Macherey-Nagel NucleoMag VET kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
Moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d'utilisation
Purification ARN/ADN Viral
n NucleoMag® VET
Février 2024 / Rev. 11
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Purification ARN/ADN Viral
Sommaire
1 Composition
4
1.1 Composants du kit
4
1.2 Matériels à fournir par l’utilisateur
5
1.3 A propos de ce manuel d’utilisation
5
2 Description
6
2.1 Principe général
6
2.2 Caractéristiques du kit
6
2.3 Systèmes de séparation magnétique
7
2.4 Réglage des paramètres d’agitation
8
2.5 Manipulation des billes
9
2.6 Procédures d’élution
9
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
4 Instructions de sécurité
4.1 Élimination des déchets
10
11
11
5 Préparation des échantillons biologiques
12
6 Protocoles pour une utilisation manuelle ou sur un robot pipeteur
14
6.1 Purification d’ARN/ADN viral et d’ADN bactérien à partir de sang, de
tissus homogénéisés, de sérum, de plasma, d’autres liquides corporels,
d’écouvillons et d’écouvillons stabilisés (NucleoProtect® VET-).
14
6.2 Purification de l’ARN/ADN viral à partir d’échantillons de sang stabilisés grâce
au NucleoProtect® VET
19
7 Protocoles pour les systèmes avec des barreaux magnétiques
7.1 Configuration générale des systèmes avec barreaux magnétiques
20
20
7.2 Configuration pour la purification des ARN/ADN viraux à partir d’échantillons
de sang stabilisés grâce au NucleoProtect® VET
22
7.3 Protocole détaillée pour KingFisher™ Flex
8 Protocoles complémentaires
8.1 Purification du virus à ARN (PRRSV) d’échantillon de sperme porcin
9 Annexes
23
25
25
26
9.1 Guide de résolution de problèmes
26
9.2 Informations de commande
28
9.3 Restrictions d’utilisation / ​garantie
29
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
3
Purification ARN/ADN Viral
1
Composition
1.1
Composants du kit
NucleoMag® VET
1 × 96 preps
744200.1
4 × 96 preps
744200.4
100 × 96 preps
744200.100
Billes NucleoMag®
B-Beads
2 × 1.25 mL
10 mL
22 × 10 mL
Tampon de Lyse VL1
30 mL
100 mL
4 × 500 mL
Tampon de Fixation
VEB
110 mL
3 × 110 mL
7 × 1000 mL
Tampon de Lavage
VEW1
75 mL
300 mL
7 × 1000 mL
Tampon de Lavage
VEW2
75 mL
300 mL
7 × 1000 mL
Tampon d’Elution VEL
30 mL
125 mL
3 × 500 mL
ARN Carrier*
400 μg
4 × 400 μg
85 × 400 μg
Tampon ARN Carrier
500 μL
4 × 500 μL
3 × 15 mL
Protéinase K
(lyophilisée)*
75 mg
3 × 75 mg
65 × 75 mg
Tampon Protéinase PB
8 mL
15 mL
18 × 15 mL
Résumé du protocole
1
1
1
REF
* Pour la préparation des réactifs et des conditions de stockage, voir le chapitre 3.
4
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
Purification ARN/ADN Viral
1.2
Matériels à fournir par l’utilisateur
Produit
REF
Conditionnement
Blocs pour la séparation magnétique des billes,
740481
740481.24
4
24
Ex : Blocs 96 puits carré (’Square-well Block’,
2.1 mL)
Tubes de lyse pour la lyse et l’incubation des 740477
740477.24
échantillons,
4 sets
24 sets
Ex : Rack de barrettes de tubes ’Tube Strips’
(1 set comprend 1 support, 12 barrettes de 8
tubes chacun (1.2 mL par puits) et 12 barrettes de
bouchons)
Plaque d’élution pour la collecte des acides 740486.24
nucléiques,
24
Ex : Plaque d’élution ’fond en U’ (microplaques 96
puits de 300 μL à fond rond)
Ex : Plaque d’élution ’fond plat’ (microplaques 96
puits de 300 μL à fond plat)
740673
Consommables pour automate KingFisher™ 744950
Flex :
20
1 set
Ex : Set d’accessoires ’96-well Accessory Kit A’
pour automate KingFisher™
(Square-well Blocks, Deep-well Tip Combs,
plaques d’élution pour 4 × 96 preps NucleoMag®
VET)
Réactifs:
•
Ethanol 80 %
1.3
A propos de ce manuel d’utilisation
Il est recommandé de lire attentivement les instructions de ce manuel avant d’utiliser le
kit. Toute la documentation technique est également disponible sur Internet à l’adresse
suivante : www.mn net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes ou mises
à jour.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
5
Purification ARN/ADN Viral
2
Description
2.1
Principe général
Le kit NucleoMag® VET est conçu pour la purification d’ADN ou d’ARN viral et d’ADN
bactérien à partir de fluides corporels exempts de cellules, tels que le sérum ou le
plasma, d’écouvillon, de sang ou d’échantillons provenant de suspensions de tissus
homogénéisés. Ce kit fournit des réactifs et des billes magnétiques pour la purification
de 96 échantillons de 100 à 200 μL. La procédure est basée sur l’adsorption réversible
des acides nucléiques sur les billes paramagnétiques dans des conditions tampons
appropriées. La lyse des échantillons est réalisée par incubation avec un tampon de lyse
VL1 contenant des ions chaotropiques, soutenu par une digestion à la Protéinase K. Pour
la fixation des acides nucléiques sur les billes paramagnétiques, le tampon de fixation VEB
et les billes NucleoMag® B Beads sont ajoutés au lysat. Après la séparation magnétique,
les billes paramagnétiques sont lavées pour éliminer les contaminants et les sels à l’aide
des tampons de lavage VEW1 et VEW2 et d’éthanol à 80 %. L’éthanol résiduel des étapes
de lavage précédentes est éliminé par séchage à l’air. Enfin, l’ARN/ADN viral ultrapur est
élué avec le tampon d’élution VEL à faible teneur en sel ou avec de l’eau. L’ARN / ​ADN viral
purifié peut être directement utilisé pour des applications en aval. Le kit NucleoMag® VET
peut être utilisé manuellement ou automatiquement sur des instruments de manipulation
de liquide standard ou des séparateurs magnétiques automatisés.
2.2
Caractéristiques du kit
Le kit NucleoMag® VET est conçu pour la préparation rapide, manuelle et automatisée à
petite échelle d’ARN / ​ADN viral à partir de fluides corporels acellulaires comme le sérum
ou le plasma, de sang, de suspensions de tissus homogénéisés ou d’échantillons tels
que décrits dans le chapitre 5. Le kit est conçu pour être utilisé avec un bloc pour la
séparation magnétique des billes NucleoMag® SEP (voir les informations de commande)
ou d’autres systèmes de séparation magnétique (voir le paragraphe 2.3). Le temps pour
la préparation manuelle de 96 échantillons est d’environ 120 minutes. L’ARN / ​ADN purifié
peut être utilisé directement comme matrice pour la RT-PCR, la PCR ou tout autre type
de réaction enzymatique.
Le kit NucleoMag® VET permet une automatisation facile sur des robots pipeteurs
courants ou sur des séparateurs magnétiques automatisés. Le temps de traitement réel
dépend de la configuration de l’instrument et du système de séparation magnétique
utilisé. Typiquement, 96 échantillons peuvent être purifiés en moins de 120 minutes en
utilisant le NucleoMag® SEP installé sur un robot pipeteur.
Le kit NucleoMag® VET est destiné à des professionnels tels que les techniciens et les
médecins expérimentés qui sont formés aux techniques de biologie moléculaire ainsi qu’à
l’utilisation d’écouvillons et d’autres échantillons vétérinaires potentiellement infectieux. Le
produit est destiné uniquement à la recherche.
6
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
Purification ARN/ADN Viral
2.3
Systèmes de séparation magnétique
Pour le kit NucleoMag® VET, nous recommandons l’utilisation du séparateur magnétique
NucleoMag® SEP. Les étapes de séparation sont effectuées dans un bloc 96 puits carrés
(voir ’Informations de commandes’ paragraphe 6.2). Le kit est aussi utilisable sur d’autres
séparateurs magnétiques combinés aux consommables adéquats.
Séparateur magnétique
®
Plaque ou tubes de séparation
NucleoMag SEP (MN REF 744900)
Blocs à puits carré ’Square-well Block’
(MN REF 740481)
Tecan Te-MagS™
Tubes de 1.5 mL sans bouchons
(Sarstedt)
Séparateurs à aimants fixes
Les séparateurs à aimants fixes, comme le NucleoMag® SEP (utilisable manuellement
ou sur automates pipeteurs), sont recommandés en association avec un agitateur pour
plaques permettant une resuspension optimale des billes pendant les étapes de lavages
et d’élution. Alternativement, les billes peuvent être resuspendues dans les tampons par
plusieurs cycles de pipetage. Pour automatiser totalement la procédure sur un robot
pipeteur, un bras manipulateur de plaques est nécessaire, afin de transférer la plaque du
séparateur magnétique vers l’agitateur pour la resuspension des billes.
Système à aimants mobiles
Ces séparateurs disposent d’aimants se déplaçant d’un côté à l’autre des puits, entraînant
les billes à travers les tampons. La séparation magnétique a lieu lors de l’arrêt du système.
Séparateurs magnétiques automatisés
Ces séparateurs possèdent des aimants mobiles, permettant de resuspendre les billes.
Après chaque étape de fixation, de lavage ou d’élution, les billes sont collectées et
transférées automatiquement dans le réactif correspondant à l’étape suivante.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
7
Purification ARN/ADN Viral
2.4
Réglage des paramètres d’agitation
Lors de l’utilisation d’un agitateur pour plaques pour les étapes de lavages et d’élution,
la vitesse d’agitation doit être rigoureusement ajustée afin de permettre la resuspension
optimale des billes sans risque de contaminations croisées. Procéder ainsi :
Réglage de l’agitation pour les étapes de lavages :
•
Déposer 600 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer
la plaque sur l’agitateur et démarrer l’agitation à vitesse modérée pendant 30
secondes. Stopper l’agitateur et vérifier l’absence de projections.
•
Augmenter la vitesse, agiter pendant 30 secondes et vérifier à nouveau l’absence de
projections.
•
Continuer ainsi en augmentant la vitesse jusqu’à voir apparaitre des projections en
haut de la plaque de séparation. Réduire la vitesse, vérifier à nouveau l’absence de
projections et déterminer la vitesse idéale pour les étapes de lavage.
Réglage de l’agitation pour l’étape d’élution
•
Déposer 100 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque d’élution et procéder
comme mentionné ci-dessus.
8
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
Purification ARN/ADN Viral
2.5
Manipulation des billes
Distribution des billes
Une distribution homogène des billes magnétiques dans les puits de la plaque de
séparation est essentielle afin de garantir la reproductibilité d’un puits à l’autre. Ainsi,
avant de pipeter les billes, veiller à leur total resuspension. Secouer ou vortexer le flacon
de stockage des billes. Mélanger au préalable les billes avec le tampon de fixation permet
aussi une distribution plus aisée des billes dans les puits de la plaque de séparation. Lors
de la procédure automatisée, une étape de mélange avant l’aspiration / ​distribution des
billes est recommandée afin de remettre en suspension les billes.
Temps de séparation magnétique
L’attraction des billes magnétiques par les aimants dépend de la force de ceux-ci, de la
plaque de séparation utilisée, de la distance entre la plaque et les aimants et du volume
contenu dans les puits. La durée nécessaire à une séparation complète des billes par les
aimants doit être vérifiée pour chaque système. Il est recommandé d’utiliser les plaques
ou tubes de séparation recommandés par le fournisseur du séparateur magnétique.
Lavage des billes
Le lavage des billes peut s’effectuer par agitation ou pipetage des billes. Contrairement
au pipetage, l’agitation permet de resuspendre les billes dans la totalité des puits
simultanément. Ceci réduit le temps de la procédure et la consommation de cônes. La
resuspension des billes par pipetage est cependant plus efficace que l’agitation de la
plaque de séparation ou le mélange par mise en mouvement des aimants.
Efficacité de
resuspension
Rapidité
Consommation de
cônes
Mélange
magnétique
+
++
Faible
Agitateur
++
++
Faible
Pipetage
+++
+*
Elevée
Méthode
2.6
Procédures d’élution
L’ARN/ADN viral purifié peut être élué directement avec le tampon d’élution VEL fourni.
L’élution peut être effectuée dans un volume ≥ 50 μL. Il est essentiel de recouvrir
complètement les billes NucleoMag® Beads avec le tampon d’élution pendant l’étape
d’élution. Le volume de tampon d’élution distribué dépend du système de séparation
magnétique (par exemple, la position du culot à l’intérieur de la plaque de séparation).
Pour une élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être entièrement remis en
suspension dans le tampon d’élution. Pour certains séparateurs, des volumes d’élution
élevés peuvent être nécessaires pour recouvrir la totalité du culot.
+ : acceptable, ++ : bon, +++ : excellent, *pipette 8-canaux
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
9
Purification ARN/ADN Viral
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention:
VL1, VEB, VEW1, VEW2, le tampon ARN Carrier, les tubes NucleoProtect® VET Blood / ​
Swab ainsi que le réactif NucleoProtect® VET contiennent des sels chaotropiques (par
ex. chlorhydrate de guanidine, thiocyanate de guanidine et/ou perchlorate de sodium)
qui peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de
Javel (hypochlorite de sodium) ! NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides
directement aux déchets de préparation d’échantillons. Porter des équipements de
protection appropriés, des gants et des lunettes de protection !
•
Tous les composants du kit NucleoMag® VET doivent être conservés à une
température comprise entre 15 et 25 °C et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du
kit.
•
Tous les tampons sont livrés prêts à l’emploi.
Le tampon VIA, nécessaire au traitement des échantillons de sang stabilisés par du
NucleoProtect® VET, peut former des précipités pendant le stockage. Vérifier l’absence de
précipités dans le tampon VIA et incuber à 25 – 30 °C pendant environ 30 minutes pour
redissoudre tout précipité. Agiter doucement le flacon jusqu’à l’obtention d’une solution
homogène.
Avant de commencer un protocole NucleoMag® VET, préparer les réactifs suivants :
•
Protéinase K : Avant la première utilisation du kit, ajouter 3,35 mL de tampon
protéinase PB à chaque flacon de protéinase K lyophilisée. La solution de
protéinase K dissoute doit être conservée en aliquotes à -20 °C.
•
ARN Carrier : Avant la première utilisation du kit, ajouter 500 μL de tampon d’ARN
Carrier à chaque flacon d’ARN Carrier lyophilisé. Conserver la solution d’ARN
Carrier dissoute dans des aliquotes à -20 °C.
Remarque : en raison de la procédure de production et de la faible quantité d’ARN Carrier
contenue dans le flacon, l’ARN Carrier est difficilement visible.
NucleoMag®VET
REF
1 × 96 preps
744200.1
4 × 96 preps
744200.4
100 × 96 preps
744200.100
Protéinase K
(lyophilisée)
1 tube (75 mg)
3 tubes (75 mg / tube)
Ajouter 3.35 mL de
Ajouter 3.35 mL de
tampon
tampon Protéinase PB
Protéinase PB
dans chaque tube
65 tubes (75 mg / tube)
Ajouter 3.35 mL de
tampon Protéinase PB
dans chaque tube
ARN Carrier
(lyophilisée)
1 tube (400 μg)
Ajouter 500 μL
de tampon ARN
Carrier
85 tubes (400 μg / vial)
Ajouter 500 μL
de tampon ARN Carrier
dans chaque tube
10
4 tubes (400 μg / vial)
Ajouter 500 μL
de tampon ARN
Carrier dans chaque
tube
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
Purification ARN/ADN Viral
4
Instructions de sécurité
Lors de l’utilisation du kit NucleoMag® VET, porter des équipements de protection
individuelle (ex : blouse, gants jetables et lunettes de protection). Pour plus d’informations,
consulter les Fiche de Données de Sécurités correspondantes (FDS disponibles en ligne :
www.mn-net.com/msds).
Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon de lyse VL1, le perchlorate de
sodium dans les tampons VEB, VEW1, VEW2 et le thiocyanate de guanidine dans le
tampon ARN Carrier, les tubes NucleoProtect® VET Blood / ​Swab ainsi que le réactif
NucleoProtect® VET peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils sont combinés
avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, il ne faut pas ajouter d’eau de Javel ou de
solutions acides directement aux déchets de préparation d’échantillons.
La capacité d’inactivation du réactif NucleoProtect® VET a été démontrée pour diverses
matrices et virus connus pour avoir des structures d’enveloppe ainsi que des sensibilités
différentes aux désinfectants : FMDV (petit virus non enveloppé), BTV-5 (grand virus non
enveloppé), LSDV (grand virus enveloppé), PPRV et BCoV (virus enveloppé). Aucune
revendication d’inactivation d’autres virus ou matrices ne peut être faite. Les échantillons
doivent être incubés pendant au moins 30 minutes pour une inactivation complète.
Les déchets générés par le kit NucleoMag® VET n’ont pas été testés pour détecter la
présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du
matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison de la forte dénaturation
du tampon de lyse et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement
exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et
doivent être manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Élimination des déchets
Eliminer le matériel dangereux, infectieux ou contaminé biologiquement de manière sûre
et en accord avec les règlementations locales.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
11
Purification ARN/ADN Viral
5
Préparation des échantillons biologiques
a) Echantillons de sang et de sérum / ​plasma
Un volume d’échantillon de 100 – 200 μL de sang peut être utilisé. Ne pas utiliser des
volumes plus importants. Pour des échantillons avec des volumes inférieurs à 200 µL,
ajuster à 200 µL avec du tampon PBS.
b) Echantillons de sang stabilisés avec le réactif NucleoProtect® VET
Vortexer le tube NucleoProtect® VET Blood Tube ou le tube contenant un échantillon
de sang stabilisé dans le réactif NucleoProtect® VET Reagent pendant 30 secondes.
Centrifuger brièvement le tube pendant 10 secondes à 200 x g pour éliminer les gouttes
qui se forment à l’intérieur du bouchon. Transférer 200 µL d’échantillon de sang stabilisé.
Optionnel : refermer le tube NucleoProtect® VET Blood Tube avec un bouchon de
fermeture complémentaire (voir les informations de commande).
c) Echantillons de tissues
Homogénéiser les échantillons de tissus. Typiquement, 5 à 10 mg d’échantillon peuvent
être homogénéisés dans 400 μL de tampon PBS à l’aide d’un broyeur à billes. Si
nécessaire, des quantités plus importantes d’échantillons peuvent être utilisées (jusqu’à
25 mg). Il faut tenir compte du fait que l’acide nucléique total copurifié peut provoquer
une inhibition dans les essais PCR ultérieurs. Après homogénéisation du tissu, centrifuger
et utiliser jusqu’à 200 μL de surnageant clarifié pour le protocole de purification. Si vous
utilisez moins de 200 μL, ajuster avec du tampon PBS pour obtenir un volume final de
200 μL.
Pour la purification de l’ARN viral :
Les échantillons de tissus peuvent également être broyés dans un tampon contenant
du sel chaotropique (par exemple, le tampon RA1, voir les informations de commande)
et du bêta-mercaptoéthanol ou de l’agent réducteur TCEP (voir les informations de
commande).
d) Écouvillons / ​écouvillons stabilisés avec du NucleoProtect® VET
Incuber les écouvillons avec du PBS, du chlorure de sodium ou du milieu de culture
cellulaire pendant 30 minutes en agitant. Retirer et presser l’écouvillon. Poursuivre la
procédure de purification avec 200 μL de tampon sans particules ou du milieu.
Vortexer soigneusement le tube NucleoProtect® VET Swab Tube ou le tube contenant un
échantillon d’écouvillon stabilisé dans le réactif NucleoProtect® VET Reagent pendant 30
secondes. Centrifuger brièvement le tube pendant 10 secondes à 200 x g pour éliminer
les gouttes qui se forment à l’intérieur du bouchon. Poursuivre la procédure avec 200 µL
d’échantillon provenant de l’écouvillon stabilisé.
12
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
NucleoMag® VET
e) Fèces
Mélanger 1 volume de fèces (par exemple, 500 μL) avec un volume égal de tampon PBS.
Mélanger vigoureusement au vortex pendant 1 minute. Laisser les particules se déposer
ou centrifuger à faible vitesse (par exemple, à 500 x g). Pour les bactéries difficiles à lyser,
il peut être nécessaire de procéder à un broyage mécanique (par exemple, traitement
à l’aide de billes de verre appropriées). Prélever le surnageant et utiliser 200 μL pour le
protocole de purification.
f) Lyse au TRIzol®
Pour les échantillons tels que le sperme, une lyse TRIzol® peut être nécessaire.
Homogénéiser 10 – 30 mg de tissu ou jusqu’à 250 μL de sang avec 1 mL de réactif
TRIzol® selon les instructions du fabricant. Après séparation des phases par centrifugation,
prélever la phase (supérieure) aqueuse et incolore soit environ 400 μL. Pour la suite du
traitement, commencer par l’étape 2 du protocole de purification en mélangeant 400 μL
de la phase aqueuse avec 600 μL de tampon VEB et 20 μL de billes NucleoMag® B.
g) Echantillons de lait
Un volume d’échantillon supérieur à 200 µL est généralement utilisé. Typiquement, 1 mL
d’un échantillon de lait normal est centrifugé (par exemple, 11 000 x g pendant 3 minutes).
Jeter le surnageant et remettre le culot en suspension dans 400 µL de PBS. Procéder
avec 200 µL d’échantillon pour le protocole de purification.
Les échantillons de lait fermenté (acidulé) nécessitent une étape de prétraitement
supplémentaire. Par conséquent, incuber les particules / ​les morceaux de lait acidulé dans
une quantité appropriée de tampon de lyse pendant 1 à 3 heures à 56 °C (idéalement en
agitant). Culoter les particules résiduelles et procéder avec 400 µL du lysat à l’étape 2 du
protocole de purification.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
13
NucleoMag® VET
6
Protocoles pour une utilisation manuelle ou sur
un robot pipeteur
6.1
Purification d’ARN/ADN viral et d’ADN bactérien à partir
de sang, de tissus homogénéisés, de sérum, de plasma,
d’autres liquides corporels, d’écouvillons et d’écouvillons
stabilisés (NucleoProtect® VET-).
Préparation des échantillons
Le protocole standard se rapporte à un volume de 200 μL d’échantillon (homogénéisé).
Pour la préparation de différents échantillons (par exemple, tissus, écouvillons, fèces),
consulter les indications du Chapitre 5.
Résumé du protocole
•
Pour les exigences en matière de matériel, voir le paragraphe 2.3.
•
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir la page 16.
•
Avant de commencer la préparation :
•
Vérifier que la protéinase K et l’ARN Carrier ont été préparés conformément au
Chapitre 3.
1
Lyse de l’échantillon
200 μL échantillon (homogénéisé)
20 μL Protéinase K
4 μL ARN Carrier
180 μL VL1
Mélanger
TA, 15 min
2
Fixation des acides
nucléiques aux billes
NucleoMag® B-Beads
20 μL de B-Beads
600 μL VEB
Mélanger par agitation
pendant 5 – 10 min à TA
(Optionnel: Mélanger par
pipetage répété)
Eliminer le surnageant après
2 min de séparation
14
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
NucleoMag® VET
3
Lavage avec VEW1
Enlever le bloc 96 puits carrés du
NucleoMag® SEP
600 μL VEW1
Resuspendre : Agiter 1 min à TA
Eliminer le surnageant après
2 min de séparation
4
Lavage avec VEW2
Enlever le bloc 96 puits carrés du
NucleoMag® SEP
600 μL VEW2
Resuspendre : Agiter 1 min à TA
Eliminer le surnageant après
2 min de séparation
5
Lavage avec de
l’éthanol 80 %
Enlever le bloc 96 puits carrés du
NucleoMag® SEP
600 μL d’éthanol 80 %
Resuspendre : Agiter 1 min à TA
Eliminer le surnageant après
2 min de séparation
6
Séchage à l’air des
billes magnétiques
7
Elution des ADN / ​ARN
Sécher à l’air 10 min à TA
Enlever le bloc 96 puits carrés du
NucleoMag® SEP
50‑100 μL VEL
Mélanger par agitation
pendant 5 min à TA
(Optionnel: Mélanger par
pipetage)
Séparer 2 min et transférer
l’ARN / ​ADN dans la plaque
d’élution / ​les tubes
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
15
NucleoMag® VET
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants fixes (par exemple,
NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques appropriés. Il est recommandé d’utiliser
un bloc 96 puits carrés pour la séparation (voir les informations de commande, chapitre
6.2). La purification de l’ARN / ​ADN peut également être effectué dans des microtubes
avec des séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation
manuelle et sert de guide pour l’adaptation du kit sur des systèmes automatisés.
1
Lyse de l’échantillon
Distribuer au préalable 20 μL de protéinase K et 200 μL d’échantillon dans un
microtube approprié. Ajouter 180 μL de tampon VL1 au microtube. Optionnel :
ajouter 4 μL de la solution mère d’ARN Carrier au microtube. Bien mélanger par
pipetage répété et incuber à température ambiante pendant 15 min en agitant.
Alternativement, l’étape de lyse peut être réalisée dans des barrettes de tubes
(voir les informations de commande).
Après l’incubation de la lyse, centrifuger pour collecter tout échantillon des
couvercles des tubes de lyse et transférer chaque lysat dans les puits d’un bloc
96 puits carrés.
2
Fixation de l’acide nucléique sur les billes magnétiques
Ajouter 20 μL de billes B-Beads remises en suspension et 600 μL de tampon
VEB à l’échantillon lysé.
Mélanger par pipetage répété 6 fois et agiter pendant 5 min à température
ambiante. Alternativement, lors du traitement du kit sans agitateur, mélanger par
pipetage répété 10 fois et incuber pendant 5 min à température ambiante.
Les billes NucleoMag® B-Beads et le tampon VEB peuvent être mélangés au
préalable.
Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les retirer du
flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une
suspension homogène soit formée.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le bloc 96
puits carrés sur le séparateur magnétique, NucleoMag® SEP. Attendre au moins
2 minutes jusqu’à ce que toutes les billes soient attirées par les aimants. Retirer
et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
Ne pas perturber les billes sur les aimants lors de l’aspiration du surnageant.
16
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
NucleoMag® VET
3
Lavage avec le tampon VEW1
Enlever le bloc 96 puits carrés du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 μL de tampon VEW1 et remettre les billes en suspension en agitant
jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (1 – 3 min).
Alternativement, remettre complètement en suspension les billes par pipetage
répété.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc 96 puits carrés sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 minutes jusqu’à ce que
toutes les billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide
d’une pipette.
4
Lavage avec le tampon VEW2
Enlever le bloc 96 puits carrés du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 μL de tampon VEW2 et remettre les billes en suspension en agitant
jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (1 – 3 min).
Alternativement, remettre complètement en suspension les billes par pipetage
répété.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc 96 puits carrés sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 minutes jusqu’à ce que
toutes les billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide
d’une pipette.
5
Lavage avec l’éthanol 80 %
Enlever le bloc 96 puits carrés du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 μL d’éthanol à 80 % et remettre les billes en suspension en agitant
jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (1 – 3 min).
Alternativement, remettre en suspension les billes complètement par pipetage
répété.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc 96 puits carrés sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 minutes jusqu’à ce que
toutes les billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide
d’une pipette.
6
Séchage à l’air des billes magnétiques
Sécher à l’air le culot de billes magnétiques pendant 10 minutes à température
ambiante.
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NucleoMag® VET
7
Élution de l’ARN/ADN
Retirer le bloc 96 puits carrés du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter le volume souhaité de tampon VEL (50 – 100 μL) dans chaque puits du
bloc 96 puits carrés et remettre les billes en suspension en agitant pendant 5 min
à température ambiante. Alternativement, remettre les billes complètement en
suspension par pipetage répété et incuber pendant 5 min à 56 °C.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc 96 puits carrés sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes
les billes soient attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant les
acides nucléiques purifiés dans des plaques d’élution ou des barrettes de tubes
(voir les informations de commande).
18
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
NucleoMag® VET
6.2
Purification de l’ARN/ADN viral à partir d’échantillons de
sang stabilisés grâce au NucleoProtect® VET
Protocole pour la purification de l’ARN et de l’ADN viral à partir de tubes NucleoProtect®
VET Blood Tube ou d’échantillons de sang stabilisés dans le réactif NucleoProtect® VET
Reagent.
Pour la préparation des échantillons de sang stabilisés, voir le chapitre 5.
Note : Les purifications d’acide nucléique à partir d’échantillons de sang stabilisés et non
stabilisés par du NucleoProtect® VET peuvent être effectuées en parallèle. La modification
du protocole pour les échantillons de sang stabilisé se limite à la lyse de l’échantillon et à
l’ajustement des conditions de fixation.
Résumé du protocole
Pour les exigences en terme de matériel, voir le chapitre 2.3.
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 16.
Avant de commencer la préparation :
Pour le traitement des échantillons de sang stabilisés par NucleoProtect® VET, un tampon
VIA supplémentaire est nécessaire (REF 744206, voir les informations de commande).
Vérifier l’absence de précipités dans le tampon VIA, voir chapitre 3.
1
Lyse de l’échantillon
200 μL de sang stabilisé
350 µL VIA
20 μL Protéinase K
Mélanger
TA, 15 min
2
Fixation des acides
nucléiques aux
billes NucleoMag®
B-Beads
20 μL B-Beads
450 μL VEB
Mélanger par agitation
pendant 5 – 10 min à TA
( optionnel : Mélanger par pipetage répété)
Eliminer le surnageant après 2 min de séparation
3
Lavage avec VEW1
Procéder à l’étape 3 du protocole standard du chapitre
6.1
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
19
Purification ARN/ADN Viral
7
Protocoles pour les systèmes avec des barreaux
magnétiques
Ces protocoles sont conçus pour l’utilisation du kit NucleoMag® VET sur des systèmes
de barreaux magnétiques (par exemple, les systèmes KingFisher™, MagnetaPure 32 / ​32
Plus ou d’autres instruments avec des barreaux magnétiques).
Pour des informations détaillées concernant chaque étape, voir la page 16.
Contacter notre support technique Bioanalyse (tech-bio@mn net.com) pour obtenir
des fichiers de méthodes ou des informations plus détaillées sur des plateformes
d’automatisation spécifiques.
7.1
Configuration générale des systèmes avec barreaux
magnétiques
Cette synthèse sert de guide pour la configuration générale des plaques, des colonnes ou
des réservoirs de réactifs de l’instrument respectif pour le kit NucleoMag® VET.
Selon l’instrument, la lyse de l’échantillon peut être effectuée sur l’instrument ou à
l’extérieur.
Les positions peuvent représenter différents formats définis par le protocole et l’instrument
(par exemple, des plaques complètes (dispositifs au format 96 puits), des rangées
individuelles (format de 12 puits), des colonnes individuelles (format de 8 puits), des puits
individuels ou systèmes basés sur des cartouches).
Lyse externe - la lyse n’est pas effectuée sur l’instrument lui-même (pour
les échantillons qui nécessitent une manipulation avancée ou une clarification par
centrifugation)
Position
Etape
Tampon
Volume
1
Lyse / ​Fixation
Lysat*
404 µL
B-Beads
20 µL
VEB
575 µL
2
Lavage 1
VEW1
600 µL
3
Lavage 2
VEW2
600 µL
4
Lavage 3
Ethanol 80 %
600 µL
5
Elution
VEL
100 µL
* Comprend 200 µL d’échantillon, 180 µL de tampon VL1, 20 µL de protéinase K et 4 µL d’ARN Carrier.
20
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
Purification ARN/ADN Viral
Lyse On-deck (sur le robot) - la lyse est effectuée sur l’instrument ; pour les
échantillons liquides ou entièrement homogénéisés.
Position
Etape
Tampon
Volume
1
Lyse
Echantillon
200 µL
Protéinase K
20 µL
VL1
180 µL
ARN Carrier
4 µL
Fixation
B-Beads
20 µL
[à ajouter après la lyse]
VEB
575 µL
2
Lavage 1
VEW1
600 µL
3
Lavage 2
VEW2
600 µL
4
Lavage 3
Ethanol 80 %
600 µL
5
Elution
VEL
100 µL
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
21
Purification ARN/ADN Viral
7.2
Configuration pour la purification des ARN/ADN viraux
à partir d’échantillons de sang stabilisés grâce au
NucleoProtect® VET
Purification des ARN/ADN viraux à partir de tubes de sang NucleoProtect® VET Blood
Tubes ou de sang stabilisé avec le NucleoProtect® VET Reagent.
Note : la purification d’acide nucléique à partir d’échantillons de sang stabilisés et d’autres
échantillons peut être effectuée au cours du même cycle d’extraction. La modification du
protocole pour les échantillons de sang stabilisé se limite à la lyse de l’échantillon et à
l’ajustement des conditions de fixation.
Avant de commencer la préparation :
•
Vérifier que la protéinase K a été préparée conformément au chapitre 3.
Pour le traitement des échantillons de sang stabilisé avec le NucleoProtect® VET, un
tampon VIA supplémentaire est nécessaire (REF 744206, voir les informations de
commande au chapitre 9.2). Vérifier l’absence de précipités dans le tampon VIA, voir
chapitre 3.
Lyse On-deck (sur le robot) - la lyse est effectuée sur l’instrument ; pour les échantillons
liquides ou entièrement homogénéisés.
Position
Etape
Tampon
Volume
1
Lyse
Echantillon
200 µL
VIA
330 µL
Protéinase K
20 µL
Fixation
B-Beads
20 µL
[Ajout après la lyse]
VEB
425 µL
2
Lavage 1
VEW1
600 µL
3
Lavage 2
VEW2
600 µL
4
Lavage 3
Ethanol 80 %
600 µL
5
Elution
VEL
100 µL
22
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
Purification ARN/ADN Viral
7.3
Protocole détaillée pour KingFisher™ Flex
Note : Le fichier de méthode requis ’NucleoMag®_VET_lyse_Flex’ ou d’autres fichiers de
méthode pour l’instrument sont disponibles auprès du support technique Bioanalysis
(tech-bio@mn net.com).
Important : Toujours préparer le bloc 96 puits profonds avec les échantillons en premier et
ajouter les réactifs exactement dans l’ordre indiqué ci-dessous.
•
Avant de commencer la préparation :
•
Vérifier que la protéinase K et l’ARN Carrier ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Kit d’accessoires A Blocs 96 puits pour KingFisher™ (voir les informations de
commande)
1
Préparation de l’échantillon / ​plaque de lyse (partie I)
Distribuer 20 μL de solution de protéinase K dans chaque puits du bloc 96
puits profonds. Ajouter 200 μL d’échantillon de sang / ​échantillon de tissu
homogénéisé à chaque puits du bloc 96 puits profonds, mélanger par pipetage
répété. Ajouter 180 μL de tampon VL1 et mélanger par pipetage répété 3 fois.
Optionnel : Agiter à 1 000 rpm pendant 15 min à température ambiante.
Poursuivre par la préparation des plaques de lavage et d’élution avant d’ajouter
les billes magnétiques et le tampon de fixation à la plaque d’échantillons.
2
Préparation des plaques de lavage et d’élution
Plaques de lavage :
Remplir 600 μL de tampon VEW1 dans chaque puits d’une plaque 96 Deep well
Thermo vide.
Remplir 600 μL de tampon VEW2 dans chaque puits d’une plaque 96 Deep well
Thermo vide.
Remplir 600 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits d’une plaque 96 Deep well
Thermo vide.
Plaque d’élution :
Remplir 100 μL de tampon VEL dans chaque puits d’une plaque 96 200 µL-well
Thermo vide.
3
Préparation de l’échantillon / ​de la plaque de lyse (partie II)
Ajouter 20 μL de B-Beads et 575 µL de tampon VEB dans chaque puits de la
plaque d’échantillon / ​de lyse.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
23
Purification ARN/ADN Viral
4
Exécuter le protocole de purification sur l’instrument
Démarrer la purification des acides nucléiques sur l’instrument KingFisher™ Flex.
Démarrer le fichier de méthode ’NucleoMag® VET’.
Insérer les plaques comme indiqué sur l’écran de l’instrument KingFisher™.
La méthode commence par une étape de mélange (étape combinée de lyse et de
fixation) après la mise en place de la dernière plaque sur l’instrument.
5
Retirer les acides nucléiques élués
L’instrument s’arrête après l’étape d’élution finale. Suivre les instructions sur
l’écran de l’instrument et sortir les plaques de l’instrument.
L’ARN / ​ADN purifié peut être utilisé pour d’autres analyses comme la PCR.
24
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
Purification ARN/ADN Viral
8
Protocoles complémentaires
8.1
Purification du virus à ARN (PRRSV) d’échantillon de
sperme porcin
Avant de commencer la préparation :
•
1
Le tampon de lyse RA1 additionnel est nécessaire (voir information de commande
9.2).
Précipitation
Centrifuger 1 mL d’échantillon de sperme pendant 4 min à 12.000 x g.
Jeter le surnageant après centrifugation.
2
Lyse de l’échantillon
Ajouter 400 µL de tampon de Lyse RA1 et mélanger en pipetant.
Incuber pendant 10 min à 70° C.
3
Clarifier le lysat
Centrifuger l’échantillon lysé pendant 1 min. à 15.000 x g
Utiliser 400 μL du lysat clarifié et passer à l’étape 2 du protocole standard, voir
chapitre 6.2.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
25
Purification ARN/ADN Viral
9
Annexes
9.1
Guide de résolution de problèmes
Problèmes
Causes possible et suggestions
Volume de tampon d’élution insuffisant
•
Les billes doivent être recouvertes totalement par le tampon.
Performance insuffisante du tampon d’élution
•
Faible
rendement
Eliminer complètement les tampons résiduels à chaque étape
de séparation. Les tampons résiduels restant diminuent
l’efficacité des lavages et de l’élution.
Billes séchées excessivement
•
Ne pas trop sécher les billes, l’élution en serait impactée.
Aspiration des billes sur l’aimant
•
Ne pas perturber les billes sur l’aimant en aspirant les
surnageants, en particulier lorsque les billes magnétiques sur
l’aimant ne sont pas visibles dans le lysat.
•
Temps de séparation magnétique trop court ou vitesse
d’aspiration trop élevée.
Procédure de lavage insuffisante
Pureté
insuffisante
•
Utiliser des plaques prévues pour le séparateur magnétique, par
exemple les blocs 96 puits carrés ’Square-well Block’ avec le
NucleoMag® SEP.
•
Resuspendre totalement les billes pendant les lavages. Pipeter
plusieurs fois si l’agitation est insuffisante.
Contamination par de l’éthanol des tampons de lavage
•
Mauvaise
performance
de l’ADN lors
des applications
avales
26
Veiller à éliminer l’éthanol 80 % provenant des étapes de lavage,
l’éthanol résiduel impactant négativement les applications
avales.
Évaporation de l’éthanol des tampons de lavage
•
Fermer hermétiquement les flacons de tampons, éviter
l’évaporation de l’éthanol des flacons de tampons ainsi que
des tampons remplis dans les réservoirs. Ne pas réutiliser les
tampons des réservoirs de tampons.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
Purification ARN/ADN Viral
Problèmes
Causes possible et suggestions
Temps de séparation magnétique trop court
•
Perte de billes
Augmenter la durée de la séparation magnétique pour
permettre aux billes d’être attirées par les aimants avant
d’aspirer les liquides.
Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution)
•
Une vitesse d’aspiration trop élevée au cours de l’étape
d’élution peut entraîner l’aspiration de billes. Réduire la vitesse
d’aspiration.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
27
Purification ARN/ADN Viral
9.2
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoMag VET
744200.1
744200.4
744200.100
1 × 96 preps
4 × 96 preps
100 × 96 preps
NucleoProtect® VET stabilization and inactivation
reagent
740750.50
740750.500
50 mL
500 mL
NucleoProtect® VET Blood Tubes
740755
50
Bouchons complémentaires pour les
NucleoProtect® VET Blood Tubes
740756
100
Tampon VIA
744206
150 mL
®
NucleoMag SEP
744900
1
Bloc 96 puits carrés ’Square-well Blocks’
740481
740481.24
4
24
Films adhésifs en PE
740676
50 sheets
Rack de barrettes de tubes ’Tube Strips’
(set comprenant 1 support, 12 barrettes de 8
tubes chacun et 12 barrettes de bouchons)
740477
740477.24
4 sets
24 sets
Plaque d’élution fond en ’U’
740486.24
24
Kit accessoires A 96 puits pour KingFisher™
(le set comprend 16 blocs 96 puits carrés
’Square-well Blocks’, 4 Tip Combs pour Deepwell et 4 plaques d’élution pour 96 preps
NucleoMag® VET pour utilisation avec la
plateforme KingFisher™ Flex)
744950
1 set
Tampon RA1 (60 mL)
740961
60 mL
Agent réducteur TCEP
740395.107
107 mg
NucleoSpin® VET
740842.10
740842.50
740842.250
1 × 10 preps
1 × 50 preps
1 × 250 preps
®
Visitez notre site web www.mn‑net.com pour des informations détaillées.
28
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11
9.3
Restrictions d’utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils
sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description
de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits
MACHEREY NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode
d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du
produit.
Ce produit MACHEREY NAGEL comporte une documentation énonçant les
spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY NAGEL garantit la
conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux
spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale
MACHEREY NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants
de MACHEREY NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées
par un représentant dûment habilité de MACHEREY NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier
et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente
de MACHEREY NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la
société. MACHEREY NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent,
veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus
récentes sur les produits MACHEREY NAGEL. Vous pouvez également contacter votre
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Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
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