Thermo Fisher Scientific VetMAX Toxinogenic P. multocida Kit Mode d'emploi

GUIDE COMPLEMENTAIRE
VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit
Protocoles de purification d'acides nucléiques
En association avec la Référence Catalogue PMTP50
Partie Nº 100021179 Pub. Nº MAN0008847 Rév. B.0
Espèce(s)
Isolation des acides nucléiques à partir des matrices
Test
Porcins
Ecouvillons nasaux et amygdaliens
Colonies
Poumons
Individuel
Sommaire
Purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques ............................................................................... 2
Contenu de ce manuel.................................................................................................................................................................................. 2
Choix des échantillons ................................................................................................................................................................................. 2
Conservation des échantillons ..................................................................................................................................................................... 2
Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fournis dans le kit ............................................................................................................. 3
Protocoles d’extraction de l’ADN ................................................................................................................................................................. 3
Extraction de l’ADN ......................................................................................................................................................... 4
Préparation des échantillons avant extraction ........................................................................................................................................... 4
Extraction avec le QIAamp™ DNA Mini Kit ................................................................................................................................................... 4
Extraction avec le kit NucleoSpin™ Tissue................................................................................................................................................... 5
Documentation et support ............................................................................................................................................... 6
Service clientèle et assistance technique ................................................................................................................................................... 6
Garantie produit limitée ............................................................................................................................................................................... 6
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes
de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse
thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques
du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Pour usage en laboratoire.
Purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques
Contenu de ce manuel
Ce manuel a pour objectif de présenter des protocoles de purification des ADN bactériens de Pasteurella multocida compatibles avec
Applied Biosystems™ VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit.
Choix des échantillons
Matrice
Type d’analyse
Quantité requise et matériel de prélèvement
Ecouvillons nasaux et amygdaliens
Individuelle
Ecouvillon sec stérile
Colonies
Individuelle
2 mL de PBS 1X sur une boite de gélose au sang avec colonies de PMT
Poumons
Individuelle
20 à 30 mg d’organes
Conservation des échantillons
Il est nécessaire de s’assurer de la qualité des échantillons avant leur entrée dans le processus analytique.
Ecouvillons
Suite au prélèvement, maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation, dans un délai maximum de 24 heures après prélèvement.
Après élution de l’écouvillon, utiliser directement l’éluât pour réaliser la PCR. Placer le reste d’éluât à en dessous de −16°C pour
conservation jusqu’à 1 mois ou en dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 mois.
Poumons
Suite au prélèvement, selon le cas de figure :
• Si l’analyse est effectuée dans les 8 jours suivant le prélèvement : maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation.
•
Si l’analyse est effectuée au-delà des 8 jours suivant le prélèvement : congeler en dessous de −16°C jusqu’à utilisation.
Dans les deux cas, après utilisation ou passé le délai de 8 jours, congeler en dessous de −16°C pour conservation jusqu’à 1 an ou en
dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 an.
Colonies
Les colonies de Pasteurella multocida ensemencées sur gélose au sang 24 heures à 37ºC sont reprises avec 2 mL de PBS 1X.
2
VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit Guide Complémentaire
Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fournis dans le kit
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.
Matériel et réactifs nécessaires à la préparation des échantillons pour analyse
•
Poste de sécurité microbiologique (PSM) de type II
•
Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre
•
Un vortex ou équivalent
•
Une centrifugeuse pour microtubes de 1.5 mL et 2 mL
•
Balance de précision
•
Etuve à 70ºC
•
Microtubes DNase/RNase-free de 1.5 mL et 2 mL
•
Tampon PBS 1X
•
Eau DNase/RNase-free
Kits, réactifs et matériels pour l’extraction et la purification des ADN des échantillons
Tous les matériels et réactifs requis pour la préparation des échantillons pour analyse sont susceptibles d’être utilisés pour cette étape.
S’assurer en plus de disposer des éléments suivants :
• Ethanol 96–100%
•
Extraction manuelle sur colonnes de silice en format individuel :
–
QIAamp™ DNA Mini Kit (QIAGEN™) ou NucleoSpin™ Tissue (MACHEREY-NAGEL)
–
Une centrifugeuse pour microtubes
Protocoles d’extraction de l’ADN
Kits d’extraction recommandés
Ecouvillons nasaux et amygdaliens,
colonies, poumons
VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit Guide Complémentaire
QIAamp™ DNA Mini Kit
NucleoSpin™ Tissue
3
Extraction de l’ADN
Préparation des échantillons avant extraction
Ecouvillons
1.
Eluer l’écouvillon avec du PBS 1X selon une des méthodes suivantes :
–
Soit déposer directement 1 mL de PBS 1X sur l’écouvillon placé dans son tube de transport.
–
Soit placer l’écouvillon dans un microtube (après en avoir coupe la tige pour permettre la fermeture du tube) et le recouvrir de
1 mL de PBS 1X.
2.
Vortexer l’écouvillon dans le PBS 1X.
3.
Enlever l’écouvillon en l’écrasant sur la paroi pour bien l’essorer. L’extraction sera réalisée à partir de 200 µL d’éluât.
Prélever le reste du volume disponible, le déposer dans un tube de stockage adéquat et stocker en dessous de −16ºC.
Organes
1.
Dilacérer finement le morceau d'organe dans une boîte de Pétri stérile à l’aide de pinces et bistouri stériles.
2.
Dans un microtube, peser 20 à 30 mg de l’organe préalablement dilacéré à l’aide d’une balance de précision.
3.
Procéder à l’extraction à partir de ces 20 à 30 mg d’organe dilacéré.
Colonies
L’extraction est réalisable directement à partir de 200 µL de suspension de colonies.
Extraction avec le QIAamp™ DNA Mini Kit
Avant de commencer
•
Reconstitution Buffer AW1 et AW2 : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la
première utilisation.
•
Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins
négatifs).
Protocole
1.
Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous :
Solution de lyse
Prise d’essai
Echantillon pour analyse
180 µL de Buffer ATL
+ 20 µL de protéinase K
200 µL d’échantillon ou
20 à 20mg d’organe
NCS
180 µL de Buffer ATL
+ 20 µL de protéinase K
200 µL de PBS 1X
2.
Vortexer immédiatement pendant 15 secondes.
3.
Incuber 30 minutes à 70°C.
4.
Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture.
5.
Ajouter 200 µL de buffer AL et vortexer pendant 15 secondes.
6.
Incuber 10 minutes à 70°C.
7.
Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture.
8.
Ajouter dans chaque tube 200 µL d’éthanol 96–100% - Homogénéiser en vortexant pendant 15 secondes - Centrifuger rapidement
le tube avant ouverture. On obtient le lysat de l’échantillon.
9.
Prendre une mini-colonne du QIAamp™ DNA Mini Kit - Identifier la colonne.
10. Transférer la totalité du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 15000 × g - Jeter le tube collecteur
- Conserver la colonne.
11. Distribuer 500 µL de buffer AW1 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 15000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
12. Distribuer 500 µL de buffer AW2 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 15000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
13. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 3 minutes à 15000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le
tube collecteur - Conserver la colonne.
14. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 200 µL de buffer AE - Boucher.
15. Incuber 1 minute à température ambiante.
16. Centrifuger 1 minute à 6000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube.
Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C.
4
VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit Guide Complémentaire
Extraction avec le kit NucleoSpin™ Tissue
Avant de commencer
•
Reconstitution Buffer B5 : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la première
utilisation.
•
Reconstitution de la protéinase K : ajouter la quantité requise de buffer PB selon les recommandations du fournisseur avant la première
utilisation.
•
Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins
négatifs).
Protocole
1.
Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous :
Echantillon pour analyse
NCS
Solution de lyse
180 µL de Buffer T1
+ 25 µL de protéinase K
180 µL de Buffer T1
+ 25 µL de protéinase K
Prise d’essai
200 µL d’échantillon ou
20 à 30 mg d’organe
200 µL de PBS 1X
2.
Vortexer immédiatement pendant 15 secondes.
3.
Incuber 30 minutes à 70°C.
4.
Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture.
5.
Ajouter 200 µL de buffer B3 et vortexer pendant 15 secondes.
6.
Incuber 10 minutes à 70°C.
7.
Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture.
8.
Ajouter dans chaque tube 200 µL d’éthanol 96–100% - Homogénéiser en vortexant pendant 15 secondes - Centrifuger rapidement
le tube avant ouverture. On obtient le lysat de l’échantillon.
9.
Prendre une mini-colonne du kit NucleoSpin™ Tissue - Identifier la colonne.
10. Transférer la totalité du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 11000 × g - Jeter le tube collecteur
- Conserver la colonne.
11. Distribuer 500 µL de buffer BW (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 11000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
12. Distribuer 600 µL de buffer B5 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 11000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
13. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 3 minutes à 11000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le
tube collecteur - Conserver la colonne.
14. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 200 µL de buffer BE - Boucher.
15. Incuber 1 minute à température ambiante.
16. Centrifuger 1 minute à 11000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube.
Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C.
VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit Guide Complémentaire
5
Documentation et support
Service clientèle et assistance technique
Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion
Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique,
notamment :
• Numéros de téléphone partout dans le monde
•
Commande et Support web
•
Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
•
Certificats d’analyse
•
Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques))
Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant.
Garantie produit limitée
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles
sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact
avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT.
Historique des révisions : Pub. N° MAN0008847 (français)
Révision
Date
B.0
6 juin 2017
Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.
Description
A.0
31 mars 2014
Base de référence pour l’historique de révision
Personne morale : Life Technologies Corporation | Carlsbad, CA 92008 États-Unis | Numéro gratuit aux États-Unis 1 800 955 6288
©2017 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire.
NucleoSpin est une marque de MACHEREY-NAGEL GMBH & Co. QIAamp et QIAGEN sont des marques de QIAGEN GmbH.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
6 juin 2017
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