyme et le tampon). B Incuber l’échantillon Incuber pendant 10 min à 37 °C. C Repurifier l’ARN Repurifier l’ARN avec une procédure appropriée, par exemple en utilisant une précipitation à l’éthanol ou un kit dédié NucleoSpin® RNA Clean-up XS (voir les Informations de commande). Précipitation à l’éthanol, exemple : Ajouter 0.1 volume d’acétate de sodium 3 M, pH 5.2 et 2.5 volume d’éthanol 96 – 100 % à un volume d’échantillon. Mélanger précautionneusement. Incuber pendant une durée de plusieurs minutes à plusieurs heures respectivement à -20 °C ou à 4 °C. Note : Choisir une durée d’incubation élevée si l’échantillon contient peu d’ARN. Une incubation courte est généralement suffisante si l’échantillon est fortement concentré en ARN. Centrifuger pendant 10 min à vitesse maximale. Laver le culot avec de l’éthanol 70 %. Sécher le culot d’ARN et resuspendre dans de l’eau RNase-free. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 23 NucleoSpin® RNA XS 6 Annexes 6.1 Guide de résolution des problèmes Problèmes Causes possible et suggestions Contamination en RNases • ARN dégradé / rendement nul Créer un environnement de travail RNase-Free. Porter des gants pendant toute la procédure et les changer fréquemment. Utiliser des tubes jetables stériles en polypropylène. Conserver les tubes clos aussi souvent que possible pendant l’extraction. Les éventuels contenants en verre devront avoir été soumis à un traitement thermique d’au moins 2 heures à 250 °C avant utilisation. Mauvaise utilisation ou préparation des réactifs • Réactifs mal préparés. Ajouter le volume indiqué d’H2O RNaseFree au flacon de rDNase et d’éthanol 96 % au tampon de lavage concentré RA3 et mélanger. Reconstituer et stocker la rDNase lyophilisée selon les instructions du chapitre 3. • Echantillons et réactifs mal homogénéisés. Toujours vortexer vigoureusement après l’ajout d’un réactif. • Omission de l’ajout d’éthanol après la lyse. La fixation de l’ARN à la membrane de silice n’est efficace qu’en présence d’éthanol. Stockage du kit ARN de faible qualité / rendement faible • Reconstituer et stocker la rDNase lyophilisée selon les instructions du chapitre 3. • Stocker les autres composants du kit à température ambiante. La conservation à des températures inférieures peut induire la précipitation de sels. • Conserver les flacons bien clos afin de prévenir l’évaporation ou la contamination des solutions. Influence de la force ionique et du pH sur l’absorption A₂₆₀ et donc sur le ratio A₂₆₀/A₂₈₀ • 24 Pour la mesure de l’absorption, utiliser du Tris 5 mM pH 8,5 comme diluant. Voir aussi : - Manchester, K L. 1995. Value of A₂₆₀ / A₂₈₀ ratios for measurement of purity of nucleic acids. Biotechniques 19, 208 – 209. - Wilfinger, W W, Mackey, K and Chomczyski, P. 1997. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques 22, 474 – 481. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 NucleoSpin® RNA XS Problèmes Causes possible et suggestions Echantillons • Mauvaises conditions de stockage des échantillons. Autant que possible, utiliser du matériel frais. Sinon, congeler les échantillons dans l’azote liquide dès la collecte. Les échantillons doivent être stockés à -70 °C. Ne jamais laisser les tissus décongeler avant ajout du tampon RA1. Procéder au broyage immédiatement après ajout du tampon RA1. • Broyage et/ou homogénéisation de l’échantillon insuffisants. Veiller à un broyage complet et utiliser les NucleoSpin® Filters pour homogénéiser facilement le lysat. ARN de faible qualité / rendement faible (Suite) Contamination par le thiocyanate de guanidine Faible ratio A₂₆₀/ A230 • Déposer précautionneusement le lysat dans la colonne NucleoSpin® RNA XS en essayant d’éviter de contaminer l’ouverture supérieur de la colonne et le bouchon. • Veiller à éliminer le tampon de lavage RA2 avec le tampon suivant RA3. Déposer le RA3 de manière à rincer toute la surface interne de la colonne. Echantillons • Colonne NucleoSpin® RNA colmatée / Faible rendement • et/ou qualité Quantité excessive de matériel initial. La surcharge entraîne un rendement amoindri. Réduire la quantité d’échantillon ou utiliser un volume supérieur de RA1. Broyage et/ou homogénéisation de l’échantillon insuffisants. Veiller à un broyage complet et utiliser les NucleoSpin® Filters pour homogénéiser facilement le lysat. rDNase insuffisament active • Contamination de l’ARN par l’ADN génomique Reconstituer et stocker la rDNase lyophilisée selon les instructions du chapitre 3. Mauvaise utilisation de la rDNase • Déposer la solution de rDNase directement au centre de la membrane de silice et fermer le bouchon. Quantité d’échantillon excessive • Réduire la quantité de cellules ou de tissus utilisée. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 25 NucleoSpin® RNA XS Problèmes Causes possible et suggestions Système de détection de l’ADN trop sensible • Contamination de l’ARN par l’ADN génomique (suite) La contamination en ADN est efficacement réduite par la digestion à la rDNase effectuée sur la membrane. Cependant, il est difficile de garantir l’élimination totale de l’ADN, aussi, pour des applications très sensibles, il peut parfois s’avérer possible de détecter de l’ADN résiduel. La probabilité de détection d’ADN par PCR augmente avec . - le nombre de copies d’ADN par préparation : cible monocopie < cible plastidiale/mitochondriale < cible plasmidique (après transfection) - la réduction de la taille de l’amplicon. • Utiliser si possible des cibles de PCR plus grandes (ex : > 500 bp) ou des amorces couvrant les introns. • Utiliser le protocole additionnel 5.4 pour mener une digestion supplémentaire en solution avec la rDNase. Contamination par de l’éthanol ou des sels Performance suboptimale de l’ARN dans les applications • Ne pas laisser l’embout de sortie de la colonne entrer en contact avec le filtrat après le second lavage avec le tampon RA3. Veiller à centrifuger à la vitesse et pendant la durée recommandée afin d’éliminer totalement le tampon éthanolique RA3. • Vérifier que le tampon RA3 est bien à température ambiante. Le lavage avec le tampon à température inférieure réduit l’efficacité de dessalage du tampon RA3. • En fonction de la robustesse du système de RT-PCR utilisé, la réaction peut être inhibée si la totalité de l’éluat est utilisée comme matrice pour la RT-PCR. Utiliser un volume moindre d’éluat. Conserver l’ARN proprement • 26 L’ARN élué doit être conservé sur la glace pour garantir sa stabilité en raison de l’omniprésence des traces de RNases (matériel du laboratoire, traces de doigts, poussières) susceptibles de dégrader l’ARN purifié. Pour un stockage à court terme, stocker à -20 °C et à -70 °C pour une conservation à long terme. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 NucleoSpin® RNA XS Problèmes Causes possible et suggestions Abrasion de la silice • Discordance entre la quantification par mesure de l'A₂₆₀ et la quantification par PCR En raison du faible contenu en ARN des très petits échantillons extraits, induisant une faible quantité d’ARN purifié, la quantification de l’ARN par mesure de l’absorption A₂₆₀ est souvent altérée en raison de la faible sensibilité de la mesure. Lorsque l’absorption mesurée est proche de la limite de détection du spectrophotomètre, la mesure est sensible à de minimes traces d’abrasion de silice. Afin de prévenir ce type de mesures incohérentes lors de la quantification par mesure de A₂₆₀ de faibles quantités d’ARN, centrifuger l’éluat pendant 30 s à > 11.000 × g et prélever un aliquote sans perturber le moindre sédiment éventuel. Autrement, privilégier une méthode insensible à la présence de résidus de silice (ex : Ribogreen). Mesure hors de la limite de détection du spectrophotomètre Ratio A₂₆₀ / A₂₈₀ inattendu • Afin que la mesure du ratio A₂₆₀/A₂₈₀ soit significative, il est nécessaire que les valeurs A₂₆₀ et A₂₈₀ soit suffisamment supérieures à la limite de détection du photomètre utilisé. Une valeur A₂₈₀ proche du bruit de fond de l’appareil entraîne des ratios A₂₆₀/A₂₈₀ incohérents. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 27 NucleoSpin® RNA XS 6.2 Informations de commande Produit REF Conditionnement NucleoSpin RNA XS 740902.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin® RNA Clean‑up XS 740903.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin® totalRNA FFPE XS 740969.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin RNA 740955.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoZOL 740404.200 200 mL NucleoSpin® RNA Blood 740200.10 / .50 10 / 50 NucleoSpin® totalRNA FFPE ® ® 740982.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 ® 740962.20 20 ® NucleoSpin RNA/Protein 740933.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin® TriPrep 740966.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin® RNA Clean‑up 740948.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin RNA/DNA Buffer Set 740944 Convient pour 100 préparations Tampon RA1 740961 740961.500 60 mL 500 mL rDNase Set 740963 1 set Reducing Agent TCEP NucleoSpin RNA Midi ® 740395.107 107 mg ® NucleoSpin Filters 740606 50 Tubes collecteurs (2 mL) 740600 1000 NucleoProtect® RNA 740400.50 / .250 / .500 50 / 250 / 500 mL Visitez notre site www.mn-net.com pour plus d’informations sur nos produits. 28 MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 Extraction des ARN 6.3 Références Fleige S, Pfaffl MW. : RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 2006 Apr-Jun ; 27(2 – 3) :126 – 39. Epub 2006 Feb 15. Review. Imbeaud S, Graudens E, Boulanger V, Barlet X, Zaborski P, Eveno E, Mueller O, Schroeder A, Auffray C. : Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 2005 Mar 30 ;33(6) :e56. Miller CL, Diglisic S, Leister F, Webster M, Yolken RH. : Evaluating RNA status for RT-PCR in extracts of postmortem human brain tissue. Biotechniques. 2004 Apr ; 36(4) :628 – 33. Schoor O, Weinschenk T, Hennenlotter J, Corvin S, Stenzl A, Rammensee HG, Stevanovic S. : Moderate degradation does not preclude microarray analysis of small amounts of RNA. Biotechniques. 2003 Dec ; 35(6) :1192 – 6, 1198 – 201. MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 29 Extraction des ARN 6.4 Restrictions d’utilisation / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. 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KG Tel. : +49 24 21 969 333 [email protected] 30 MACHEREY-NAGEL – 05/2023 Rev. 12 Plasmid DNA Clean up RNA DNA Viral RNA and DNA Protein High throughput Accessories Auxiliary tools www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 [email protected] CH +41 62 388 55 00 [email protected] FR +33 388 68 22 68 [email protected] US +1 888 321 62 24 [email protected] ">
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