NOTICE D’UTILISATION
VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit
PCR temps réel TaqMan® pour la détection de Pasteurella multocida toxinogène
Référence Catalogue PMTP50
Partie Nº 100020410 Pub. Nº MAN0008845 Rév. B.0
Technique
Espèce(s)
Acides nucléiques isolés à partir des matrices
Test
PCR temps réel (ADN)
– Duplex
– IPC endogène
Porcins
Ecouvillons nasaux et amygdaliens
Colonies
Poumons
Individuel
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes
de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse
thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques
du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Informations sur le produit
Description du produit
Applied Biosystems™ VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit est un outil de diagnostic moléculaire permettant la détection des
souches toxinogènes de Pasteurella multocida par la méthode de PCR en temps réel.
Chaque échantillon d’ADN obtenu après extraction est analysé en monocupule : la même cupule est utilisée pour la détection
spécifique de l’ADN bactérien des souches toxinogènes de Pasteurella multocida et pour la détection d’un IPC (Internal Positive
Control). La positivité de l’IPC traduit à la fois l’efficacité de l’extraction et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.
Il est utilisable sur ADN bactériens extraits à partir d’écouvillons nasaux et amygdaliens, de colonies bactériennes et de poumons.
Les protocoles complets d’extractions des ADN bactériens à partir de ces matrices sont disponibles sur demande au Support Technique.
Réactifs du kit et conservation
Le VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit se présente sous la forme d’un coffret contenant les différents réactifs pour la détection en
duplex de Pasteurella multocida toxinogène et d’un contrôle interne IPC. À réception, le kit doit être conservé dans sa totalité entre
−30°C et −10°C. Après première utilisation d’un composant, le conserver selon les recommandations suivantes :
Conservation
Volume
(50 réactions)
A réception
Après première
utilisation
3 - Mix PMT
(Tube vert)
Mix pour PCR TaqMan®. Contient :
• Le système de détection pour la cible Pasteurella multocida toxinogène,
comprenant une sonde TaqMan® marquée FAM™ – TAMRA™.
• Le système de détection pour l’IPC, comprenant une sonde TaqMan®
marquée VIC™ – TAMRA™.
• Le tampon et l’enzyme de PCR temps réel.
2 × 500 µL
−30°C à −10°C
2°C à 8°C
4a – EPC PMT
(Tube marron)
External Positive Control :
Contrôle positif en Pasteurella multocida. Il s’agit d’acides nucléiques déjà
extraits à amplifier lors de la PCR temps réel.
90 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
Article
Description
Témoins d’extraction et d’amplification
Le VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit contient 1 témoin permettant la validation de l’amplification des ADN bactériens :
4a - EPC PMT : contrôle positif en Pasteurella multocida toxinogène
Contrôle positif déjà extrait à amplifier lors de la PCR temps réel.
Un résultat positif compris dans l’intervalle accepté de Ct permet de valider l’amplification de la cible Pasteurella multocida toxinogène
par PCR temps réel.
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
La validation de l’extraction des acides nucléiques pour chaque échantillon s’effectue grâce à la détection d’un IPC endogène (Internal
Positive Control), présent dans chaque échantillon.
Un résultat IPC positif avec une valeur comprise dans l’intervalle accepté de Ct dans un échantillon permet de valider l’extraction de
cet échantillon qu’il soit positif ou négatif pour le pathogène recherché : élimination des faux négatifs et vérification de l’effet des
inhibiteurs.
Il est recommandé de réaliser deux contrôles négatifs pour valider le bon déroulement de l’analyse :
NCS : contrôle négatif d’extraction
C’est un témoin composé des réactifs utilisés lors de l’extraction, sans ajout d’échantillon (le volume d’échantillon peut être remplacé
par le tampon utilisé lors de la préparation des échantillons ou par de l’eau DNase/RNase-free), qui subit le même traitement que les
échantillons : extraction des acides nucléiques puis PCR temps réel.
Un résultat négatif en Pasteurella multocida toxinogène et en IPC endogène permet de valider l’absence de contamination au cours de
l’extraction et de la PCR temps réel.
NC : contrôle négatif d’amplification
Il s’agit du mix d’amplification déposé dans la plaque au moment de la préparation de la PCR temps réel, complété de 5 µL d’eau
DNase/RNase-free pour ajuster la réaction à 25 µL.
Un résultat négatif pour Pasteurella multocida toxinogène et IPC permet de valider l’absence de contamination au cours de la
préparation des réactions pour la PCR temps réel.
Matériel et réactifs requis pour la PCR temps réel non fournis dans le kit
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.
• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre
•
Eau DNase/RNase-free
•
Tampon TE 1X
•
Tampon PBS 1X
•
Un thermocycleur de PCR temps réel capable de détecter les fluorophores suivants :
– FAM™ (maximum d’émission : λ515 nm)
– VIC™ (maximum d’émission : λ554 nm)
•
Consommables de qualité optique compatibles avec le thermocycleur utilisé :
–
–
Plaques PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits), microtubes ou capillaires
Films ou bouchons adaptés à la fermeture
Procédure d’analyse
Le volume réactionnel de la PCR temps réel est de 25 µL :
• 3 - Mix PMT : 20 µL par analyse
•
ADN extrait : 5 µL par analyse
Extraction des ADN bactériens
Il est nécessaire d’isoler les ADN à partir des échantillons pour l’analyse par PCR temps réel.
NOTE : Pour connaître des méthodes d’extractions compatibles et validées avec le VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit, merci de
contacter le Support Technique.
Préparation de la PCR temps réel
1. Créer un plan d’analyse pour la distribution des mix et échantillons. Éloigner si possible le contrôle positif (EPC) des autres
échantillons.
2. Décongeler le tube 3 - Mix PMT entre 2°C et 8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant.
3. Homogénéiser le tube 3 - Mix PMT par agitation douce, puis centrifuger brièvement.
4. Distribuer 20 µL de 3 - Mix PMT par puits de la plaque PCR, barrette PCR ou capillaire utilisé.
5. Ajouter les ADN des échantillons et contrôles au mix réactionnel, selon le plan d’analyse prédéfini :
Type d’analyse
Echantillon pour analyse
Composant
Volume d’échantillon
ADN extraits de l’échantillon
5 µL
Contrôle positif d’amplification
4a - EPC PMT
5 µL
Contrôle négatif d'extraction (NCS)
NCS extrait
5 µL
Contrôle négatif d’amplification (NC)
Eau DNase/RNase-free
5 µL
6. Fermer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires avec un film adhésif ou des bouchons adaptés.
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VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit Notice d’Utilisation
Amplification par PCR en temps réel
1. Créer les détecteurs suivants sur le thermocycleur :
Reporter
Quencher
PMT
FAM
™
TAMRA™(1)
IPC PMT
VIC™
TAMRA™(1)
Référence passive : ROX™(1)
(1)
Les fluorophores TAMRA™ et ROX™ sont à renseigner obligatoirement pour l’analyse par PCR temps réel si le thermocycleur est capable de les détecter.
Pour les autres thermocycleurs, l’absence de détection de ces fluorophores ne remet pas en cause l’analyse par PCR temps réel.
2. Attribuer pour chaque échantillon le détecteur PMT et le détecteur IPC PMT dans le puits utilisé pour l’analyse.
3. Créer le programme de PCR temps réel suivant pour l’analyse :
Répétitions de l’étape
Température
Durée
Etape 1
×1
50°C
2 minutes
Etape 2
×1
95°C
10 minutes
Etape 3
×45
95°C
15 secondes
60°C(1)
1 minute
(1)
Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 1 minute.
4. Placer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires dans le thermocycleur et démarrer la PCR temps réel.
Analyse des résultats
Analyse des données brutes
Se référer aux recommandations du fournisseur du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.
1. Placer les lignes seuils (threshold) de manière indépendante pour chaque cible de la PCR temps réel.
2. Interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct obtenues pour les échantillons pour chaque détecteur selon les
recommandations ci-après.
Validation du test
La validation du test passe par l’acceptation des critères suivants :
Détecteur PMT
Détecteur IPC PMT
Validation
Ct = Ct QC PMT de 4a- EPC PMT ± 3Ct(1)
Ct < 45 ou Ct > 45(2)
PCR validée
NCS
Ct > 45
Ct > 45
Extraction validée
NC
Ct > 45
Ct > 45
Réactifs PCR validés
EPC PMT
(1)
(2)
Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.1 « EPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.
Ne pas prendre en compte la valeur d’IPC dans l’EPC pour la validation du test.
Interprétation des résultats
Pour chaque échantillon analysé, interpréter les résultats comme décrit ci-dessous :
(1)
Détecteur PMT
Détecteur IPC PMT
Interprétation
Ct < 45
Ct < 45 ou Ct > 45
Pasteurella multocida détecté
Ct > 45
Ct < 45
Pasteurella multocida non détecté
Ct > 45
Ct > 45
Non validé(1)
L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la négativité de l’IPC.
Conduite à tenir pour les échantillons non validés
1. Diluer l’ADN de l’échantillon non validé au 1:10 en tampon TE 1X.
2. Faire une nouvelle analyse PCR sur 5 µL de cette dilution.
3. Si l’ADN dilué est positif en Pasteurella multocida toxinogène ou négatif en Pasteurella multocida toxinogène avec un résultat IPC
conforme, le résultat obtenu est alors validé.
4. Si l’ADN dilué est négatif en Pasteurella multocida toxinogène avec un résultat IPC non conforme, le résultat obtenu est toujours non
validé. Dans ce cas, renouveler l’extraction de l’échantillon en le pré-diluant au 1:10 dans du tampon PBS 1X avant extraction.
5. Si le résultat est toujours non validé, répéter l’analyse sur un nouveau prélèvement.
VetMAX™ Toxinogenic P. multocida Kit Notice d’Utilisation
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Documentation et support
Service clientèle et assistance technique
Garantie produit limitée
Support technique : rendez-vous sur
thermofisher.com/askaquestion
Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux
dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance
technique, notamment :
• Numéros de téléphone partout dans le monde
• Commande et Support web
• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
• Certificats d’analyse
• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également
appelées FS (Fiches Signalétiques))
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs
produits selon les termes et conditions générales de ventes
disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/
global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous
pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web
suivante : thermofisher.com/support.
Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux
produits chimiques d'autres fabricants, contacter
chaque fabricant.
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT.
Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008845 (français)
Révision
Date
B.0
6 juin 2017
A.0
04 décembre 2013
Description
Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.
Base de référence pour l’historique de révision
Licence à Usage Limité Nº 460 : Diagnostic vétérinaire PCR. Avis aux acheteurs : destiné à des services de diagnostic vétérinaire, notamment l’établissement de rapports de
diagnostic payants et pour les besoins de la recherche uniquement. Le diagnostic chez l’homme nécessite une licence séparée de Roche.
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6 juin 2017
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