Macherey-Nagel NucleoSpin VET Mode d'emploi

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Manuel d'utilisation NucleoSpin VET - Macherey-Nagel | Fixfr
MACHEREY-NAGEL
Biologie
Moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d’utilisation
ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
n NucleoSpin® VET
Mai 2023 / ​Rev. 02
www.mn-net.com
www.mn-net.com
NucleoSpin® VET – Extraction d’ARN/ADN Viral et ADN Bactérien à partir d’échantillons vétérinaires
Résumé du Protocole (Rev. 02)
Le résumé du protocole est utilisé pour un suivi rapide des étapes de la procédure. Nous recommandons vivement la lecture de la procédure détaillée incluse dans ce manuel avant la première
utilisation du kit.
Note: le protocole FastTrack pour l’extraction à partir de plasma, sérum et solutions de lavages d’écouvillons, ainsi que les protocoles pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’échantillons
stabilisés avec le NucleoProtect VET Blood ou Swab, ne sont décrits que dans les procédures détaillées du manuel d’utilisation.
1
Lyse des
échantillons
5.1
5.2
5.3
5.4
200 μL sérum ou plasma
10 μL PK Liquide
100 µL sang animal
5–10 mg tissus
Ecouvillons secs
Ecouvillons humides
Fèces
10 µL PK Liquide
5–10 mg de tissus dans ‘Bead Tube’
400 µL PBS
Sortir l’écouvillon du milieu
200 μL d’échantillon
100 µL de sang
400 µL PBS
Insérer l’écouvillon
Transférer 300–1000 µL de milieu
Mélanger les fèces avec 10 volumes
de PBS
200 μL SVL
100 µL PBS
Agiter
30 min à TA sous agitation
1 min 2,000 x g
Agiter 10 min 1,400 rpm
200 µL SVL
Enlever les billes
Enlever l’écouvillon
Transférer 200 µL de surnageant
+ 2.5 μL ARN Carrier
Agiter 10 min 1,400 rpm
Transférer 200 µL de surnageant
1 min 2,000 x g
+ 10 µL PK Liquide
Mélanger
+ 2.5 µL ARN Carrier
+ 10 µL PK Liquide
Transférer 200 µL de surnageant
+ 200 µL SVL
Incuber à TA 3 min
Mélanger
+ 200 µL SVL
+ 10 µL PK Liquide
Agiter 10 min 1,400 rpm
Centrifuger rapidement
Incuber à TA 3 min
Agiter 10 min à 1,400 rpm
+ 200 µL SVL
+ 2.5 µL ARN Carrier
Agiter 10 min à 1,400 rpm
Mélanger
+ 2.5 µL ARN Carrier
3 min TA
Mélanger
3 min TA
2
+ 200 μL d’éthanol
Ajuster les
conditions de
fixation
Mélanger
TA, 5 min
Centrifuger rapidement
3
Déposer l’échantillon
Fixation des
ARN/ADN
viral
(~ 610 μL)
4,000 x g, 3 min
4
5
6
5.5
Lavage de la
membrane
Séchage de la
membrane
Elution ARN/
ADN
er
1
Lavage 400 μL SVW1 11,000 x g, 30 s
ème
2
Lavage 400 μL SVW2 11,000 x g, 30 s
3
ème
Lavage 200 μL SVW2 20,000 x g, 5 min
56 °C, 5 min avec le bouchon ouvert
100 μL H2O RNase-free (70 °C)
TA, 3 min
20,000 x g, 3 min
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Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com
5.6
1 min 2,000 x g
Transférer 250 µL
+ 250 µL SVL
Mélanger
+ 10 µL PK Liquide
Agiter 10 min 1,400 rpm
opt. : + 2.5 µL ARN Carrier
Mélanger
3 min TA
3 min 15,000 x g
Prélever 400 µL de surnageant pour
continuer
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ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
Sommaire
1 Composition
4
1.2
Réactifs, consommables et équipements nécessaires
4
1.3
A propos de ce manuel d’utilisation
5
2 Description du kit
6
2.1
Principe général
6
2.2
Caractéristiques du kit
6
2.3
Remarques sur la qualité et la préparation des échantillons biologiques
7
2.4
Remarques à propos de l’élution
7
2.5
Remarques concernant le contrôle qualité des kits
7
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
8
4 Instructions de sécurité
9
4.1
9
Elimination des déchets
5 Protocole pour la purification d’ARN / ​ADN viral et d’ADN bactérien
10
5.1
Protocole standard pour le sérum, le plasma ou les fluides biologiques acellulaires
10
5.2
Prétraitement des échantillons de sang animal
14
5.3
Prétraitement des échantillons de tissus
15
5.4
Prétraitement des écouvillons secs
17
5.5
Prétraitement des écouvillons humides (en milieu de transport, VTM)
18
5.6
Prétraitement des Fèces
20
5.7
Prétraitement des écouvillons stabilisés dans le NucleoProtect® VET
22
5.8
Prétraitement d'échantillons de sang stabilisés dans le NucleoProtect® VET
23
6 Protocole FastTrack pour le plasma, le sérum et les solutions de lavage d’écouvillons
25
7 Annexes
27
7.1
Optimisation des performances
27
7.2
Informations de commande
27
7.3
Restrictions d’utilisation / garantie
28
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
3
ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
1
Composition
1.1
Composants des kits
NucleoSpin® VET
10 preps
740842.10
50 preps
740842.50
250 preps
740842.250
Tampon de lyse SVL
13 mL
25 mL
125 mL
Tampon de lavage SVW1
6 mL
30 mL
125 mL
Tampon de lavage SVW2
(Concentré)*
6 mL
12 mL
50 mL
H2O RNase-free
13 mL
13 mL
13 mL
ARN Carrier (lyophilisé)
300 µg
300 μg
300 µg
Protéinase K Liquide
120 µL
600 μL
2 × 1.5 mL
Colonnes NucleoSpin® VET
(bagues rouges, avec tubes
collecteurs)
10
50
250
Tubes collecteurs (2 mL)
30
150
750
Tubes collecteurs (1.5 mL) pour la
lyse et l’élution
20
100
500
REF
1.2
Réactifs, consommables et équipements nécessaires
Réactifs
•
Ethanol 96 – 100 % (pour préparer le Tampon de lavage SVW2 et créer les conditions de
fixation de l’ARN / ​ADN) ; il est recommandé d’utiliser de l’éthanol non-dénaturé.
•
PBS (Tampon phosphate salin) pour l’extraction à partir de sang, de tissus, d’écouvillons
et de fèces.
Consommables
•
Cônes de pipette jetables (les cônes à filtres sont recommandés pour éviter les
contaminations croisées).
* Pour la préparation des réactifs et leurs conditions de stockage, voir le chapitre 3.
4
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
Equipement
•
Pipettes manuelles
•
Centrifugeuse pour microtubes
•
Agitateur vortex
•
Bloc chauffant : 56 °C pour le séchage des colonnes et 70 °C pour le tampon d’élution
(inutile pour le protocole ’FastTrack’)
•
Equipement de protection personnelle (ex : blouse, gants, lunettes de protection)
•
Tubes de broyage ’MN Bead Tubes Type D’ (voir ’informations de commande’) pour
l’extraction à partir de tissus.
1.3
A propos de ce manuel d’utilisation
Nous recommandons vivement la lecture du protocole détaillé aux nouveaux utilisateurs du kit
NucleoSpin® VET. Cependant, les utilisateurs expérimentés peuvent se référer au ’Résumé du
Protocole’, conçu pour un suivi rapide des différentes étapes de la procédure de purification.
Toute la littérature technique est disponible sur notre site web : www.mn‑net.com.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
5
ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
2
Description du kit
2.1
Principe général
Le kit NucleoSpin® VET propose des protocoles pour différents échantillons vétérinaires
(sérum, plasma, fluides biologiques acellulaires, sang, tissus, écouvillons, fèces). Les protocoles
se différencient par les procédures de prétraitement et de lyse des échantillons contenant les
virus afin de répondre aux différentes particularités des prélèvements. La lyse des échantillons
et des virus est effectuée grâce au Tampon de lyse SVL, solution fortement concentrée en ions
chaotropiques, combiné à la Protéinase K Liquide incluse dans le kit. Après la lyse, tous les
protocoles suivent la même procédure. L’échantillon est déposé sur la colonne NucleoSpin®
VET et les acides nucléiques fixés à la membrane. Les contaminants (potentiels inhibiteurs de
PCR), comme les sels, les métabolites et les composants cellulaires macromoléculaires sont
éliminés simplement lors d’étape de lavages avec les tampons à base d’alcool SVW1 et SVW2.
Les acides nucléiques sont finalement élués dans de l’eau RNase-Free et sont directement
utilisables pour les applications ultérieures.
L’ARN Carrier améliore la fixation et le rendement d’extraction pour les acides nucléiques
faiblement concentrés mais il n’est pas systématiquement utilisé dans tous les protocoles.
2.2
Caractéristiques du kit
Le kit NucleoSpin® VET est conçu pour la préparation rapide d’acides nucléiques hautement
purifiés (virus à ARN simple/double brin, virus à ADN simple/double brin et ADN bactériens) à
partir d’échantillons vétérinaires comme le plasma, le sérum, les fluides biologiques acellulaires,
le sang, les tissus, les écouvillons secs/humides et les fèces.
•
Risque de contaminations croisées réduit grâce aux colonnes individuelles fermées par un
bouchon. Tous les échantillons compatibles peuvent être traités selon le même protocole
standard après le prétraitement adapté.
•
Le kit NucleoSpin® VET permet d’extraire les acides nucléiques à partir de 200 μL de
plasma / ​sérum, 100 µL de sang total, 5 – 10 mg de tissus, 1 écouvillon sec ou humide ou
encore environ 100 mg de fèces.
•
Les acides nucléiques purifiés sont compatibles avec les applications de type
séquençage de l’ADN par fluorescence automatisé, les RT-PCR, la PCR ou tout autre
type de réactions enzymatiques.
•
La limite de détection pour les virus dépend de la procédure de détection utilisée, par
exemple la PCR (ou RT-PCR) nichée ou la qRT-PCR. Nous recommandons fortement
la mise en œuvre de contrôles internes, ainsi que des contrôles positifs et négatifs de
manière à valider les procédures de purification, d’amplification et de détection.
•
ARN Carrier (ARN-poly(A) : sel de potassium-poly(A), préparé à partir d’ADP avec la
polynucléotide phosphorylase) est inclus dans les kits pour des performances optimales.
•
Protéinase K Liquide est incluse dans le kit pour faciliter la lyse des protéines des
échantillons.
•
Le procédure s’effectue par centrifugation. Uniquement pour la recherche (RUO).
6
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
Tableau 1: Résumé des caractéristiques du kit
Paramètre
NucleoSpin® VET
Technologie
Technologie à membrane de silice
Format
Mini colonnes spin
Echantillons
200 μL de sérum, plasma, liquides biologiques acellulaires, 100 µL
de sang, 5 – 10 mg de tissu, écouvillon sec ou humide, ou environ
100 mg de fèces.
Taille des fragments
environ 100 bp – 50 kb
Volume d’élution
100 μL
Temps de préparation
20 – 40 min
2.3
Remarques sur la qualité et la préparation des
échantillons biologiques
Différents types d’échantillons vétérinaires peuvent être utilisés avec le kit NucleoSpin® VET.
Pour une purification optimale, un mélange homogène, clair et non visqueux est indispensable
avant de le charger sur la colonne NucleeoSpin® VET. Aussi, veillez à vérifier l’absence de
précipités dans chaque échantillon (en particulier les prélèvements anciens ou congelés). Eviter
de clarifier les échantillons de plasma/sérum par centrifugation ou filtration avant l’étape de lyse
avec le tampon SVL, les virus associés aux particules ou agrégats pourraient être éliminés.
2.4
Remarques à propos de l’élution
•
Les acides nucléiques purifiés sont finalement élués en conditions de faible force ionique
avec de l’H2O RNase-free.
•
L’élution peut être réalisée en une seule étape selon la procédure du protocole
standard, induisant l’élution d’au moins 80 % des acides nucléiques fixés. Pour
améliorer la sensibilité, l’éluat peut être redéposé sur la membrane, ceci permettant
d’augmenter légèrement l’efficacité d’élution et la concentration des acides nucléiques
récupérés. Autrement, une seconde étape d’élution peut être effectuée avec un volume
supplémentaire d’eau, permettant l’élution de la quasi-totalité des acides nucléiques fixés
à la membrane, mais en impactant la concentration.
•
Une concentration élevée en ARN/ADN est cruciale et souhaitable pour la plupart des
applications avales. Ceci est particulièrement vrai si le volume total de réaction est
réduit. En raison d’un volume d’élution élevé, les kits de purification ARN/ADN courants
ne permettent pas d’obtenir des concentrations élevées, si l’échantillon biologique est
faiblement chargé. De telles méthodes nécessitent souvent une étape de concentration
supplémentaire avant les applications avales.
2.5
Remarques concernant le contrôle qualité des kits
En accord avec le système de management de la qualité de MACHEREY‑NAGEL, les
caractéristiques de chaque composant des kits NucleoSpin® VET sont vérifiés afin de garantir
la constance des performances.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
7
ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention : les Tampons SVL et SVW1 contiennent des sels de guanidine ! Porter des gants et
des lunettes de protection !
•
Vérifier l’intégrité des contenants tels que les flacons ou emballages des colonnes à la
réception du kit. Ne pas utiliser de composants si l’emballage est détérioré. Contacter
MACHEREY‑NAGEL.
•
A réception, le kit NucleoSpin® VET doit être stocké à température ambiante (15 – 25 °C)
et est stable jusqu’à : voir l’étiquette sur le kit. Il n’est PAS nécessaire d’ouvrir le kit à
réception afin de stocker les composants séparément.
•
Après ouverture, il est recommandé de stocker la Protéinase K Liquide à 4 °C ou à
-20 °C.
•
Utiliser des équipements exempts de RNases.
Avant de débuter la procédure NucleoSpin® VET, préparer les réactifs suivants :
•
ARN Carrier (300 μg) : il est fourni sous forme lyophilisée. Dissoudre l’ARN Carrier dans
de l’eau RNase-Free pour obtenir une solution de travail (100 ng/μL), voir le tableau
ci-dessous. Stocker la solution obtenue à -20 °C. En raison du procédé de fabrication,
l’ARN Carrier est souvent très peu visible dans le flacon.
•
Tampon de lavage SVW2 : ajouter le volume indiqué (sur le flacon ou dans le tableau
ci-dessous) d’éthanol (96 – 100 % ; de l’éthanol non-dénaturé est recommandé) dans le
flacon de Tampon de lavage SVW2 Concentré. Indiquer sur le flacon que l’éthanol a bien
été ajouté. Conserver le Tampon de lavage SVW2 à température ambiante.
•
Protéinase K Liquide est fournie prête à l’emploi. Après ouverture, stocker le flacon de
Protéinase K liquide à 4 °C ou à -20 °C.
NucleoSpin® VET
10 preps
740842.10
50 preps
740842.50
250 preps
740842.250
Tampon SVW2
(Concentré)
6 mL
Ajouter 24 mL
d’éthanol
12 mL
Ajouter 48 mL
d’éthanol dans
chaque bouteille
50 mL
Ajouter 200 mL
d’éthanol
ARN Carrier
300 μg
Ajouter 3 mL d’H2O
RNase-free
300 μg
Ajouter 3 mL d’H2O
RNase-free
300 μg
Ajouter 3 mL d’H2O
RNase-free
REF
8
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
4
Instructions de sécurité
Lors de l’utilisation du kit NucleoSpin® VET, porter des vêtements de protection (ex : blouse,
gants jetables, et lunettes de protection). Pour plus d’informations, consulter les Fiches de
Données de Sécurité (FDS) disponibles en ligne : www.mn net.com/msds.
Les tampons SVL et SVW1, les NucleoProtect® VET Blood et Swab tubes ainsi que le
réactif NucleoProtect® VET contiennent un sel chaotropique (par exemple, du chlorhydrate de
guanidine et/ou du thiocyanate de guanidinium) qui peut former des composés hautement
réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorite de sodium) ! NE PAS ajouter
d’eau de Javel ou de solutions acides directement dans les déchets de préparation des
échantillons.
La capacité d’inactivation du réactif NucleoProtect® VET a été démontrée pour diverses
matrices et des virus connus pour avoir des structures d’enveloppe ainsi que des sensibilités
aux désinfectants différentes : FMDV (petit virus non enveloppé), BTV-5 (grand virus non
enveloppé), LSDV (grand virus enveloppé), PPRV et BCoV (virus enveloppé). Les échantillons
doivent être incubés pendant au moins 30 minutes pour une inactivation complète. Aucune
réclamation ne peut être faite concernant l’inactivation d’autres virus ou matrices de fond.
L’absence de résidus de matériel infectieux dans les déchets générés lors de la procédure
NucleoSpin® VET n’a pas été testée. Une contamination des déchets liquides avec du matériel
infectieux résiduel est hautement improbable en raison de la nature fortement dénaturante du
tampon de lyse et du traitement à la Protéinase K, mais ne peut être totalement exclu. Aussi,
traiter les déchets liquides comme potentiellement infectieux et éliminer les en accord avec les
règlementations locales en vigueur.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, infectieuses ou contaminées par du matériel biologique
d’une manière sûre et en accord avec les règlementations locales en vigueur.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
9
NucleoSpin® VET
5
Protocole pour la purification d’ARN / ​ADN viral
et d’ADN bactérien
Le protocole standard décrit la procédure pour un volume de 200 µL d’échantillon
(homogénéisé). Pour la préparation à partir d’échantillons de diverses natures (ex : tissus, fèces,
écouvillons), merci de consulter les chapitres 5.2 à 5.6.
Après la lyse, tous les protocoles suivent les mêmes étapes (à partir de l’étape 2 : ajout de
200 µL d’éthanol pour créer les conditions de fixation des acides nucléiques).
5.1
Protocole standard pour le sérum, le plasma ou les fluides
biologiques acellulaires
Avant de débuter la procédure :
•
Pour les échantillons de plasma et de sérum congelés, nous recommandons de ne pas
décongeler plus d’une fois avant utilisation.
•
Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a bien été préparé selon les instructions du
chapitre 3.
•
Vérifier que l’ARN Carrier a bien été dissout dans l’eau (solution de travail).
•
La procédure doit être totalement réalisée à température ambiante.
•
Préchauffer l’H2O RNase-free (pour l’élution) à 70 °C.
1
Lyse de l’échantillon
Déposer 10 µL de Protéinase K Liquide dans un tube
(1.5 mL, inclus).
10 μL
Protéinase K
La Protéinase K peut être déposée sur les parois internes
des tubes. Vérifier visuellement que la Protéinase K a bien été
déposée dans le tube !
Ajouter 200 μL d’échantillon et mélanger modérément.
Ajouter 200 μL de Tampon de lyse SVL dans le tube.
Agiter pendant 10 min à 1,400 rpm (par exemple sur un
Thermoshaker (Eppendorf)) à température ambiante.
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à
~ 2,000 x g) pour collecter les gouttes présentes sur les
bouchons (centrifugation courte uniquement).
Ajouter 2.5 μL de solution d’ARN Carrier (100 ng/μL).
Mélanger le contenu du tube en vortexant ou par pipetage.
Incuber pendant 3 min à température ambiante.
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à
~ 2,000 x g) pour collecter les gouttes présentes sur les
bouchons (centrifugation courte uniquement).
10
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
+200 μL
d’échantillon
+200 μL SVL
Agiter, 10 min
1,400 rpm
~ 1 s,
~ 2,000 x g
+2.5 μL
ARN Carrier
Mélanger
TA, 3 min
~ 1 s,
~ 2,000 x g
NucleoSpin® VET
2
Ajuster les conditions de fixation
Ajouter 200 μL d’éthanol (96 – 100 %) dans le tube et mélanger
en votexant (10 – 15 s).
+200 μL
d’éthanol
Incuber pendant 5 min à température ambiante.
TA, 5 min
Centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour
collecter les gouttes présentes sur les bouchons (centrifugation
courte uniquement).
~ 1 s,
~ 2,000 x g
Ne pas centrifuger à une vitesse supérieure, à cette étape !
3
Fixer l’ARN / ​l’ADN viral ​
Déposer le lysat (610 μL) sur une colonne NucleoSpin® VET
et centrifuger pendant 3 min à 4,000 x g.
Si le lysat n’est pas totalement passé à travers la membrane,
répéter la centrifugation à vitesse supérieure (15,000 – 20,800
x g pendant 1 min). Si le lysat n’est toujours pas passé, vérifier
que l’échantillon n’a pas été utilisé en quantité excessive.
Déposer
l’échantillon
3 min,
4,000 x g
Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un nouveau tube
collecteur (2 mL, fourni) et jeter le tube collecteur contenant le
filtrat issu de l’étape précédente.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
11
NucleoSpin® VET
4
Lavage et séchage de la membrane de silice
+400 μL SVW1
1er Lavage
Ajouter 400 μL de Tampon de lavage SVW1 sur la colonne
NucleoSpin® VET.
Centrifuger 30 s à 11,000 x g.
30 s,
11,000 x g
Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un nouveau tube
de collection (2 mL, fourni) et jeter le filtrat issu de l’étape
précédente.
+400 μL SVW2
2ième lavage
Ajouter 400 μL de Tampon de lavage SVW2 sur la colonne
NucleoSpin® VET.
30 s,
11,000 x g
Centrifuger 30 s à 11,000 x g.
Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un nouveau tube
de collection (2 mL, fourni) et jeter le filtrat issu de l’étape
précédente.
Note : veiller à éliminer les résidus de tampon de l’étape
précédente avec le Tampon SVW2, en particulier si le lysat est
entré en contact avec la partie supérieure de la colonne où
se positionne le bouchon. Pour un lavage efficace, rincer cette
partie de la colonne avec le Tampon SVW2.
3ième lavage
Ajouter 200 μL de Tampon de lavage SVW2 sur la colonne
NucleoSpin® VET.
+200 μL SVW2
5 min,
20,000 x g
Centrifuger 5 min à 20,000 x g.
Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un nouveau tube
de collection (2 mL, fourni) et jeter le filtrat issu de l’étape
précédente.
Incuber l’ensemble pendant 5 min à 56 °C avec le bouchon de
la colonne ouvert.
12
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
56 °C, 5 min
NucleoSpin® VET
5
Eluer l’ARN/ADN
Ajouter 100 μL d’H2O RNase-free (préchauffée à 70 °C) sur la
membrane de la colonne.
Note : Un volume d’élution inférieur au 100 µL recommandé
ou l’utilisation du tampon d’élution à température ambiante
sont possible mais réduisent significativement l’efficacité de
l’élution.
Incuber 3 min à température ambiante.
Centrifuger 3 min à 20,000 x g pour éluer les acides nucléiques
de la colonne.
+100 μL
H2O RNasefree (70 °C)
TA, 3 min
3 min,
20,000 x g
Conserver l’ARN/ADN élué sur la glace ou congeler pour un
stockage à long terme.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
13
NucleoSpin® VET
5.2
Prétraitement des échantillons de sang animal
Avant de débuter la procédure :
Pour le sang animal, des tubes de collecte courant contenant un anticoagulant (ex : EDTA)
sont recommandés. Les sangs traités à l’EDTA, au citrate ou à l’héparine sont compatibles.
Les échantillons peuvent être utilisés frais ou congelés. Décongeler les sangs plus d’une fois
peut impacter la qualité des extractions. Nous recommandons une prise d’essais de 100 µL
pour les sangs issus d’espèces aux érythrocytes anucléés. Cependant, un nombre de cellules
élevé en raison d’une réponse inflammatoire ou de pathologies néoplasiques, peut induire un
contenu élevé en acides nucléiques. Dans ce cas, nous recommandons de réduire le volume
d’échantillon à 50 µL. Pour les sangs contenant des érythrocytes nucléés (ex : sangs de
poissons, oiseaux, reptiles), utiliser moins de 50 µL.
•
Vérifier la disponibilité de PBS.
•
Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a été préparé selon les instructions du chapitre 3.
•
Vérifier que l’ARN Carrier a bien été dissout dans l’eau (solution de travail).
•
La procédure est à effectuer à température ambiante.
•
Préchauffer l’H2O RNase-free (pour l’élution) à 70 °C.
1
Lyse de l’échantillon
Déposer 10 µL de Protéinase K Liquide dans un tube
(1.5 mL, fourni).
10 µL
Protéinase K
Liquide
La Protéinase K peut être déposée sur les parois internes
des tubes. Vérifier visuellement que la Protéinase K a bien été
déposée dans le tube !
Ajouter 100 µL de sang animal et 100 µL de PBS dans le
tube. Si un volume inférieur à 100 µL doit être traité, augmenter
le volume de PBS pour ramener le volume de mélange sangPBS à 200 µL.
Ajouter 200 μL de Tampon de lysis SVL dans le tube.
Agiter le tube pendant 10 min à 1,400 rpm (par exemple sur un
Thermoshaker Eppendorf) à température ambiante.
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s
à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon
(centrifugation brève uniquement).
Ajouter 2.5 μL de solution de travail d’ARN Carrier (100 ng/
μL) dans le tube.
Mélanger le contenu du tube en vortexant ou par pipetage.
Incuber pendant 3 min à température ambiante.
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s
à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon
(centrifugation brève uniquement).
14
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
+100 μL de
sang
+100 µL PBS
+200 μL SVL
Agiter 10 min
1,400 rpm
~1 s
~2,000 x g
+2,5 µL d’ARN
Carrier
Mélanger
TA, 3 min
~ 1 s,
~ 2,000 x g
NucleoSpin® VET
Après le prétraitement de l’échantillon, continuer avec la procédure du protocole standard
paragraphe 5.1 étape 2 (page 11) :
Ajuster les conditions de fixation (qui correspond à l’ajout de 200 μL d’éthanol).
5.3
Prétraitement des échantillons de tissus
Avant de débuter la procédure :
•
Note : l’importante quantité d’acides nucléiques co-purifiés (ADN/ARN des cellules hôtes)
peut entraîner l’inhibition de la polymérase dans les réactions de PCR ultérieures. Dans ce
cas, nous recommandons de réduire la quantité initiale de tissus à extraire.
•
Note : l’ajout d’ARN Carrier est déconseillé pour les échantillons de tissus, ceux-ci
contenant déjà une grande quantité d’ADN.
•
Note : les échantillons de tissus peuvent différer grandement en terme de texture,
de rigidité, de types de cellules et de contenu en acides nucléiques et en substances
inhibitrices. Par ailleurs, la localisation des acides nucléiques des pathogènes peut varier
selon le type de tissus, les pathogènes et de l’étape de l’infection. Ainsi, les protocoles de
prétraitement proposés ci-dessous devront être validés pour chaque couple tissus / ​cibles
pathogènes. Par exemple, pour les échantillons de rate, contenant une forte quantité
d’acides nucléiques de l’hôte, l’utilisation de 5 – 10 mg de tissus est recommandée.
•
Vérifier la disponibilité de tampon PBS.
•
Vérifier la disponibilité des tubes de broyage ’MN Bead Tubes Type D’.
•
Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a bien été préparé selon les instructions du
chapitre 3.
•
La procédure est effectuée à température ambiante.
•
Préchauffer l’H2O RNase-Free (pour l’élution) à 70 °C.
1
Lyse des tissus et des virus
Transférer 5 – 10 mg de tissus (ex. : foie de volailles) dans un
tube de broyage MN Bead Tube Type D (voir ’Informations de
commande’).
Ajouter 400 μL de PBS dans le tube et refermer.
Agiter le tube dans le broyeur pour homogénéiser
l’échantillon. Pour un broyeur Retsch ’mixer-mill’ une durée
d’homogénéisation d’environ 30 secondes à une fréquence de
30 Hertz est recommandée. D’autre appareils de broyage sont
également compatibles, mais peuvent nécessiter des réglages
différents.
Enlever les billes du tube (par ex., au moyen d’un aimant pour
attirer les billes dans le bouchon du tube).
Centrifuger le tube pendant 1 min à 2,000 x g afin d’éliminer
les débris de tissus.
Transférer
5 – 10 mg de
tissus dans
un Bead Tube
+400 µL PBS
Broyer
Enlever les
billes
1 min,
2,000 x g
Note : ne pas centrifuger plus longtemps ou plus vite afin
d’éviter la sédimentation des particules virales.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
15
NucleoSpin® VET
Transférer 200 μL de surnageant clarifié dans un nouveau
tube.
Ajouter 10 µL de Protéinase K Liquide dans le tube et
mélanger modérément
Transférer
200 µL de
surnageant
+10 μL
Protéinase K
La protéinase K peut être déposée sur la paroi interne du tube.
Vérifier visuellement que la Protéinase K a bien été déposée
dans le tube !
Ajouter 200 μL de Tampon de lyse SVL dans le tube.
Agiter le tube pendant 10 min à 1,400 rpm (par ex., avec un
Thermoshaker Eppendorf) à température ambiante.
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s
à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon
(centrifugation brève uniquement).
+200 μL SVL
Agiter 10 min
1,400 rpm
~ 1 s,
~ 2,000 x g
Note : l’utilisation d’ARN Carrier n’est pas recommandée,
l’échantillon de tissus contenant déjà une grande quantité
d’acides nucléiques.
Continuer avec la procédure décrite à l’étape 2 du paragraphe 5.1 (page 11) : Ajuster les
conditions de fixation (qui correspond à l’ajout de 200 μL d’éthanol).
16
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
NucleoSpin® VET
5.4
Prétraitement des écouvillons secs
Avant de débuter la procédure :
•
Différents types d’écouvillons utilisés pour la collecte des échantillons vétérinaires sont
compatibles (ex : écouvillons cloacaux).
•
Vérifier la disponibilité de tampon PBS.
•
Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a bien été préparé selon les recommandations du
chapitre 3.
•
Vérifier que l’ARN Carrier a bien été dissout dans l’eau (solution de travail).
•
La procédure est effectuée à température ambiante.
•
Préchauffer l’H2O RNase-free (pour l’élution) à 70 °C.
1
Lyse de l’échantillon
Ajouter 400 μL de PBS (Tampon phosphate salin) dans un
tube 2 mL (non fourni)
400 µL PBS
Note : pour les écouvillons absorbant plus qu’environ 200 µL
de solution, il est recommandé d’augmenter le volume de PBS
afin de récupérer un volume final de 200 µL après incubation
de l’écouvillon sec et son retrait de la solution de PBS.
Après prélèvement de l’échantillon sur un écouvillon sec
(ex : prélèvement cloacal), insérer l’écouvillon dans le tube
contenant le PBS.
Incuber à température ambiante sous agitation pendant
30 minutes.
Retirer l’écouvillon du tube.
Centrifuger le tube pendant 1 min à 2,000 x g afin d’éliminer
les débris solides.
Note : ne pas centrifuger plus longtemps ou plus fort afin
d’éviter la sédimentation des particules virales.
Insérer
l’écouvillon
Incuber à
TA pendant
30 min
Enlever
l’écouvillon
1 min 2,000
xg
Transférer 200 μL de surnageant dans un nouveau tube.
Ajouter 10 µL de Protéinase K Liquide dans un tube et
mélanger modérément.
La Protéinase K peut être déposée sur la paroi interne du tube.
Vérifier visuellement que la Protéinase K a bien été déposée
dans le tube !
Transférer
200 µL de
surnageant
+10 μL
Protéinase K
Ajouter 200 μL de Tampon de lyse SVL dans le tube.
Agiter le tube pendant 10 min à 1,400 rpm (par ex., sur un
Thermoshaker Eppendorf) à température ambiante.
+200 μL SVL
Agiter, 10 min
1,400 rpm
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s
à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon
(centrifugation brève uniquement).
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
17
NucleoSpin® VET
Ajouter 2.5 μL de solution de travail d’ARN Carrier (100 ng/
μL) dans le tube.
Mélanger le contenu du tube en vortexant ou par pipetage.
Incuber pendant 3 min à température ambiante.
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s
à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon
(centrifugation brève uniquement).
~ 1 s,
~ 2,000 x g
+2.5 μL ARN
Carrier
Mélanger
TA, 3 min
~ 1 s,
~ 2,000 x g
Continuer avec l’étape 2 du paragraphe 5.1 (page 11) : Ajuster les conditions de fixation (qui
correspond à l’ajout de 200 μL d’éthanol).
5.5
Prétraitement des écouvillons humides (en milieu de
transport, VTM)
Avant de débuter la procédure :
•
Note : le milieu de transport ou de stabilisation peut être de composition chimique
variable selon le fabricant. La compatibilité avec le kit NucleoSpin® VET doit être vérifiée
préalablement.
•
Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a bien été préparé selon les recommandations du
chapitre 3.
•
Vérifier que l’ARN Carrier a bien été dissout dans l’eau (solution de travail).
•
La procédure est effectuée à température ambiante.
•
Préchauffer l’H2O RNase-free (pour l’élution) à 70 °C.
18
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
NucleoSpin® VET
1
Lyse de l’échantillon
Enlever l’écouvillon du tube contenant le milieu de transport
(ex. : Sigma-Virocult®).
Transférer approximativement 300 – 1000 μL de milieu de
transport dans un nouveau tube (non fourni).
Centrifuger le tube pendant 1 min à 2,000 x g afin d’éliminer
les débris solides.
Enlever
l’écouvillon du
milieu
Transférer
300 – 1000 µL
de milieu
1 min 2,000 x g
Note : ne pas centrifuger plus longtemps ou plus fort afin
d’éviter la sédimentation des particules virales.
Transférer 200 μL de surnageant dans un nouveau tube.
Ajouter 10 µL de Protéinase K Liquide dans un tube et
mélanger modérément.
Transférer
200 µL
+10 μL
Protéinase K
La Protéinase K peut être déposée sur la paroi interne du tube.
Vérifier visuellement que la Protéinase K a bien été déposée
dans le tube !
Ajouter 200 μL Tampon de lyse SVL dans le tube.
Agiter le tube pendant 10 min à 1,400 rpm (par exemple. sur
un Thermoshaker Eppendorf) à température ambiante.
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s
à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon
(centrifugation brève uniquement).
Ajouter 2.5 μL de solution de travail d’ARN Carrier (100 ng/
μL) dans le tube.
Mélanger le contenu du tube en vortexant ou par pipetage.
Incuber pendant 3 min à température ambiante.
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s
à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon
(centrifugation brève uniquement).
+200 μL SVL
Agiter, 10 min
1,400 rpm
~ 1 s,
~ 2,000 x g
+2.5 μL ARN
Carrier
Mélanger
TA, 3 min
~ 1 s,
~ 2,000 x g
Continuer avec l’étape 2 du paragraphe 5.1 (page 11) : Ajuster les conditions de fixation (qui
correspond à l’ajout de 200 μL d’éthanol).
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
19
NucleoSpin® VET
5.6
Prétraitement des Fèces
Avant de débuter la procédure :
•
Note : les échantillons fécaux sont très variables quant à leur texture, rigidité, contenu en
eau, en acides nucléiques issus des pathogènes et en substances inhibitrices. Ainsi, les
performances des protocoles de prétraitement proposés ci-dessous doivent être évaluées
pour chaque combinaison échantillon fécal et pathogène ciblé. Les fèces dures et/ou
séchées peuvent nécessiter un broyage mécanique et/ou un volume supérieur de PBS de
manière à obtenir une masse assez liquide.
•
Note : les fèces varient grandement en terme de contenu en inhibiteurs. Pour certains
échantillons très riches en inhibiteurs, il peut s’avérer nécessaire de réduire la quantité de
matériel initial. Pour les échantillons difficiles, il est recommandé de ne pas utiliser plus de
100 mg de fèces dans 1 mL de PBS.
•
Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a bien été préparé selon les recommandations du
chapitre 3.
•
Vérifier que l’ARN Carrier a bien été dissout dans l’eau (solution de travail).
•
La procédure est effectuée à température ambiante.
•
Préchauffer l’H2O RNase-free (pour l’élution) à 70 °C.
20
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
NucleoSpin® VET
1
Lyse de l’échantillon
Mélanger l’échantillon de fèces avec 10 volumes de PBS
(10 x le volume ou 10 x la masse de fèces), par ex., mélanger
100 mg ou 100 μL de fèces avec 1 mL de PBS et mélanger
vigoureusement pour resuspendre les particules et obtenir
une suspension de matières fécales.
Centrifuger le tube pendant 1 min à 2,000 x g afin d’éliminer
les débris solides.
Mélanger les
fèces avec 10
vol. de PBS
1 min 2,000xg
Note : ne pas centrifuger plus longtemps ou plus fort afin
d’éviter la sédimentation des particules virales.
Transférer 250 μL de surnageant dans un tube neuf.
Note : les particules flottantes ne doivent pas être prélevées
mais éliminées avec le reste des sédiments.
Ajouter 250 μL de Tampon de lyse SVL dans le tube
contenant le surnageant.
Mélanger
vortexant.
vigoureusement
pendant
30 secondes
en
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s
à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon
(centrifugation brève uniquement).
Ajouter 10 μL de Protéinase K liquide.
Agiter le tube pendant 10 min à 1,400 rpm (par exemple, sur
un Thermoshaker Eppendorf) à température ambiante.
Optionnel : Ajouter 2.5 μL de solution de travail d’ARN
Carrier (100 ng/μL) dans le tube et mélanger le contenu du
tube en vortexant ou par pipetage.
Incuber pendant 3 min à température ambiante.
Centrifuger le tube pendant 3 min à environ 15,000 x g afin
d’éliminer les débris non lysés.
Récupérer 400 μL de surnageant et transférer dans un
nouveau tube.
Note : cette étape élimine les résidus d’échantillon non lysé ;
utiliser uniquement le surnageant et jeter les sédiments !
Transférer
250 µL
+250 μL SVL
Mélanger
~ 1 s,
~ 2,000 x g
+10 µL
Protéinase K
Mélanger,
10 min 1,400
rpm
opt. : +2.5 μL
ARN Carrier
Mélanger
TA, 3 min
~ 3 min,
~ 15,000 x g
Récupérer et
continuer avec
400 µL de
surnageant
Continuer avec l’étape 2 du paragraphe 5.1 (page 11) : Ajuster les conditions de fixation (qui
correspond à l’ajout de 200 μL d’éthanol).
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
21
NucleoSpin® VET
5.7
Prétraitement des écouvillons stabilisés dans le
NucleoProtect® VET
Note : L’extraction d’acides nucléiques à partir d’écouvillons non stabilisés et stabilisés avec
du NucleoProtect® VET peut être réalisée en parallèle. La modification du protocole pour les
écouvillons stabilisés est limitée au prétraitement de l’échantillon uniquement.
Avant de débuter la procédure :
•
Pour le traitement des échantillons d’écouvillons stabilisés avec le NucleoProtect® VET,
un tampon supplémentaire PFN est nécessaire (REF 740121.5, voir les Informations de
commande).
•
Vérifier que le tampon de lavage SVW2 a été préparé conformément au chapitre 3.
•
Vérifier que l’ARN Carrier est dissous dans l’eau (solution de travail).
•
La procédure complète doit être effectuée à température ambiante (18 – 25 °C).
•
Préchauffer l’H₂O sans RNase (pour l’élution) à 70 °C.
1
Lyse de l’échantillon
Vortexer le NucleoProtect® VET Swab Tube ou le tube
contenant un écouvillon stabilisé dans le réactif NucleoProtect®
VET pendant 30 secondes. Centrifuger brièvement le tube
pendant 10 secondes à 200 x g pour éliminer les gouttes qui
se retrouve dans le couvercle.
Prélever 200 μL de la solution et transférer dans un tube
propre (par ex. 1,5 mL).
Ajouter 100 μL de tampon de lyse SVL, 100 μL d’eau, 2 μL
de tampon PFN et agiter au vortex pendant 10 à 15 s.
Note : le tampon SVL, l’eau et le PFN peuvent être mélangés
pour obtenir un prémix. Pour 10 echantillons, mélanger
1000 µL de SVL, 1000 µL d’eau et 20 µL de PFN.
Ajouter 10 μL de Protéinase K Liquide dans le tube et
mélanger modérément.
Mélanger le tube pendant 10 min à 1 400 rpm (p.e. en utilisant
un Thermomixer Eppendorf) à température ambiante.
22
transférer
200 µL de
solution dans
un tube propre
+100 μL SVL
+100 µL eau
+2 µL PFN
Ajouter 2,5 μL de solution de travail d’ARN Carrier
(100 ng/μL) dans le tube.
+10 µL
Protéinase K
Liquide
Mélanger le contenu du tube par vortex ou en pipettant à
plusieurs reprises.
opt. : +2.5 μL
ARN Carrier
Incuber pendant 3 minutes à température ambiante.
Mélanger
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s
à ~ 2.000 x g) pour enlever les gouttes du couvercle
(centrifugation courte seulement).
TA, 3 min
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
~ 1 s,
~ 2,000 x g
NucleoSpin® VET
Après le prétraitement de l’échantillon, continuer avec la
procédure du protocole standard au chapitre 5.1 et l’étape 2
(page 11) : Ajuster les conditions de fixation (qui consiste à
ajouter de 200 μL d’éthanol).
2
5.8
Prétraitement d'échantillons de sang stabilisés dans le
NucleoProtect® VET
Note : L’extraction d’acides nucléiques à partir de sang non stabilisés et stabilisés avec du
NucleoProtect® VET peut être réalisée en parallèle. La modification du protocole pour les
échantillons de sang stabilisés est limitée au prétraitement de l’échantillon uniquement.
Avant de débuter la procédure :
•
Pour le traitement des échantillons de sang stabilisé avec le NucleoProtect® VET, un
tampon supplémentaire PFN est nécessaire (REF 740121.5, voir les Informations de
commande).
•
Vérifier que le tampon de lavage SVW2 a été préparé conformément au chapitre 3.
•
Vérifier que l’ARN Carrier est dissous dans l’eau (solution de travail).
•
La procédure complète doit être effectuée à température ambiante (18 – 25 °C).
•
Préchauffer l’H2O sans RNase (pour l’élution) à 70 °C.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
23
ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
1
Lyse de l’échantillon
Vortexer le NucleoProtect® VET Blood Tube ou le tube
contenant du sang stabilisé dans le réactif NucleoProtect®
VET pendant 30 secondes. Centrifuger brièvement le tube
pendant 10 secondes à 200 x g pour éliminer les gouttes qui
se retrouve dans le couvercle.
Prélever 200 μL de la solution (contenant approximativement
57 µL de sang) et transférer dans un tube propre (p. e. 1,5 mL).
Ajouter 100 μL de tampon de lyse SVL, 100 μL d’eau, 2 μL
de tampon PFN et agiter au vortex pendant 10 à 15 s.
transférer
200 µL de
solution dans
un tube propre
+100 μL SVL
+100 µL eau
+2 µL PFN
Note : le tampon SVL, l’eau et le PFN peuvent être mélangés
pour obtenir un prémix. Pour 10 echantillons, mélanger
1000 µL de SVL, 1000 µL d’eau et 20 µL de PFN.
Ajouter 10 μL de Protéinase K Liquide dans le tube et
mélanger modérément.
Mélanger le tube pendant 10 min à 1 400 rpm (p.e. en utilisant
un Thermomixer Eppendorf) à température ambiante.
+10 µL
Protéinase K
Liquide
Ajouter 2,5 μL de solution de travail d’ARN Carrier
(100 ng/μL) dans le tube.
Mélanger le contenu du tube par vortex ou en pipettant à
plusieurs reprises.
opt. : +2,5 μL
ARN Carrier
Incuber pendant 3 minutes à température ambiante.
Mélanger
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s
à ~ 2.000 x g) pour enlever les gouttes du couvercle
(centrifugation courte seulement).
TA, 3 min
2
Après le prétraitement de l'échantillon, continuer avec la
procédure du protocole standard au chapitre 5.1 et l'étape
2 (page 11) : Ajuster les conditions de fixation (qui consiste à
ajouter de 200 μL d'éthanol).
24
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
~ 1 s,
~ 2,000 x g
ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
6
Protocole FastTrack pour le plasma, le sérum et
les solutions de lavage d’écouvillons
Certains échantillons, comme le plasma, le sérum, les solutions de lavage d’écouvillons et
d’autres fluides biologiques peuvent être traités selon une procédure optimisant la rapidité et la
simplicité du protocole. Cette procédure est dénommée ’FastTrack’. Le rendement en acides
nucléiques pourra cependant être impacté par rapport à la procédure standard.
Pour des échantillons plus complexes ou riches en inhibiteurs, comme le sang, les fèces et les
tissus, nous recommandons de suivre les procédures du chapitre 5.
Avant de débuter la procédure :
•
Pour les échantillons de plasma et de sérum congelés, effectuer, si possible, un seul cycle
de congélation / ​décongélation.
•
Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a bien été préparé selon les recommandations du
chapitre 3.
•
Vérifier que l’ARN Carrier a bien été dissout dans l’eau (solution de travail).
•
La procédure est effectuée à température ambiante.
•
Il n’est pas nécessaire de disposer d’un bloc chauffant.
Préparer le mélange de Protéinase K – ARN Carrier
En fonction du nombre d’échantillons de la série à extraire, préparer un mélange de Protéinase
K Liquide et de solution d’ARN Carrier selon le tableau suivant. Après préparation du mélange,
conserver sur la glace et utiliser dans l’heure.
Nombre de preps
Volume de Protéinase K
Volume d’ARN Carrier
1
10 µL
2,5 µL
2
22 µL
5,5 µL
3
33 µL
8,25 µL
4
44 µL
11 µL
5
55 µL
13,75 µL
6
66 µL
16,5 µL
7
77 µL
19,25 µL
8
88 µL
22 µL
9
99 µL
24,75
10
110 µL
27,5 µL
11
121 µL
30,25 µL
12
132 µL
33 µL
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
25
ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
1
Lyse de l’échantillon
Déposer 12.5 μL de mélange Protéinase K Liquide – ARN Carrier dans un tube
(1.5 mL, fourni).
Ajouter 200 μL d’échantillon dans le tube et mélanger modérément.
Ajouter 200 μL de Tampon de lyse SVL dans le tube.
Agiter le tube pendant 10 min à 1,400 rpm (par ex. sur un Thermoshaker Eppendorf) à
température ambiante.
Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour éliminer les
gouttes du bouchon (centrifugation brève uniquement).
2
Ajuster les conditions de fixation des acides nucléiques
Ajouter 200 μL d’éthanol (96 – 100 %) dans le tube et mélanger en vortexant (10 – 15 s).
Incuber pendant 2 min à température ambiante.
Centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du
bouchon (centrifugation brève uniquement).
3
Fixation des ARN/ADN viraux
Déposer le lysat (environ 610 µL) sur une colonne NucleoSpin® VET.
Centrifuger 1 min à 11,000 x g.
Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un nouveau tube collecteur (2 mL, fourni) et
jeter le tube contenant le filtrat issu de l’étape précédente.
4
Lavage et séchage de la membrane de silice
Ajouter 400 μL de Tampon de lavage SVW1 à la colonne NucleoSpin® VET.
Centrifuger 1 min à 11,000 x g.
Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un nouveau tube collecteur (2 mL, fourni) et
jeter le tube contenant le filtrat issu de l’étape précédente.
Ajouter 200 μL de Tampon de lavage SVW2 à la colonne NucleoSpin® VET.
Centrifuger 1 min à 11,000 x g.
Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un tube d’élution (1.5 mL, fourni) et jeter le tube
collecteur contenant le filtrat issu de l’étape précédente.
5
Elution de l’ARN/ADN
Ajouter 100 μL d’H2O RNase-free sur la membrane de silice.
Incuber 1 min à TA.
Centrifuger 1 min à 11,000 x g.
Conserver l’ARN / ​ADN élué sur la glace ou congeler pour le stockage.
26
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
7
Annexes
7.1
Optimisation des performances
Problème
Causes possibles et suggestions
Problèmes avec l’ARN Carrier
Rendement
en acides
nucléiques
viraux faible
ou nul
•
Omission de l’ARN Carrier.
Acides nucléiques viraux dégradés
•
Les échantillons doivent être traités immédiatement. Veiller à bien
conserver les échantillons avant de les traiter.
•
Vérifier que les tampons ont été préparés et conservés correctement.
En cas de doute, utiliser un nouvel aliquot de Tampon SVL, d’ARN
Carrier et d’H2O RNase-free.
Sensibilité réduite
•
Changer le volume d’éluat ajouter dans les réactions PCR / ​RT-PCR.
Contamination par de l’éthanol
Problèmes de
détection
•
•
Problèmes
généraux
7.2
Prolonger la centrifugation pour éliminer le Tampon SVW2 totalement
Interférence de l’ARN Carrier avec la méthode de détection
Vérifier que l’ARN Carrier est compatible avec la méthode de détection.
Certaines méthodes peuvent ne tolérer qu’une quantité limitée d’ARN
Carrier.
Colmatage de la membrane
•
Centrifuger les lysats de plasma avant l’ajout d’éthanol et le dépôt sur
les colonnes NucleoSpin® VET.
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoSpin® VET
740842.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
NucleoMag® VET
744200.1 / ​.4
1 × 96 / ​4 × 96
Collection Tubes (2 mL)
740600
1000
MN Bead Tubes Type D
740814.50
pack of 50
Buffer PFN
740121.5
5 mL
NucleoProtect® Vet stabilization
and inactivation reagent
740750.50
740750.500
50 mL
500 mL
NucleoProtect® VET Blood Tubes
740755
50
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
27
ADN / ​ARN Viral et ADN Bactérien
Produit
REF
Conditionnement
Bouchons d’étanchéité
complémentaires pour
NucleoProtect® VET Blood Tubes
740756
100
NucleoProtect® VET Swab Tubes
740760
50
Bouchons d’étanchéité
complémentaires pour
NucleoProtect® VET Swab Tubes
740761
100
Visitez notre site web www.mn‑net.com pour des informations détaillées.
7.3
Restrictions d’utilisation / garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications
et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du
produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et
descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne
font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société.
MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez
contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur
les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour
obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la
documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
Veuillez contacter :
MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Tel. : +49 24 21 969‑333
[email protected]
28
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02
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Valencienner Str. 11
52355 Düren · Germany
DE
CH
FR
US
Tel.: +49 24 21 969-0
Tel.: +41 62 388 55 00
Tel.: +33 388 68 22 68
Tel.: +1 888 321 62 24
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
A0xxxx

Fonctionnalités clés

  • Technologie à membrane de silice
  • Mini colonnes spin
  • Protocoles optimisés pour différents échantillons
  • Purification rapide
  • Acides nucléiques hautement purifiés
  • Compatible avec PCR et RT-PCR
  • Faible risque de contamination

Manuels associés

Réponses et questions fréquentes

Quels sont les types d'échantillons compatibles avec le kit NucleoSpin VET ?
Le kit NucleoSpin VET est compatible avec une variété d'échantillons vétérinaires, notamment le plasma, le sérum, les fluides biologiques acellulaires, le sang, les tissus, les écouvillons secs/humides et les fèces.
Quels sont les types d'acides nucléiques que l'on peut extraire avec le NucleoSpin VET ?
Le kit NucleoSpin VET permet d'extraire les virus à ARN simple/double brin, les virus à ADN simple/double brin et l'ADN bactérien.
Quelle est la taille des fragments d'acides nucléiques extraits par le kit NucleoSpin VET ?
La taille des fragments d'acides nucléiques extraits par le kit NucleoSpin VET est d'environ 100 bp – 50 kb.
Le NucleoSpin VET est-il compatible avec les applications de séquençage de l'ADN ?
Oui, les acides nucléiques purifiés par le NucleoSpin VET sont compatibles avec les applications de séquençage de l'ADN par fluorescence automatisé.