Macherey-Nagel NucleoMag RNA/DNA Pro, kit Mode d'emploi
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MACHEREY-NAGEL Biologie moléculaire Bioanalysis Manuel d’utilisation User manual Extraction d’ARN n NucleoMag® RNA Pro n NucleoMag® RNA/DNA Pro Janvier 2025 / Rev. 02 www.mn-net.com www.mn-net.com Contact MN Germany and international MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-0 Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only) E-mail: [email protected] Technical Support Bioanalysis Tel.: +49 24 21 969-333 E-mail: [email protected] USA MACHEREY-NAGEL Inc. 924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA Toll-free: 888 321 6224 (MACH) E-mail: [email protected] France MACHEREY-NAGEL SAS 1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France Tel.: +33 388 68 22 68 E-mail: [email protected] MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 € Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531 Switzerland MACHEREY-NAGEL AG Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland Tel.: +41 62 388 55 00 E-mail: [email protected] www.mn-net.com Extraction d’ARN Sommaire 1 Composants 4 1.1 Contenu du kit 4 1.2 Réactifs, équipements et consommables à fournir par l’utilisateur 5 1.3 A propos de ce manuel 6 2 Description du produit 7 2.1 Principe général 7 2.2 Caractéristiques du kit 7 2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons 8 2.4 Systèmes de séparation magnétique 9 2.5 Réglage des paramètres d’agitation 10 2.6 Manipulation des billes 10 2.7 Procédures d’élution 11 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs 12 4 Instructions de sécurité 14 4.1 Elimination des déchets 14 5 Protocole pour l’extraction d’ARN à partir de cellules et de tissus 15 6 Protocole pour l’extraction d’ARN à partir de matériel végétal 21 7 Protocole pour l’extraction de l’ARN et de l’ADN dans des éluats séparés 27 8 Annexes 30 8.1 Guide de résolution des problèmes 30 8.2 Informations de commande 32 8.3 Restrictions d’utilisation du produit / garantie 33 8.4 Versions linguistiques et prédominance 33 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 3 Extraction d’ARN 1 Composants 1.1 Contenu du kit NucleoMag® RNA Pro NucleoMag® RNA/DNA Pro REF 1 × 96 preps 744360.1 4 × 96 preps 744360.4 1 × 96 preps 744370.1 NucleoMag® B-Beads 2 × 1.5 mL 6 × 1.5 mL 2 × 1.5 mL Tampon de lyse MRL 60 mL 250 mL 60 mL Tampon de fixation MRB 80 mL 400 mL 80 mL Tampon de lavage MRW 125 mL 400 mL 125 mL Tampon d’élution MRE* 30 mL 125 mL 30 mL Agent réducteur TCEP 1 flacon (107 mg / flacon) 4 flacons (107 mg / flacon) 1 flacon (107 mg / flacon) rDNase, lyophilisée** 3 flacons (taille D) 12 flacons (taille D) 3 flacons (taille D) Tampon de réaction pour la rDNase 30 mL 2 × 60 mL 30 mL H2O RNase-free 13 mL 30 mL 13 mL Tampon de lavage DNA Wash (concentré)**. 2 × 12 mL Tampon d’élution DNA Elute Notice d’utilisation 12 mL 1 1 * Tampon d’élution MRE : Eau RNase-free ** Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3. 4 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 1 Extraction d’ARN 1.2 Réactifs, équipements et consommables à fournir par l’utilisateur Equipements et consommables Produit REF Conditionnement Système de séparation magnétique p.e., NucleoMag® SEP (voir le paragraphe 2.3). 744900 1 Plaque de séparation pour la séparation des billes magnétiques, p.e., Square-well Block (bloc 96 puits avec des puits carrés de 2.1 mL) 740481 740481.24 4 24 Tubes de lyse pour l’incubation des échantillons et la lyse, p.e., Rack of Tubes Strips (1 set comprend 1 Rack, 12 barrettes de 8 bouchons chacune (puits de 1,2 mL) et 12 Cap Strips) 740477 740477.24 4 sets 24 sets Plaque d’élution pour la collecte d’acides nucléiques purifiés, p.e., plaque d’élution à fond en U (microplaque 96 puits avec des puits à fond en U de 300 μL) p.e., plaque d’élution à fond plat (microplaque 96 puits avec des puits à fond plat de 300 μL) 740486.24 24 Pour l’extraction d’ARN à partir de matériel végétal : Tampon de lyse RL1 740385.125 125 mL NucleoSpin® DNA/RNA Buffer Set pour la purification en parallèle de l’ARN et de l’ADN dans des éluats séparés : Tampon d’élution DNA Elute, Tampon de lavage DNA Wash. 740944 100 preps Pour l’utilisation du kit sur l’instrument KingFisher® Flex : p.e. 96-well Accessory Kit B (Square-well Blocks, Deep-well tip combs, plaques d’élution pour 4 × 96-preps NucleoMag® RNA (Pro) avec le KingFisher® Flex platform) 744951 1 sets Pour l’utilisation du kit sur le MagnetaPure 32 Plus ou l’IsoPure Mini : Plaques 96 Deep-well pour les systèmes à barreaux magnétiques 744955 25 Pour l’utilisation du kit sur le MagnetaPure 32 Plus ou l’IsoPure Mini : Peignes Tip combs 8-positions pour les systèmes à barreaux magnétiques 744960 50 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 5 Extraction d’ARN 1.3 A propos de ce manuel Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs de lire les paragraphes détaillés du protocole du kit NucleoMag® RNA Pro / NucleoMag® RNA / DNA Pro avant d’utiliser ce produit. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du protocole est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil de suivi des étapes pour l’exécution de la procédure de purification. Toute la documentation technique est disponible en ligne à l’adresse suivante : www.mn-net.com. 6 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 Extraction d’ARN 2 Description du produit 2.1 Principe général La procédure du NucleoMag® RNA Pro ainsi que celle du NucleoMag® RNA/DNA Pro est basée sur l’adsorption réversible des acides nucléiques sur des billes paramagnétiques dans des conditions de tampons appropriées. La lyse des échantillons est réalisée par homogénéisation dans une solution contenant des ions chaotropiques. Pour ajuster les conditions dans lesquelles les acides nucléiques se lient aux billes paramagnétiques, des solvants à base d’alcool et les NucleoMag® B-Beads sont ajoutés au lysat. Les contaminants et les sels sont éliminés à l’aide du tampon de lavage MRW et d’éthanol à 70 %. Après la séparation magnétique, les billes paramagnétiques sont incubées avec une DNase recombinante pour éliminer l’ADN copurifié. Après une étape de re-fixation de l’ARN, une dernière étape de lavage est effectuée avec de l’éthanol à 70 %. L’éthanol résiduel de l’étape de lavage est éliminé par séchage à l’air. Enfin, l’ARN très pur est élué avec le tampon d’élution et l’ARN peut être directement utilisé pour des applications avales. En combinaison avec le NucleoSpin® RNA/DNA Buffer Set ainsi qu’avec le kit NucleoMag® RNA/DNA Pro, il est également possible d’extraire l’ARN et l’ADN du même échantillon dans des fractions séparées. Le kit NucleoMag® RNA/DNA Pro est identique au kit NucleoMag® RNA Pro mais contient en plus les tampons pour extraire l’ADN dans une fraction séparée. Les deux kits peuvent être utilisés manuellement ou de manière automatisée sur des robots pipeteurs ou avec des systèmes à aimant. Nous pouvons fournir une assistance personnalisée, des informations sur les protocoles ou des programmes vérifiés pour de nombreuses plateformes. Pour plus d’informations, veuillez contacter notre support technique ou visiter le site www.mn-net.com/automation. 2.2 Caractéristiques du kit Le NucleoMag® RNA Pro ainsi que le kit NucleoMag® RNA/DNA Pro sont conçus pour la préparation rapide, manuelle et automatisée à petite échelle d’ARN très pur à partir de 20 mg de tissu ou de 2 × 10⁶ cellules ainsi que de 40 mg de feuilles végétales. Le kit est conçu pour être utilisé avec la plaque de séparation magnétique NucleoMag® SEP (voir informations de commande, 8.2) ou d’autres systèmes de séparation magnétique (voir paragraphe 2.4). La durée de la procédure manuelle pour la préparation de 96 échantillons est d’environ 120 minutes ou d’environ 90 minutes avec un système automatisé à barreaux magnétiques. L’ARN purifié peut être utilisé directement comme matrice pour la RT-PCR ou tout autre type de réaction enzymatique. Les deux kits permettent une automatisation facile sur les instruments courants de manipulation des liquides ou les systèmes de séparation magnétique automatisés, par exemple les instruments MagnetaPure32 Plus, IsoPure Mini ou Thermo Fisher Scientific KingFisher®instrurments. Le temps de préparation réel dépend de la configuration de l’instrument et du système de séparation magnétique utilisé. Réserver à l’usage de la recherche. Grâce à la DNase recombinante fournie avec le kit, l’ARN élué est pratiquement exempt d’ADN. Le kit fournit des réactifs pour la purification d’un maximum de 60 μg d’ARN pur à partir d’échantillons appropriés. En fonction du volume d’élution utilisé, des concentrations de 10 à 600 ng/μL peuvent être obtenues. MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 7 Extraction d’ARN Le kit NucleoMag® RNA Pro ainsi que le kit NucleoMag® RNA/DNA Pro est entièrement utilisable à température ambiante. Pour plus d’informations, visitez notre site web : www.mn-net.com/bioanalytik/htp-information Chez MN, nous vous proposons des scripts pour différentes plateformes. Il vous suffit de nous contacter et nous vous ferons parvenir le script. Si vous êtes à la recherche de solutions plus personnalisées, nous pourrons également vous aider. Il vous suffit de nous contacter et nous ferons en sorte que l’automatisation soit pour vous une expérience agréable grâce à notre soutien. 2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons Environnement de travail Maintenir un environnement de travail exempt de RNases. Porter des gants à tout moment pendant la préparation. Changer de gants fréquemment Stockage des échantillons et inhibition des RNases Les RNases peuvent dégrader rapidement l’ARN contenu dans les échantillons si ces derniers ne sont pas protégés de l’activité des RNases après la récolte. Les méthodes suivantes sont recommandées pour éviter la dégradation de l’ARN : • Utiliser un échantillon fraîchement récolté pour une lyse immédiate et une purification de l’ARN. • Immerger et conserver les échantillons dans la solution de stabilisation NucleoProtect® RNA ou des solutions similaires. Veiller à ce que l’échantillon soit complètement imprégné de la solution de stabilisation avant de le congeler. Retirer l’excès de solution de stabilisation de l’échantillon avant l’extraction de l’ARN conformément au manuel d’utilisation de la solution de stabilisation. • Congeler rapidement l’échantillon dans de l’azote liquide immédiatement après la récolte et le conserver à une température comprise entre -70 et -80 °C. Les échantillons congelés sont stables jusqu’à 6 mois. Un mortier et un pilon peuvent être utilisés pour réduire l’échantillon congelé à l’état de poudre. Veiller à ce que l’échantillon ne soit pas décongelé avant d’entrer en contact avec le tampon de lyse. • Conserver les échantillons dans le tampon de lyse MRL ou RL1 après broyage à -70 / - 80 °C jusqu’à un an, à 4 °C jusqu’à 24 heures ou à température ambiante jusqu’à quelques heures. Les échantillons congelés dans le tampon de lyse MRL ou RL1 doivent être décongelés lentement avant de commencer l’extraction de l’ARN. 8 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 Extraction d’ARN 2.4 Systèmes de séparation magnétique Pour l’utilisation du NucleoMag® RNA Pro ainsi que du kit NucleoMag® RNA/DNA Pro, il est recommandé d’utiliser le système de séparation magnétique NucleoMag® SEP. La séparation est effectuée dans un Square-well Block (voir informations de commande, paragraphe 8.2). Le kit peut également être utilisé avec d’autres systèmes de séparation magnétique. Voir les informations de commande du fabricant pour connaître les plaques de séparation appropriées. Séparateur magnétique Plaque ou tube de séparation NucleoMag® SEP (MN REF 744900) Bloc 96 puits carrés - Square-well Block (MN REF 740481/.24) Tecan Te-MagS™ Tubes de 1,5 mL sans bouchons (Sarstedt) Séparation à aimants statiques Pour les séparateurs à aimants statiques, comme par exemple notre NucleoMag® SEP (une utilisation manuelle ou sur robot pipeteur), leur utilisation est recommandée avec un agitateur de microplaques approprié pour une remise en suspension optimale des billes pendant les étapes de lavage et d’élution. Alternativement, les billes peuvent être remises en suspension dans le tampon par pipetages successifs. Pour une utilisation entièrement automatisée sur un automate de pipetage, un bras « gripper » est nécessaire pour le transfert des plaques de séparation de l’aimant vers l’agitateur et inversement. Systèmes à aimants mobiles Les séparateurs à aimants mobiles font bouger les aimants d’un côté à l’autre des puits, entrainant ainsi les billes à travers les solutions de lavage et d’élution. La séparation magnétique a lieu lors de l’arrêt des aimants. Séparateurs automatisés Ces séparateurs transfèrent les billes dans les différents tubes ou plaques. Les billes sont remises en suspension dans les solutions par rétractation des aimants à l’intérieur de leur protection. Après chaque étape de fixation, de lavage ou d’élution, les billes sont collectées et transportées dans le tube ou plaque correspondant à la solution suivante. MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 9 Extraction d’ARN 2.5 Réglage des paramètres d’agitation Lors de l’utilisation d’un agitateur de plaques pour les étapes de lavage et d’élution, les paramètres d’agitation doivent être ajustés avec soin pour chaque plaque de séparation et chaque agitateur afin d’éviter toute contamination croisée d’un puits à l’autre. Procéder comme suit : Réglage de la vitesse de l’agitateur pour les étapes de lavage : • Déposer 900 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque sur l’agitateur et commencer à agiter à une vitesse modérée pendant 30 secondes. Éteindre l’agitateur et vérifier la présence de petites gouttelettes d’eau colorée à la surface de la plaque. • Augmenter la vitesse d’agitation et agiter pendant 30 secondes supplémentaires et vérifier à nouveau la présence de gouttelettes à la surface de la plaque. • Continuer à augmenter la vitesse d’agitation jusqu’à observer des gouttelettes sur le dessus de la plaque de séparation. Réduire ensuite la vitesse, vérifier l’absence de projection et utiliser ce réglage pour les étapes de lavage. Réglage de l’agitation pour l’étape d’élution : • Déposer 100 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation et procéder comme décrit ci-dessus. 2.6 Manipulation des billes Distribution des billes Une distribution homogène des billes magnétiques dans les différents puits de la plaque de séparation est essentielle pour assurer une grande cohérence d’un puits à l’autre. Par conséquent, avant de distribuer les billes, s’assurer que les billes sont complètement remises en suspension. Bien agiter le flacon de stockage ou le placer brièvement sur un vortex. Le fait de mélanger au préalable les billes magnétiques avec le tampon de fixation permet une distribution plus homogène des billes dans les différents puits de la plaque de séparation. Lors de l’automatisation, une étape de mélange des billes et du tampon de fixation dans les réservoirs avant leur distribution dans les plaques de séparation est recommandée afin de s’assurer que les billes demeurent bien en suspension. Durée de séparation magnétique L’attraction des billes magnétiques sur les aimants dépend de la force magnétique des aimants, de la plaque de séparation choisie, de la distance entre la plaque de séparation et les aimants ainsi que du volume présent dans les puits. La durée de récupération des billes sur les aimants doit être vérifiée et ajustée pour chaque système. Il est recommandé d’utiliser les plaques de séparation ou les tubes spécifiés par le fournisseur du séparateur magnétique. Lavage des billes Le lavage des billes peut être réalisé par agitation ou par pipetage. Contrairement au mélange par pipetages successifs, le mélange sur agitateur ou magnétique permet de mélanger simultanément tous les échantillons. Cela permet de réduire le temps et le nombre de cônes nécessaires à la préparation. La remise en suspension par pipetages successifs est cependant plus efficace que l’agitation de la plaque ou l’agitation magnétique. 10 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 Extraction d’ARN Méthode Efficacité de la remise en suspension Vitesse Nombre de cônes nécessaires Mélange magnétique + ++ Faible Agitateur ++ ++ Faible Pipetage +++ +* Haut + : acceptable, ++ : bon, +++ : excellent, * Dispositif de pipetage à 8 canaux 2.7 Procédures d’élution L’ARN purifié peut être élué directement avec le tampon d’élution MRE fourni. L’élution peut être effectuée dans un volume ≥ 50 μL. Il est essentiel de recouvrir complètement les NucleoMag® B-Beads avec le tampon d’élution MRE pendant l’étape d’élution. Le volume minimal nécessaire dépend du système de séparation magnétique (p.e., la position du culot dans les puits de la plaque de séparation). Pour une élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être entièrement remis en suspension dans le tampon d’élution MRE. Avec certains séparateurs magnétiques, le volume d’élution nécessaire pour recouvrir les billes peut être plus important. MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 11 Extraction d’ARN 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention : Les tampons MRL et MRW contiennent des sels chaotropiques ! Porter des gants et des lunettes de protection ! ATTENTION : Les tampons MRL et MRW contiennent du thiocyanate de guanidinium qui peut former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorite de sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation des échantillons. • Tous les composants du NucleoMag® RNA Pro ainsi que du NucleoMag® RNA/DNA Pro doivent être conservés à une température comprise entre 15 et 25 °C et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. • Tous les tampons sont livrés prêts à l’emploi. Avant de démarrer la procédure NucleoMag® RNA Pro / NucleoMag® RNA/DNA Pro, préparer ce qui suit : • Solution de travail de la rDNase : Ajouter 800 μL de H2O RNase-free à chaque flacon de rDNase et incuber pendant 1 min à température ambiante. Agiter doucement les flacons pour dissoudre complètement la rDNase. Veiller à ne pas mélanger vigoureusement la rDNase car elle est sensible à l’agitation mécanique. Si elle n’est pas complètement utilisée, cette solution de travail peut être conservée à -20 °C pendant au moins 6 mois. Ne pas congeler / décongeler la solution de travail de rDNase plus de trois fois. • Mélange réactionnel pour la rDNase : Ajouter 9,2 mL de tampon de réaction rDNase à 800 μL de solution de travail de la rDNase et mélanger. Le mélange réactionnel obtenu est suffisant pour 32 extractions et est à utiliser rapidement. Lors de séries inférieures à 32 échantillons, préparer un volume plus petit de mélange réactionnel. Pour chaque extraction, mélanger 276 µL de tampon de réaction et 24 µL de solution de rDNase. • Agent réducteur TCEP : ajouter 750 μL d’H2O RNase-free au flacon de TCEP et incuber pendant plusieurs minutes à 15 – 25 °C. Mélanger le flacon pour dissoudre complètement le TCEP. Conserver le TCEP dissous à -20 °C. • Le tampon de lavage DNA Wash est fourni sous forme concentrée. Pour préparer la solution finale du tampon de lavage, ajouter quatre volumes d’éthanol (50 %) au concentré de tampon DNA Wash (ajouter 48 mL d’éthanol 50 % à 12 mL de concentré du DNA Wash). • éthanol à 70 % (v/v) pour les étapes de lavage • éthanol à 100 % pour l’étape de fixation du protocole d’extraction d’ARN à partir de matériel végétal (voir paragraphe 6) 12 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 Extraction d’ARN NucleoMag® RNA Pro / NucleoMag® RNA/DNA Pro REF rDNase (lyophilisée) TCEP Tampon de lavage DNA Wash (concentré) 1 × 96 preps 744360.1 4 × 96 preps 744360.4 1 × 96 preps 744370.1 3 flacons (taille D) 12 flacons (taille D) 3 flacons (taille D) Ajouter 800 μL d’H2O RNase-free dans chaque flacon. Ajouter 800 μL d’H2O RNase-free à chaque flacon. Ajouter 800 μL d’H2O RNase-free à chaque flacon. 1 flacon (107 mg) 4 flacons (107 mg) 1 flacon (107 mg) Ajouter 750 μL d’H2O RNase-free. Ajouter 750 μL d’ H2O RNase-free à chaque flacon. Ajouter 750 μL d’H2O RNase-free. - - 2 × 12 mL Ajouter 48 mL d’éthanol (50 %) dans chaque flacon. MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 13 Extraction d’ARN 4 Instructions de sécurité Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® RNA Pro / NucleoMag® RNA/DNA Pro, portez des vêtements de protection appropriés (p.e. blouse de laboratoire, gants jetables et lunettes de protection). Pour plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds). Attention : Le thiocyanate de guanidine contenu dans les tampons de lyse MRL et MRW peut former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné à de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation d’échantillons. Les déchets générés par le kit NucleoMag® RNA Pro / NucleoMag® RNA/DNA Pro n’ont pas été testés pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est très improbable en raison du tampon de lyse fortement dénaturant, mais elle ne peut pas être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales. 4.1 Elimination des déchets Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales. 14 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 NucleoMag® RNA Pro 5 Protocole pour l’extraction d’ARN à partir de cellules et de tissus Résumé du protocole • Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les paragraphes 1.2 et 2.4, respectivement. • Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 18. Avant de débuter la procédure : • 1 Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3. Homogénéiser / lyser les échantillons Jusqu’à 20 mg de tissu ou 2 × 10⁶ cellules 350 μL MRL 6 μL TCEP Mélanger ou utiliser un broyage mécanique 2 3 Clarifier le lysat par centrifugation, transférer 350 μL de lysat clarifié dans un Square-well Block pour la suite de la procédure. Fixer les acides nucléiques aux NucleoMag® B-Beads 5 600 x g, 5 min 350 μL de lysat clarifié 20 μL NucleoMag® B-Beads 250 μL MRB Mélanger par agitation pendant 5 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages succcessifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation 4 Laver avec le tampon MRW Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 900 μL MRW MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 15 NucleoMag® RNA Pro Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation 5 Laver avec le tampon à 70 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 900 μL Ethanol 70 % Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation Sécher pendant 5 min à TA 6 Digérer l’ADN Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 300 μL de mélange réactionnel rDNase Mélanger Incuber 15 min à TA 7 Re-fixer les ARN 350 μL MRB Mélanger par agitation pendant 5 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation 16 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 NucleoMag® RNA Pro 8 Laver avec le tampon à 70 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 900 μL Éthanol 70 % Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation 9 Sécher l’échantillon Laisser le Square-well Block sur le NucleoMag® SEP Sécher à l’air 10 – 15 min à TA 10 Eluer l’ARN Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 50 – 200 μL MRE Agiter 5 – 10 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs) Séparer 2 min et transférer l’ARN dans une plaque d’élution / des tubes MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 17 NucleoMag® RNA Pro Protocole détaillé Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple, NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.4). Il est recommandé d’utiliser un Square-well Block pour la séparation (voir paragraphe 1.2). Alternativement, l’extraction de l’ARN peut être effectuée dans des tubes de réaction avec des séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de guide pour l’adaptation du kit aux instruments automatisés. Avant de débuter la procédure : • 1 Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3. Homogénéiser / lyser les échantillons Lyser jusqu’à 20 mg de tissu ou 2 × 10⁶ cellules dans 350 μL de tampon MRL + 6 µL TCEP. Pour les échantillons de tissus : utiliser un système d’homogénéisation adapté pour homogénéiser les échantillons dans le tampon MRL. Les échantillons peuvent être broyés à l’aide d’outils d’homogénéisation à billes, par exemple GenoGrinder* ou Mixer Mill MM400** (voir les recommandations du fabricant de l’instrument pour les plaques ou les tubes appropriés à l’homogénéisation) ou tout autre système d’homogénéisation approprié. Pour les cellules : ajouter le tampon MRL au culot cellulaire. Pipeter successivement plusieurs fois pour lyser les cellules. 2 Clarifier les lysats Centrifuger les échantillons pendant 5 min à pleine vitesse (5 600 – 6 000 x g). Retirer les barrettes de 8 bouchons. Transférer 350 μL du lysat clarifié dans un Square-well Block. Ne pas souiller les bords du puits. Note : Voir les recommandations concernant les plaques / tubes adaptés et les séparateurs magnétiques compatibles au paragraphe . * GenoGrinder : http://www.spexcsp.com/sampleprep/ ** Mixer Mill MM400 http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/mm-400/ 18 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 NucleoMag® RNA Pro 3 Fixier les acides nucléiques aux NucleoMag® B-Beads Ajouter 20 µL de NucleoMag® B-Beads remises en suspension et 250 µL de tampon MRB à l’échantillon lysé. Mélanger par agitation pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois et laisser incuber pendant 5 min à température ambiante. Les billes NucleoMag® B-Beads et le tampon MRB peuvent être mélangés au préalable. Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les retirer du flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à l'obtention d’une suspension homogène. Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Éliminer complètement le surnageant. Note : Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de l’aspiration du surnageant. Le culot de billes n’est pas visible à cette étape. Eliminer le surnageant en pipetant de l’autre côté du puits. 4 Laver avec le tampon MRW Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL de tampon MRW dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 5 Laver avec le tampon à 70 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL d’éthanol à 70 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Sécher les billes pendant 5 min à température ambiante. Maintenir le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour l’étape de séchage. MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 19 NucleoMag® RNA Pro 6 Digérer l’ADN Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 300 μL de mélange réactionnel rDNase et remettre les billes en suspension par pipetages successifs. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Ne pas séparer les billes ! Note : Si vous souhaitez isoler l’ARN et l’ADN dans le même éluat, il faut omettre l’étape de séchage de l’étape 5 du protocole ainsi que la digestion de l’ADN et poursuivre le protocole à l’étape 8 avec le 2ième lavage à l’éthanol 70 %. 7 Re-fixer les ARN Ajouter 350 μL tampon MRB à chaque échantillon. Mélanger par agitation pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois suivi d’une incubation pendant 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 8 Laver avec le tampon à 70 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL d’éthanol à 70 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Laisser le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour l’étape suivante. 9 Sécher l’échantillon Sécher les billes à l’air libre pendant 10 à 15 min à température ambiante. 10 Eluer l’ARN Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter le volume désiré de tampon MRE (au moins 50 μL, 50 – 200 μL) et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP . Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes soient attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ARN purifié dans une plaque de collecte appropriée (voir informations de commande, paragraphe 8.2). 20 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 NucleoMag® RNA Pro 6 Protocole pour l’extraction d’ARN à partir de matériel végétal Résumé du protocole • Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les paragraphes 1.2 et 2.4, respectivement. • Un tampon de lyse supplémentaire RL1 (REF 740385.125) est nécessaire pour l’extraction de l’ARN du matériel végétal (voir les informations de commande, paragraphe 8.2). • Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 24. Avant de débuter la procédure : • 1 Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3. Homogénéiser / lyser les échantillons Jusqu’à 40 mg de feuilles de plantes 350 μL RL1 6 μL TCEP Broyer les feuilles des plantes dans de l’azote liquide et ajouter le RL1 ou utiliser le broyage mécanique 2 3 Clarifier les lysats clarifiés par centrifugation, transférer 350 μL des lysats clarifiés dans un Square-well Block pour la suite de la procédure. Fixer les acides nucléiques aux NucleoMag® B-Beads 5 600 x g, 5 min 350 μL de lysat clarifié 20 μL NucleoMag® B-Beads 250 μL d’éthanol 100 % Mélanger par agitation pendant 5 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 21 NucleoMag® RNA Pro 4 Laver avec le tampon MRW Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 900 μL MRW Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation 5 Laver avec le tampon à 70 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 900 μL d’éthanol à 70 % Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation Sécher pendant 5 min à TA 6 Digérer l’ADN Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 300 μL de mélange réactionnel rDNase Mélanger Incuber 15 min à TA 7 22 Re-fixer l’ARN 350 μL MRB MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 NucleoMag® RNA Pro Mélanger par agitation pendant 5 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation 8 Laver avec le tampon à 70 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 900 μL d’éthanol à 70 % Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation 9 Sécher l’échantillon Laisser le Square-well Block sur le NucleoMag® SEP Sécher à l’air 10 – 15 min à TA 10 Elution de l’ARN Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 50 – 200 μL MRE Agiter 5 – 10 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs) Séparer 2 min et transférer l’ARN dans une plaque d’élution / des tubes MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 23 NucleoMag® RNA Pro Protocole détaillé Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple, NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.4). Il est recommandé d’utiliser un Square-well Block pour la séparation (voir paragraphe 1.2). Alternativement, l’extraction de l’ARN peut être effectuée dans des tubes de réaction avec des séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de guide pour l’adaptation du kit aux instruments automatisés. • Le tampon de lyse RL1 est nécessaire pour l’extraction de l’ARN du matériel végétal (voir informations de commande, paragraphe 8.2). Avant de débuter la procédure : • Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3. Homogénéiser / lyser les échantillons Lyser jusqu’à 40 mg de feuilles de plantes dans 350 μL de tampon RL1 + 6 µL de TCEP. Broyer le matériel végétal dans de l’azote liquide et mélanger soigneusement avec le tampon RL1 avant décongélation ou utiliser un système d’homogénéisation approprié pour homogénéiser les échantillons dans le tampon RL1. Les échantillons peuvent être broyés à l’aide de systèmes de broyage à billes, par exemple GenoGrinder* ou Mixer Mill MM400** (voir les recommandations du fabricant de l’instrument pour les plaques ou les tubes appropriés pour l’homogénéisation) ou tout autre système d’homogénéisation approprié. 1 Clarifer les lysats Centrifuger les échantillons pendant 5 min à pleine vitesse (5 600 – 6 000 x g). Retirer les barrettes de 8 bouchons. Transférer 350 μL du lysat clarifié dans un Square-well Block. Ne pas souiller les bords du puits. Note : Voir les recommandations concernant les plaques ou tubes appropriés et les séparateurs magnétiques compatibles au paragraphe 1.2. * GenoGrinder : http://www.spexcsp.com/sampleprep/ ** Mixer Mill MM400 http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/mm-400/ 24 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 NucleoMag® RNA/DNA Pro 2 Fixer les acides nucléiques aux NucleoMag® B-Beads Ajouter 20 μL de NucleoMag® B-Beads remises en suspension et 250 μL d’éthanol 100 % à l’échantillon lysé. Mélanger par agitation pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois suivi d’une incubation de 5 min à température ambiante. Les billes NucleoMag® B-Beads et l’éthanol peuvent être mélangés au préalable. Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les retirer du flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à lobtention d’une suspension homogène. Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Éliminer complètement le surnageant. Note : Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de l’aspiration du surnageant. Le culot de billes n’est pas visible à cette étape. Eliminer le surnageant en pipetant de l’autre côté du puits. 3 Laver avec le tampon MRW Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL de tampon MRW dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 4 Laver avec le tampon 70 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL d’éthanol à 70 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Sécher les billes pendant 5 min à température ambiante. Maintenir le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour l’étape de séchage. MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 25 NucleoMag® RNA/DNA Pro 5 Digérer l’ADN Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 300 μL de mélange réactionnel rDNase et remettre les billes en suspension par pipetages successifs. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Ne pas séparer les billes ! Note : Si vous souhaitez isoler l’ARN et l’ADN dans le même éluat, il faut omettre l’étape de séchage de l’étape 5 du protocole ainsi que la digestion de l’ADN et poursuivre le protocole à l’étape 8 avec le 2ième lavage à l’éthanol 70 %. 6 Re-fixer les ARN Ajouter 350 μL de tampon MRB à chaque échantillon. Mélanger par agitation pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois et une incubation ultérieure pendant 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 7 Laver avec le tampon à 70 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL d’éthanol à 70 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Laisser le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour l’étape suivante. 8 Sécher l’échantillon Sécher les billes à l’air libre pendant 10 à 15 min à température ambiante. 9 Eluer l’ARN Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter le volume souhaité de tampon MRE (au moins 50 μL, 50 – 200 μL) et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ARN purifié dans une plaque de collecte appropriée (voir informations de commande, paragraphe 8.2). 26 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 NucleoMag® RNA/DNA Pro 7 Protocole pour l’extraction de l’ARN et de l’ADN dans des éluats séparés Résumé du protocole • Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les paragraphes 1.2 et 2.4, respectivement. • Le kit NucleoMag® RNA/DNA Pro (744370.1) ou le kit NucleoMag® RNA Pro en combinaison avec le kit NucleoSpin® RNA/DNA Buffer (REF 740944) est nécessaire pour réaliser le protocole (voir les informations de commande, paragraphe 8.2). • Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 28. Avant de débuter la procédure : • Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3. • Préparer le tampon de lavage DNA Wash conformément au chapitre 3 du manuel. A Homogénéiser / lyser des échantillons / 1er lavage Effectuer le protocole d’extraction de l’ARN à partir de cellules, de tissus ou de matériel végétal jusqu’à l’étape 4, laver avec le tampon MRW. Laver avec le tampon de lavage DNA Wash Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 900 μL de tampon DNA Wash Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs). Retirer le surnageant après 2 min de séparation B Sécher l’échantillon Laisser le Square-well Block sur NucleoMag® SEP Sécher à l’air 10 – 15 min à TA MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 27 NucleoMag® RNA Pro C Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP Eluer l’ADN 100 μL de tampon DNA Elute Agiter 5 – 10 min à TA (Optionnel : Mélanger par pipetages successifs) Séparer 2 min et transférer l’ADN dans une plaque d’élution / des tubes Digérer l’ADN / Refixer les ARN / 3ème lavage / Eluer l’ARN Poursuivre le protocole d’extraction de l’ARN à partir de cellules et de tissus ou de matériel végétal avec l’étape 6, Digérer l’ADN. Protocole détaillé Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple, NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.4). Il est recommandé d’utiliser un Square-well Block pour la séparation (voir paragraphe 1.2). Alternativement, l’extraction de l’ARN peut être effectuée dans des tubes de réaction avec des séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de guide pour l’adaptation du kit aux instruments automatisés. • Le kit NucleoMag® RNA/DNA Pro (744370.1) ou le kit NucleoMag® RNA Pro en combinaison avec le kit NucleoSpin® RNA/DNA Buffer (REF 740944) est nécessaire pour réaliser le protocole (voir les informations de commande, paragraphe 8.2). Avant de débuter la procédure : • Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3. • Préparer le tampon de lavage DNA Wash conformément au chapitre 3 du manuel. Homogénéiser / lyser les échantillons / Clarifier les lysats / Fixer les acides nucléiques aux NucleoMag® B-Beads / Laver avec le tampon MRW Suivre le protocole pour l’extraction d’ARN à partir de cellules et de tissus (paragraphe 5) ou de matériel végétal (paragraphe 6) pour les quatre premières étapes du protocole. Effectuer ensuite les trois étapes A à C suivantes pour extraire dans un premier temps l’ADN. 28 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 NucleoMag® RNA Pro A Laver avec le tampon DNA Wash Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL de tampon de lavage DNA Wash dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. B Sécher l’échantillon Sécher les billes à l’air libre pendant 10 à 15 min à température ambiante. C Eluer l’ADN Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 100 µL de tampon d’élution DNA Wash et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par des pipetages successifs (15 fois). Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ADN purifié dans une plaque de collecte appropriée (voir informations de commande, paragraphe 8.2). Digérer l’ADN / Re-fixer les ARN / 3ème lavage / Eluer l’ARN Procéder au protocole respectif pour l’extraction de l’ARN à partir de cellules et de tissus (paragraphe 5) ou de matériel végétal (paragraphe 6) avec l’étape de digestion de l’ADN (étape 6) et exécuter la suite du protocole sans aucune modification supplémentaire. MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 29 Extraction d’ARN 8 Annexes 8.1 Guide de résolution des problèmes Problème Causes possibles et suggestions Contamination par des RNases ARN dégradé / Rendement en ARN nul • Créer un environnement de travail exempt de RNases. Porter des gants pendant toutes les étapes de la procédure. Changer de gants fréquemment. Il est recommandé d’utiliser des tubes ou des plaques en polypropylène stériles et jetables. Les éventuels contenants en verre devront avoir été autoclavés pendant au moins 2 heures à 250 °C avant utilisation. Volume de tampon d’élution insuffisant • Le culot des billes doit être entièrement recouvert de tampon d’élution. Performance insuffisante du tampon d’élution pendant l’étape d’élution. • Faible rendement en ARN Éliminer complètement les tampons résiduels provenant des étapes de séparation. Les tampons résiduels diminuent l’efficacité des étapes de lavage et d’élution suivantes. Séchage excessif des billes • Ne pas laisser sécher les billes, car cela pourrait entraîner une baisse de l’efficacité de l’élution. Aspiration d’une partie des billes présents sur l’aimant • Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de l’élimination du surnageant, en particulier lorsque le culot de billes magnétiques n’est pas visible dans le lysat. Aspiration et perte de billes • Durée de séparation magnétique trop courte ou vitesse d’aspiration trop élevée. Procédure de lavage insuffisante • Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de séparateur et de plaque, par exemple le Square-well Block en combinaison avec le NucleoMag® SEP. • S’assurer que les billes sont remises en suspension complètement pendant la procédure de lavage. Si l’agitation ne suffit pas à remettre complètement les billes en suspension, mélanger grâce à des pipetages successifs. Pureté insuffisante 30 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 Extraction d’ARN Problème Causes possibles et suggestions Contamination par de l’éthanol Faible performance • Veillez à éliminer toute la solution de lavage éthanolique, car de l’ARN dans les l’éthanol résiduel interfère avec les applications avales. applications en Pureté insuffisante aval • Voir ci-dessus. Durée de séparation magnétique trop courte • Perte des billes Augmenter la durée de séparation pour permettre aux billes d’être complètement attirées par les aimants avant d’aspirer tout liquide du puits. Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution) • Une vitesse d’aspiration élevée pendant l’étape d’élution peut entraîner une perte des billes. Réduire la vitesse d’aspiration pour l’étape d’élution. Contaminations des parties supérieures des puits Contamination croisée • Ne pas souiller les bords du Square-well Block lors du transfert du lysat tissulaire. Si le bord des puits est contaminé, sceller le Square-well Block avec une feuille PE auto-adhésive (voir informations de commande, paragraphe 8.2) avant de mettre l’agitateur en marche. MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 31 Extraction d’ARN 8.2 Informations de commande Produit REF Conditionnement NucleoMag RNA Pro 744360.1 744360.4 1 × 96 preps 4 × 96 preps NucleoMag® RNA/DNA Pro 744370.1 1 × 96 preps NucleoMag SEP 744900 1 Square-well Blocks 740481.4 740481.24 4 24 Film PE auto-adhésif 740676 50 feuilles Rack of Tube Strips (le kit comprend 1 Rack, 12 barrettes de 8 bouchons chacune et des Cap Strips) 740477.4 740477.24 4 sets 24 sets Cap Strips (barrettes de 8 bouchons) 740638 30 barrettes 96 Deep-well plates pour systèmes à barreaux magnétiques 744955 25 8-well Tip Combs pour systèmes à barreaux magnétiques 744960 50 8-well Accessory Kit pour systèmes à barreaux magnétiques 744961 1 sets 744951 1 sets NucleoSpin® DNA/RNA Buffer Set 740994 100 preps Tampon de lyse RL1 740385.125 125 mL ® ® Pour l’utilisation du kit sur l’instrument KingFisher® Flex : p.e., KingFisher® Accessory Kit B Square-well Blocks, Deep-well tip combs, plaques d’élution pour 4 × 96 NucleoMag® RNA preps Visitez le site www.mn-net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit. 32 MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 Extraction d’ARN 8.3 Restrictions d’utilisation du produit / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04 Veuillez contacter : MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tél : +49 24 21 969 333 [email protected] 8.4 Versions linguistiques et prédominance Ce document est disponible en plusieurs langues. En cas de divergence ou de problème d’interprétation, la version anglaise prévaut. Marques déposées : KingFisher est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific. NucleoMag® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Te-MagS est une marque déposée de Tecan Group Ltd. Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur fonctionnement. MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02 33 Plasmid DNA Clean up RNA DNA Viral RNA and DNA Protein High throughput Accessories Auxiliary tools www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 [email protected] CH +41 62 388 55 00 [email protected] FR +33 388 68 22 68 [email protected] US +1 888 321 62 24 [email protected] ">
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