Thermo Fisher Scientific VetMAX Peste Mode d'emploi

GUIDE COMPLEMENTAIRE
VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit
Protocoles de purification d'acides nucléiques
En association avec la Référence Catalogue PPRP50
Partie Nº 100021181 Pub. Nº MAN0008852 Rév. B.0
Espèce(s)
Isolation des acides nucléiques à partir des matrices
Test
Petits ruminants
(ovins et caprins)
Sang
Organes
Ecouvillons oculaires et nasaux
Individuel
Sommaire
Purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques ............................................................................... 2
Contenu de ce manuel.................................................................................................................................................................................. 2
Choix des échantillons ................................................................................................................................................................................. 2
Conservation des échantillons ..................................................................................................................................................................... 2
Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fournis dans le kit ............................................................................................................. 3
Protocoles d’extraction de l’ARN ................................................................................................................................................................. 3
Extraction de l’ARN ......................................................................................................................................................... 4
Préparation des échantillons avant extraction ........................................................................................................................................... 4
Extraction avec le QIAamp™ Viral RNA Mini Kit ........................................................................................................................................... 4
Extraction avec le kit NucleoSpin™ RNA Virus ............................................................................................................................................ 5
Extraction avec le RNeasy™ Mini Kit ............................................................................................................................................................ 6
Extraction avec le kit NucleoSpin™ RNA ...................................................................................................................................................... 7
Documentation et support ............................................................................................................................................... 8
Service clientèle et assistance technique ................................................................................................................................................... 8
Garantie produit limitée ............................................................................................................................................................................... 8
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes
de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse
thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques
du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Pour usage en laboratoire.
Purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques
Contenu de ce manuel
Ce manuel a pour objectif de présenter des protocoles de purification des ARN viraux du virus de la Peste des Petits Ruminants
compatibles avec Applied Biosystems™ VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit.
Choix des échantillons
Matrice
Type d’analyse
Quantité requise et matériel de prélèvement
Sang total
Individuelle
100 µL de sang prélevé en tube EDTA
Organe
Individuelle
20 à 30 mg d’organe (poumon, rate, intestin, ganglions lymphatiques)
Ecouvillon nasal et oculaire
Individuelle
Ecouvillon stérile
Conservation des échantillons
Il est nécessaire de s’assurer de la qualité des échantillons avant leur entrée dans le processus analytique.
Sang total
Le sang doit avoir été impérativement prélevé sur tube EDTA. Suite au prélèvement, maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation,
dans un délai maximum de 4 jours après prélèvement. Après utilisation ou passé le délai de 4 jours, congeler en dessous de −16°C
pour conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 an.
Ecouvillons
Suite au prélèvement, maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation, dans un délai maximum de 4 jours après prélèvement.
Après élution de l’écouvillon, utiliser directement l’éluât pour réaliser la PCR. Congeler le reste d’éluât en dessous de −16°C pour
conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 an.
Organes
Suite au prélèvement, selon le cas de figure :
• Si l’analyse est effectuée dans les 24 heures suivant le prélèvement : maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation.
•
Si l’analyse est effectuée au-delà des 24 heures suivant le prélèvement : congeler en dessous de −16°C jusqu’à utilisation.
Dans les deux cas, après utilisation ou passé le délai de 24 heures, congeler en dessous de −16°C pour conservation jusqu’à 1 an ou en
dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 an.
2
VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Guide Complémentaire
Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fournis dans le kit
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.
Matériel et réactifs nécessaires à la préparation des échantillons pour analyse
•
Poste de sécurité microbiologique (PSM) de type II
•
Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre
•
Un vortex ou équivalent
•
Une centrifugeuse pour microtubes de 1.5 mL et 2 mL
•
Balance de précision
•
Microtubes DNase/RNase-free de 1.5 mL et 2 mL
•
Tampon PBS 1X
•
Eau DNase/RNase-free
Kits, réactifs et matériels pour l’extraction et la purification des ARN des échantillons
Tous les matériels et réactifs requis pour la préparation des échantillons pour analyse sont susceptibles d’être utilisés pour cette étape.
S’assurer en plus de disposer des éléments suivants :
• Ethanol 96–100% ou éthanol 70% selon l’extraction réalisée
•
Extraction manuelle sur colonnes de silice en format individuel :
–
QIAamp™ Viral RNA Mini Kit (QIAGEN™) ou NucleoSpin™ RNA Virus (MACHEREY-NAGEL)
–
RNeasy™ Mini Kit + QIAshredder Spin Column (QIAGEN™) ou NucleoSpin™ RNA (MACHEREY-NAGEL)
–
Une centrifugeuse pour microtubes
Protocoles d’extraction de l’ARN
Kits d’extraction recommandés
Sang
Ecouvillons oculaires et nasaux
QIAamp™ Viral RNA Mini Kit
Organes et tissus (poumon, rate,
intestin, ganglions lymphatiques)
RNeasy™ Mini Kit
VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Guide Complémentaire
NucleoSpin™ RNA Virus
NucleoSpin™ RNA
3
Extraction de l’ARN
Préparation des échantillons avant extraction
Sang total prélevé en tube EDTA
Le sang total prélevé sur tube EDTA est utilisable directement, sans préparation préalable à l’extraction.
L’extraction nécessite 100 µL de sang pour l’extraction.
Organes
1.
Disséquer finement le morceau d'organe dans une boîte de Pétri stérile à l’aide de pinces et bistouri stériles.
2.
Dans un microtube de 1.5 mL, peser 20 à 30 mg de l’organe préalablement disséqué à l’aide d’une balance de précision.
3.
L’extraction sera directement réalisée à partir de 20 à 30 mg de l’organe finement disséqué.
Ecouvillons
1.
Eluer l’écouvillon avec du PBS 1X selon une des méthodes suivantes :
–
Soit déposer directement 1 mL de PBS 1X sur l’écouvillon placé dans son tube de transport.
–
Soit placer l’écouvillon dans un microtube (après en avoir coupe la tige pour permettre la fermeture du tube) et le recouvrir de
1 mL de PBS 1X.
2.
Vortexer l’écouvillon dans le PBS 1X.
3.
Enlever l’écouvillon en l’écrasant sur la paroi du tube pour bien l’essorer. L’extraction sera effectuée à partir de 200 µL d’éluât.
Prélever le reste du volume disponible, le déposer dans un tube de stockage adéquat et stocker en dessous de −16°C.
Extraction avec le QIAamp™ Viral RNA Mini Kit
Avant de commencer
•
Reconstitution du Buffer AVL+Carrier : À réaliser selon les recommandations du fournisseur.
•
Reconstitution Buffer AW1 et AW2 : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la
première utilisation.
•
Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins
négatifs et positifs).
Protocole
1.
Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous :
Solution de lyse
Prise d’essai
(1)
Sang
Ecouvillons
NCS
560 µL d’AVL+Carrier
560 µL d’AVL+Carrier
560 µL d’AVL+Carrier
100 µL de sang
140 µL d’éluât d’écouvillon
100 ou 140 µL d’eau DNase/RNase-free(1)
Ajuster le volume en fonction des échantillons traités en parallèle.
2.
Vortexer immédiatement pendant 15 secondes.
3.
Incuber 10 minutes à température ambiante.
4.
Ajouter dans chaque tube 560 µL d’éthanol 96–100% - Homogénéiser par aspiration-refoulement (10 à 15 fois) - Centrifuger
rapidement le tube avant ouverture. On obtient le lysat de l’échantillon.
5.
Prendre une mini-colonne du QIAamp™ Viral RNA Mini Kit - Identifier la colonne.
6.
Transférer 630 µL du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 10000 × g - Jeter le tube collecteur Conserver la colonne.
7.
Transférer le reste du lysat de l’échantillon sur la même colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 10000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
8.
Distribuer 700 µL de buffer AW1 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 15 secondes à 10000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
9.
Distribuer 700 µL de buffer AW2 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 15 secondes à 10000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
10. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 1 minute à 13000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le
tube collecteur - Conserver la colonne.
11. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 60 µL de buffer AVE – Boucher.
12. Incuber 1 minute à température ambiante.
13. Centrifuger 1 minute à 8000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube.
Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C.
4
VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Guide Complémentaire
Extraction avec le kit NucleoSpin™ RNA Virus
Avant de commencer
•
Reconstitution du Buffer RAV1+Carrier : A réaliser selon les recommandations du fournisseur.
•
Reconstitution Buffer RAV3 : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la première
utilisation.
•
Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins
négatifs et positifs).
Protocole
1.
Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous :
Solution de lyse
Prise d’essai
(1)
Sang
Ecouvillons
NCS
600 µL de RAV1+Carrier
600 µL de RAV1+Carrier
560 µL de RAV1+Carrier
100 µL de sang
140 µL d’éluât d’écouvillon
100 ou 140 µL d’eau DNase/RNase-free(1)
Ajuster le volume en fonction des échantillons traités en parallèle.
2.
Vortexer immédiatement pendant 15 secondes.
3.
Incuber 10 minutes à température ambiante.
4.
Ajouter dans chaque tube 600 µL d’éthanol 96–100% - Homogénéiser par aspiration-refoulement (10 à 15 fois) - Centrifuger
rapidement le tube avant ouverture. On obtient le lysat de l’échantillon.
5.
Prendre une mini-colonne du kit NucleoSpin™ RNA Virus - Identifier la colonne.
6.
Transférer 650 µL du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 10000 × g - Jeter le tube collecteur Conserver la colonne.
7.
Transférer le reste du lysat de l’échantillon sur la même colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 10000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
8.
Distribuer 500 µL de buffer RAW dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 15 secondes à 10000 × g - Jeter le tube collecteur Conserver la colonne.
9.
Distribuer 600 µL de buffer RAV3 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 15 secondes à 10000 × g - Jeter le
tube collecteur - Conserver la colonne.
10. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 1 minute à 13000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le
tube collecteur - Conserver la colonne.
11. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 60 µL d’eau DNase/RNase-free - Boucher.
12. Incuber 1 minute à température ambiante.
13. Centrifuger 1 minute à 8000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube.
Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C.
VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Guide Complémentaire
5
Extraction avec le RNeasy™ Mini Kit
Note
Le protocole décrit ci-dessous est applicable sans utilisation de β-mercaptoethanol.
Avant de commencer
•
Reconstitution Buffer RPE : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la première
utilisation.
•
Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins
négatifs et positifs).
Protocole
1.
Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous :
Échantillon pour analyse
NCS
Solution de lyse
600 µL de RLT
600 µL de RLT
Prise d’essai
20 à 30 mg d’organe
50 µL d’eau RNase/DNase-free
2.
Vortexer immédiatement pendant 1 minute.
3.
Transférer le contenu du microtube sur une colonne QIAshredder (QIAGEN™) - Centrifuger 2 minutes à 15000 × g - Jeter la
colonne - Conserver le tube collecteur.
4.
Ajouter dans chaque tube 600 µL d’éthanol 70% - Homogénéiser en pipetant 4 à 5 fois - Ne pas centrifuger. On obtient le lysat de
l’échantillon.
5.
Prendre une mini-colonne du RNeasy™ Mini Kit - Identifier la colonne.
6.
Transférer 700 µL du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 10000 × g - Jeter le tube collecteur
- Conserver la colonne.
7.
Transférer le reste du lysat de l’échantillon sur la même colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 10000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
8.
Distribuer 700 µL de buffer RW1 dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 10000 × g - Jeter le tube collecteur Conserver la colonne.
9.
Distribuer 700 µL de buffer RPE (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 10000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
10. Distribuer 500 µL de buffer RPE (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 10000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
11. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 1 minute à 13000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le
tube collecteur - Conserver la colonne.
12. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 50 µL d’eau DNase/RNase-free - Boucher.
13. Incuber 1 minute à température ambiante.
14. Centrifuger 1 minute à 8000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube.
Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C.
6
VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Guide Complémentaire
Extraction avec le kit NucleoSpin™ RNA
Note
Le protocole décrit ci-dessous est applicable sans utilisation de β-mercaptoethanol.
Avant de commencer
•
Reconstitution Buffer RA3 : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la première
utilisation.
•
Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins
négatifs et positifs).
Protocole
1.
Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous :
Solution de lyse
Prise d’essai
Échantillon pour analyse
NCS
350 µL de RA1
350 µL de RA1
20 à 30 mg d’organe
50 µL d’eau RNase/DNase-free
2.
Vortexer immédiatement pendant 1 minute.
3.
Transférer le contenu du microtube sur une colonne NucleoSpin™ Filter - Centrifuger 1 minute à 11000 × g - Jeter la colonne Conserver le tube collecteur.
4.
Ajouter dans chaque tube 350 µL d’éthanol 70% - Homogénéiser en pipetant 4 à 5 fois - Ne pas centrifuger. On obtient le lysat de
l’échantillon.
5.
Prendre une mini-colonne du kit NucleoSpin™ RNA - Identifier la colonne.
6.
Transférer 700 µL du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 11000 × g - Jeter le tube collecteur
- Conserver la colonne.
7.
Distribuer 200 µL de buffer RA2 dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 11000 × g - Jeter le tube collecteur Conserver la colonne.
8.
Distribuer 600 µL de buffer RA3 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 11000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
9.
Distribuer 250 µL de buffer RA3 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 2 minutes à 11000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
10. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 50 µL d’eau DNase/RNase-free - Boucher.
11. Incuber 1 minute à température ambiante.
12. Centrifuger 1 minute à 8000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube.
Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C.
VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Guide Complémentaire
7
Documentation et support
Service clientèle et assistance technique
Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion
Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique,
notamment :
• Numéros de téléphone partout dans le monde
•
Commande et Support web
•
Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
•
Certificats d’analyse
•
Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques))
Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant.
Garantie produit limitée
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles
sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact
avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT.
Historique des révisions : Pub. N° MAN0008852 (français)
Révision
Date
B.0
23 mai 2017
A.0
31 mars 2014
Description
Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.
Base de référence pour l’historique de révision
Personne morale : Life Technologies Corporation | Carlsbad, CA 92008 États-Unis | Numéro gratuit aux États-Unis 1 800 955 6288
©2017 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire.
NucleoSpin est une marque de MACHEREY-NAGEL GMBH & Co. QIAGEN, QIAamp, et RNeasy sont des marques de QIAGEN GmbH.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
23 mai 2017