Macherey-Nagel NucleoMag RNA kit Mode d'emploi

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Macherey-Nagel NucleoMag RNA kit Mode d'emploi | Fixfr
MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
Manuel
d’utilisation
User manual
Extraction d‘ARN
n NucleoMag® RNA
Mars 2024 / Rev. 07
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Extraction d‘ARN
Sommaire
1
2
3
4
5
6
Composition du kit
4
1.1 Composants
4
1.2 Equipement et consommables nécessaires
5
1.3 A propos de ce manuel
5
Description du kit
6
2.1 Principe général
6
2.2 Caractéristiques du kit
6
2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons biologiques
7
2.4 Système de séparation magnétique
7
2.5 Réglage de l’agitateur
8
2.6 Manipulation des billes
8
2.7 Procédures d’élution
9
Conditions de stockage et préparation des réactifs
10
Instructions de sécurité
11
4.1 Elimination
11
Protocole pour l’extraction d’ARN
12
Annexes
18
6.1 Guide de résolution des problèmes
18
6.2 Informations de commande
20
6.3 Restrictions d’utilisation / ​garantie
21
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
3
Extraction d‘ARN
1
Composition du kit
1.1
Composants
NucleoMag® RNA
REF
1 × 96 preps
744350.1
4 × 96 preps
744350.4
NucleoMag® B-Beads
2 × 1.5 mL
12 mL
Tampon de lyse MR1
60 mL
250 mL
Tampon de fixation MR2
80 mL
400 mL
Tampon de lavage MR3
80 mL
320 mL
Tampon de lavage MR4
250 mL
1000 mL
Tampon d’élution MR5*
30 mL
125 mL
Agent réducteur TCEP
1 flacon
(107 mg / flacon)
4 flacons
(107 mg / flacon)
rDNase, lyophilisée**
3 flacons (dimension D)
12 flacons (dimension D)
Tampon de réaction de la
rDNase
30 mL
2 × 60 mL
H2O RNase-free
13 mL
30 mL
1
1
Brochure d’utilisation
* Tampon d’élution MR5: H2O RNase-free
** Pour la préparation des solutions et les conditions de stockage, voir chapitre 3.
4
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
Extraction d‘ARN
1.2
Equipement et consommables nécessaires
Produit
REF
Conditionnement
•
Système de séparation magnétique
Ex: NucleoMag® SEP (voir chapitre 2.3)
744900
1
•
Plaques de séparation des billes magnétiques,
Ex : Square-well Block (blocs 96 puits carrés de
2,1 mL)
740481
740481.24
4
24
•
Tubes de lyse pour l’incubation des
échantillons et la lyse,
ex: Rack de barrettes ’Tube Strips’ (1 set
comprend 1 support, 12 barrettes de 8 tubes
(1,2 mL) et 12 barrettes de bouchons.
740477
740477.24
4 sets
24 sets
•
Plaques d’élution pour collecter les acides
nucléiques purifiés,
ex: Plaque d’élution ’fond en U’ (96 puits de
0,3 mL)
ex: Plaque d’élution à fond plat (96 puits de
0,3 mL)
740486.24
24
740673
20
•
1.3
Pour utilisation du kit sur KingFisher® Flex,
744951
Set d’accessoires ’KingFisher® Accessory Kit B’
(Blocs 96 puits, Tip combs, Plaques d’élution pour
4 × 96 preps NucleoMag® RNA sur KingFisher®
Flex)
1 set
A propos de ce manuel
Nous recommandons vivement la lecture du protocole détaillé aux nouveaux utilisateurs du kit
NucleoMag® RNA. Les utilisateurs expérimentés, quant à eux, pourront utiliser le résumé du
protocole. Ce dernier est conçu pour un suivi rapide des différentes étapes de la procédure.
Toute la documentation technique est disponible sur notre site internet www.mn‑net.com.
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
5
Extraction d‘ARN
2
Description du kit
2.1
Principe général
La procédure NucleoMag® RNA est basée sur l’adsorption réversibles des acides nucléiques
sur les billes paramagnétiques en présence des tampons adéquats. La lyse de l'échantillon est
menée lors de son homogénéisation dans une solution contenant des ions chaotropiques. Pour
créer les conditions de fixation des acides nucléiques aux billes paramagnétiques, le tampon
MR2 et les billes NucleoMag® B-Beads sont ajoutés au lysat. Après séparation magnétique,
les billes sont incubées dans une solution de DNase recombinante pour l’élimination de l’ADN
également fixé. Après une nouvelle étape de fixation de l’ARN aux billes, les contaminants et
les sels sont éliminés avec les tampons de lavage MR3 et MR4. L’éthanol résiduel issu de ces
étapes est éliminé lors d’une étape de séchage. Pour finir, l’ARN hautement purifié est élué dans
le tampon d’élution MR5 et peut être directement utilisés pour les applications avales. Le kit
NucleoMag® RNA est utilisable manuellement ou sur divers automates de pipetage ou divers
séparateurs magnétiques automatisé.
Nous pouvons fournir une assistance personnalisée, des informations sur les protocoles ou des
scripts validés pour de nombreuses plates-formes. Pour plus d'informations, veuillez contacter
notre service d'assistance technique ou consulter notre site www.mn-net.com/automation.
2.2
Caractéristiques du kit
Le kit NucleoMag® RNA est conçu pour la préparation rapide, manuelle et automatisée d’ARN
hautement pur à partir de 20 mg de tissu ou de 2 × 106 de cellules. Le kit est conçu pour
une utilisation avec le séparateur magnétique pour plaques 96 puits NucleoMag® SEP (voir
’Informations de commande, chapitre 6.2) ou d’autres systèmes de séparation magnétique
(voir chapitre 2.3). La durée de la procédure manuelle pour 96 échantillons est d’environ
120 minutes. L’ARN purifié peut être utilisé directement pour les applications comme les RTPCR ou tout autre type de réaction enzymatique.
Uniquement pour la recherche.
Grâce à la DNase recombinante incluse dans le kit, l’ARN est considéré comme quasiment
exempt d’ADN.
Le kit NucleoMag® RNA est aisément automatisable sur les plateformes courantes de
manipulation de liquides ou sur les séparateurs magnétiques, comme par exemple les
KingFisher® de Thermo Fisher Scientific. La durée de la procédure dépend de la configuration
de l’instrument utilisé. En général, 96 échantillons peuvent être extraits en moins de 120 minutes
lors de l’utilisation du NucleoMag® SEP sur un robot pipeteur.
Le kit comprend tous les réactifs pour extraire jusqu’à 30 μg d’ARN purifié. En fonction du
volume d’élution, des concentrations de 10 – 30 ng/μL sont obtenues.
Le kit NucleoMag® RNA est entièrement utilisable à température ambiante.
Les NucleoMag® B-Beads sont des billes superparamagnétiques hautement réactives. La
capacité de fixation est d’environ 0,4 μg d’ARN pour 1 μL de suspension de billes NucleoMag®
B-Bead. 1 μL de suspension contient 130 μg de billes.
Pour plus d’informations, visitez notre site web :
www.mn-net.com/bioanalytik/htp-information
6
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
Extraction d‘ARN
Chez MN, nous vous proposons des scripts pour différentes plateformes. Il vous suffit de
nous contacter et nous vous ferons suivre le script. Si vous êtes à la recherche de solutions
plus personnalisées, nous pourrons également vous aider. Contactez-nous et nous ferons de
l’automatisation pour vous une expérience agréable grâce à notre soutien.
2.3
Manipulation, préparation et stockage des échantillons
biologiques
Environnement de travail
Maintenir un environnement de travail exempt de RNase. Portez des gants à tout moment
pendant la préparation. Changez fréquemment de gants.
Stockage des échantillons et inhibition des RNase
•
Les RNases peuvent rapidement dégrader l’ARN des échantillons si ceux-ci ne sont
pas protégés de l’activité des RNases après la récolte. Les méthodes suivantes sont
recommandées pour éviter la dégradation de l’ARN :
•
Utiliser un échantillon fraîchement récolté pour une lyse et une purification immédiate de
l’ARN.
•
Submerger et conserver les échantillons dans des solutions de stabilisation
NucleoProtect® RNA ou similaires. Veillez à ce que l’échantillon soit complètement
imprégné de la solution de stabilisation avant de le congeler. Retirez l’excès de solution de
stabilisation de l’échantillon avant d’extraire l’ARN conformément au manuel d’utilisation
de la solution de stabilisation.
•
Congeler l’échantillon dans de l'azote liquide immédiatement après la récolte et
conservez-le à -70 °C. Les échantillons ainsi congelés sont stables jusqu’à 6 mois. Un
mortier et un pilon peuvent être utilisés pour pulvériser l’échantillon à l’état congelé.
S’assurer que l’échantillon ne décongèle pas avant d’être repris dans le tampon de lyse.
•
Conserver les échantillons dans le tampon de lyse MR1 après broyage à -70 °C jusqu’à
un an, à 4 °C pour maximum 24 heures ou à température ambiante pendant quelques
heures. Les échantillons congelés dans le tampon de lyse MR1 doivent être décongelés
lentement avant de commencer l’extraction des ARN.
2.4
Système de séparation magnétique
Pour utiliser le NucleoMag® RNA, nous recommandons le séparateur magnétique NucleoMag®
SEP. La séparation s’effectue dans un bloc 96 puits carrés (voir ’Informations de commande’
chapitre 6.2). Le kit peut aussi être utilisé avec d’autres séparateurs magnétiques. Consulter les
informations du fabricant pour connaître les plaques de séparation appropriées.
Séparateur magnétique
Plaque ou tube de séparation
NucleoMag® SEP (MN REF 744900)
Bloc 96 puits carrés (MN REF 740481/.24)
Tecan Te-MagS™
Tubes 1.5 mL sans bouchons (Sarstedt)
Séparation à aimants statiques
Les séparateurs à aimants statiques, par exemple notre NucleoMag® SEP (utilisation manuelle
ou sur robot pipeteur), sont recommandés en association avec un agitateur à plaques pour
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
7
Extraction d‘ARN
une resuspension optimale des billes lors des étapes de lavage et d’élution. Alternativement,
les billes peuvent être resuspendues dans les tampons par plusieurs cycles d’aspiration / ​
refoulement. Pour une automatisation totale de la procédure sur un automate de pipetage,
un bras ’gripper’ est nécessaire pour le transfert des plaques de séparation de l’aimant vers
l’agitateur et inversement.
Systèmes à aimants mobiles
Les séparateurs à aimants mobiles font bouger les aimants d’un côté à l’autre des puits,
entrainant ainsi les billes à travers les solutions de lavage et d’élution. La séparation magnétique
a lieu lors de l’arrêt des aimants.
Séparateurs automatisés
Ces séparateurs transfèrent les billes dans les différents tubes ou plaques. Les billes sont
resuspendues par rétractation des aimants à l’intérieur de leur protection. Après chaque étape
de fixation, de lavage ou d’élution, les billes sont collectées et transportées dans le tube ou
plaque correspondant à la solution suivante.
2.5
Réglage de l’agitateur
Lors de l’utilisation d’un agitateur à plaques pour les étapes de lavages et d’élution, les
paramètres d’agitation doivent être ajustés précautionneusement afin de garantir la bonne
resuspension des billes tout en évitant tout risque de contaminations croisées.
Réglage de l’agitation pour les étapes de lavages :
•
Déposer 900 µL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque
sur l’agitateur et lancer l’agitation à vitesse modérée pendant 30 secondes. Stopper et
vérifier l’absence de projections.
•
Augmenter la vitesse d’agitation sur une durée de 30 secondes supplémentaire et vérifier
l’absence de projections.
•
Continuer à augmenter la vitesse d’agitation jusqu’à observer des projections sur le
dessus de la plaque de séparation. Réduire ensuite progressivement la vitesse, vérifier
l’absence de projections et utiliser ce réglage pour les étapes de lavages.
Réglage de l’agitation pour l’étape d’élution :
•
Déposer 100 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation et procéder
comme mentionné ci-dessus.
2.6
Manipulation des billes
Distribution des billes
Une distribution homogène des billes dans les puits de la plaque de séparation est essentielle
pour une bonne reproductibilité. Avant de distribuer les billes, veiller à bien les resuspendre.
Agiter le flacon ou placer le sur un vortex brièvement. Le mélange préliminaire des billes
magnétiques avec le tampon de fixation permet une distribution plus homogène des billes dans
les différents puits de la plaque de séparation. Lors de l’automatisation, une étape de mélange
des billes et du tampon de fixation dans les réservoirs avant leur distribution dans les plaques
de séparation est recommandée afin de s’assurer que les billes demeurent bien en suspension.
8
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
Extraction d‘ARN
Durée de séparation magnétique
L’attraction des billes magnétiques par les aimants dépend de la force de l’aimant, du type de
plaque de séparation utilisé, de la distance entre les parois des puits et les aimants ainsi que
du volume présent dans les puits. Les temps d’aimantation des billes doivent être ajustés en
fonction de chaque système. Il est recommandé d’utiliser des plaques ou tubes de séparation
validés pour le type de séparateur magnétique utilisé.
Lavages des billes
Le lavage des billes est effectué par agitation ou pipetage. Contrairement au pipetage, l’agitation
permet la resuspension des billes dans tous les puits simultanément. Ceci permet de réduire
le temps de la procédure et le nombre de cônes nécessaires. Cependant, la resuspension par
pipetage est plus efficace que l’agitation de la plaque ou l’agitation magnétique.
Méthode
Efficacité de
resuspension
Rapidité
Nombre de cônes
Magnétique
+
++
Faible
Agitateur
++
++
Faible
Pipetage
+++
+*
Elevé
+: acceptable, ++: bon, +++: excellent, * Pipette 8-caneaux
2.7
Procédures d’élution
L’ARN purifié peut être élué directement dans le tampon d’élution MR5 fourni. L’élution
s’effectue dans un volume ≥ 50 μL. Il est essentiel que les billes NucleoMag® B-Beads soient
totalement recouvertes par le tampon d’élution. Le volume minimal nécessaire dépend du
système de séparation magnétique (ex : la position des culots de billes dans les puits de la
plaque de séparation). Pour une élution efficace, les culots de billes magnétiques doivent être
totalement resuspendues dans le tampon MR5. Avec certains séparateurs magnétiques, le
volume d’élution nécessaire pour recouvrir les billes peut être plus important.
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
9
Extraction d‘ARN
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention: les tampons MR1 et MR3
Porter des gants et des lunettes de protection !
contiennent
des
sels
chaotropiques !
ATTENTION: les tampons MR1 et MR3 contiennent du thiocyanate de guanidine, pouvant
former des composants hautement réactifs en présence d’eau de Javel (hypochlorite de
sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou des solutions acides dans les déchets liquides issus
de la procédure.
•
Tous les composants du kit NucleoMag® RNA doivent être conservés à température
ambiante (15 – 25 °C) et sont stables : voir l’étiquette sur le kit.
•
Tous les tampons sont fournis prêt à l’emploi.
Avant de démarrer la procédure NucleoMag® RNA, préparer:
•
Solution de rDNase : Ajouter 800 μL d’H2O RNase-free dans chaque flacon de rDNase
et incuber pendant 1 min à température ambiante. Retourner doucement le flacon pour
dissoudre complètement l’enzyme. Veiller à ne pas mélanger vigoureusement car la
rDNase est sensible à l’agitation mécanique. Cette solution peut être conservée à -20 °C
pendant au moins 6 mois. Ne pas congeler / ​décongeler plus de trois fois la solution.
•
Mélange réactionnel de rDNase : Ajouter 9.2 mL de tampon de réaction pour
rDNase à 800 μL de solution de rDNase et mélanger. Le mélange réactionnel obtenu
est suffisant pour 32 extractions et est à utiliser rapidement. Lors de séries inférieures
à 32 échantillons, préparer un volume plus petit de mélange réactionnel. Pour chaque
extraction, mélanger 276 µL de tampon de réaction et 24 µL de solution de rDNase.
•
Agent réducteur TCEP : Ajouter 750 μL d’H2O RNase-free dans le flacon de TCEP
et incuber pendant plusieurs minutes à température ambiante. Agiter le flacon pour
dissoudre le TCEP dans l’eau et incuber pendant plusieurs minutes à température
ambiante. Stocker la solution de TCEP à -20 °C.
NucleoMag® RNA
REF
rDNase (lyophilisée)
TCEP
10
1 × 96 preps
744350.1
4 × 96 preps
744350.4
3 flacons (dimension D)
12 flacons (dimension D)
Ajouter 800 μL H2O RNasefree dans chaque flacon
Ajouter 800 μL H2O RNasefree dans chaque flacon
1 flacon (107 mg)
4 flacons (107 mg/flacon)
Ajouter 750 µL d’H2O RNasefree
Ajouter 750 μL d’H2O RNasefree dans chaque flacon
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
Extraction d‘ARN
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® RNA, portez des vêtements de protection
appropriés (par exemple, une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de
protection).
Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées (FDS
disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds).
Attention : Le thiocyanate de guanidine dans les tampons MR1 et MR3 peuvent former des
composés hautement réactifs lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de Javel ! Par conséquent,
n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement dans les déchets liquides issus
de la procédure.
Les déchets générés par le kit NucleoMag® RNA n’ont pas été testés pour la présence de
matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux
résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement dénaturant et du
traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les
déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés
conformément aux réglementations de sécurité locales.
4.1
Elimination
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
11
Extraction d‘ARN
5
Protocole pour l’extraction d’ARN
Résumé du protocole
•
A propos du matériel et de l’équipement nécessaires, voir les chapitres 1.2 et 2.3.
•
Pour des informations sur chaque étape, voir page 18.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier que la rDNase a bien été préparé selon les recommandations du chapitre 3.
Homogénéisation / ​lyse
des échantillons
Jusqu’à 20 mg de tissus
ou 2 × 10⁶ cellules
350 μL MR1
6 μL TCEP
Mélanger ou broyer
mécaniquement
2
3
Clarification des lysats
par centrifugation, et
transférer 350 μL de
lysat clarifié dans un bloc
96 puits carrés
Fixation de l’ARN aux
billes NucleoMag®
B-Beads
5,600 x g,
5 min
350 μL de lysat clarifié
28 μL NucleoMag® B-Beads
350 μL MR2
Mélanger par agitation
5 min à TA (Option: Mélanger par
pipetage)
Prélever le surnageant après
2 min de séparation
Sécher 5 min à TA
4
Digestion de l’ADN
Enlever le bloc 96 puits
NucleoMag® SEP
du
300 μL de mélange réactionnel
rDNase
Mélanger
Incuber 15 min à TA
12
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
Extraction d‘ARN
5
Refixation de l’ADN
350 μL MR2
Mélanger par agitation
à TA
(Option: Mélanger par pipetage)
Eliminer le surnageant après
2 min de séparation
6
Lavage MR3
Enlever le bloc du NucleoMag®
SEP
600 μL MR3
Resuspension : agiter 5 min à TA
(Option : Mélanger par pipetage)
Eliminer le surnageant
après 2 min de séparation
7
Lavage MR4 (1er)
Enlever le bloc du NucleoMag®
SEP
900 μL MR4
Resuspension : agiter 5 min à TA
(Option: Mélanger par pipetage)
Eliminer le surnageant après
2 min de séparation
8
Lavage MR4 (2ième)
Enlever le bloc du NucleoMag®
SEP
900 μL MR4
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
13
NucleoMag® RNA
Resuspension : agiter 5 min à TA
(Option: Mélanger par pipetage)
Eliminer le surnageant après
2 min de séparation
9
Séchage
Laisser le bloc sur le NucleoMag®
SEP
Sécher à l’air 10 – 15 min à TA
10
Elution de l’ARN
Enlever le bloc du NucleoMag®
SEP
50‑200 μL MR5
Agiter 5 – 10 min à TA
(Option : Mélanger par pipetage)
Séparer les billes pendant 2 min
et transférer l’ARN dans une
plaque / ​des tubes d’élution
14
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 07
NucleoMag® RNA
Protocole détaillée
Ce protocole décrit la procédure utilisant un séparateur magnétique à aimants fixes (ex:
NucleoMag® SEP) associé à un agitateur de plaque adéquat (voir paragraphe 2.3). Il est
recommandé d’utiliser les bloc 96 puits carrés ’Square-well Block” pour les étapes de
séparation magnétique (voir paragraphe 1.2). Autrement, l’extraction de l’ARN est réalisable en
tubes avec un séparateur approprié. Ce protocole détaille la procédure manuelle et peut servir
de guide pour l’automatisation du kit.
Avant de débuter la préparation:
•
1
Vérifier que la rDNase a bien été préparée selon les recommandations du chapitre 3.
Homogénéisation / ​lyse des échantillons
Lyser jusqu’à 20 mg de tissus ou 2 × 10⁶ cellules dans 350 μL de tampon
MR1 + 6 μL TCEP.
Pour les échantillons de tissus : utiliser un système de broyage approprié pour
homogénéiser les échantillons dans le tampon MR1. Les échantillons peuvent être
par exemple broyés au moyen d’un système à billes, par ex: GenoGrinder* ou Mixer
Mill MM400** (voir les recommandations du fabricant à propos des tubes et plaques
compatibles), ou tout autre système de broyage similaire.
Pour les cellules : Ajouter le tampon MR1 sur le culot de cellules. Mélanger par plusieurs
cycles de pipetage pour lyser les cellules.
Option : utiliser les colonnes NucleoSpin® Filters ou les plaques NucleoSpin® RNA
Filter Plates (voir paragraphe 6.2) ou encore une seringue pour réduire la viscosité du
lysat. Transférer le lysat dans un bloc 96 puits carrés pour la suite de la procédure.
2
Clarification des lysats
Centrifuger les échantillons pendant 5 min à vitesse élevée (5,600 – 6,000 x g).
Enlever les barrettes de bouchons.
Transférer 350 μL de lysat clarifié dans un bloc 96 puits carrés. Veiller à ne pas
contaminer les bords des puits pour éviter tout risque de contaminations croisées.
Note: consulter nos recommandations à propos des différentes plaques ou tubes
utilisables et leur compatibilité avec les séparateurs magnétiques (voir paragraphe 1.2).
En option : les colonnes NucleoSpin® Filter ou les plaques NucleoSpin® RNA Filter
Plates peuvent être utilisés pour clarifier les lysats (voir paragraphe 6.2). Transférer les
surnageants limpides dans les puits du bloc 96 puits carrés (voir paragraphe 6.2) pour
la suite de la procédure.
* GenoGrinder: http://www.spexcsp.com/sampleprep/
** Mixer Mill MM400 http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/mm-400/
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 07
15
NucleoMag® RNA
3
Fixation de l’ARN aux billes NucleoMag® B-Beads
Ajouter 28 μL de suspension de billes NucleoMag® B-Beads et 350 μL de tampon
MR2 aux lysats. Mélanger en agitant pendant 5 min à température ambiante ou en
pipetant le mélange au moins 6 fois, puis en incubant à TA pendant 5 minutes. Les
billes NucleoMag® B-Beads et le tampon MR2 peuvent être mélangés au préalable.
Veiller à bien resuspendre les billes NucleoMag® B-Beads avant de les prélever dans le
flacon. Vortexer brièvement le flacon afin d’obtenir une suspension de billes homogène.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc sur le séparateur magnétique
NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min afin que toutes les billes aient été attirées
vers les aimants. Retirer et jeter le surnageant par pipetage en veillant d’éliminer la
totalité du surnageant.
Note: ne pas perturber les culots de billes pendant l’aspiration des surnageants. Les
culots de billes magnétiques ne sont pas visibles à cette étape. Pipeter le surnageants
du côté opposé des puits.
Sécher les billes pendant 5 min à température ambiante. Conserver le bloc sur le
séparateur NucleoMag® SEP pendant l’étape de séchage.
4
Digestion de l’ADN
Enlever le bloc du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 300 μL de
mélange réactionnel de rDNase et resuspendre les billes par pipetage. Incuber
pendant 15 min à température ambiante. Garder les billes en suspension !
5
Refixation de l’ARN
Ajouter 350 μL de tampon MR2 à chaque échantillon. Mélanger par agitation
pendant 5 min à température ambiante ou en pipetant au moins 6 fois puis incuber
5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques contre les parois des puits en plaçant le bloc sur le
séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que
toutes les billes soient attirées par les aimants. Retirer et jeter les surnageants.
6
Lavage MR3
Enlever le bloc 96 puits du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 μL de tampon MR3 dans chacun des puits et resuspendre totalement
les billes par agitation (5 min). Alternativement, resuspendre les billes par pipetage (15
fois). Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc sur le séparateur magnétique
NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes soient
attirées par les aimants. Retirer et jeter les surnageants.
16
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 07
NucleoMag® RNA
7
1ier lavage MR4
Enlever le bloc 96 puits du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL de tampon MR4 dans chacun des puits et resuspendre totalement
les billes par agitation (5 min). Alternativement, resuspendre les billes par pipetage (15
fois). Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc sur le séparateur magnétique
NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes soient
attirées par les aimants. Retirer et jeter les surnageants.emove the Square-well Block
from the NucleoMag® SEP magnetic separator.
8
2ième lavage MR4
Répéter le lavage précédent avec 900 μL de tampon MR4. Laisser le bloc sur le
séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour la prochaine étape.
9
Séchage
Sécher les billes à l’air libre pendant 10 – 15 min à température ambiante.
10
Elution de l’ARN
Enlever le bloc 96 puits du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter le volume adéquat de tampon MR5 (au moins 50 μL, 50 – 200 μL) et
resuspendre les billes par agitation jusqu’à resuspension totale de toutes les billes
(5 min). Alternativement, resuspendre les billes par pipetage (15 fois).
Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc sur le séparateur magnétique
NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes soient
attirées par les aimants. Transférer les surnageants contenant l’ARN purifié dans un
tube ou une plaque de collecte appropriée (voir paragraphe 6.2).
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 07
17
NucleoMag® RNA
6
Annexes
6.1
Guide de résolution des problèmes
Problèmes
Causes possible et suggestions
Contamination par des RNases
•
ARN dégradé / ​
Aucun ARN obtenu
Créer un environnement de travail exempt de RNases. Porter
des gants pendant toutes les étapes de la procédure. Changer
de gants fréquemment. L'utilisation de consommables stériles,
de tubes ou de plaques en polypropylène est recommandé. Les
contenants en verre doivent avoir été autoclavés pendant au
moins 2 h à 250 °C avant utilisation.
Volume de tampon d’élution insuffisant
•
Les culots de billes doivent être totalement recouverts par le
tampon d’élution.
Performance insuffisante du tampon d’élution
•
Eliminer complètement les tampons résiduels à chaque étape
de séparation. Les tampons résiduels diminuent l’efficacité des
étapes de lavages et d’élution.
Billes séchées excessivement
Rendement faible
•
Ne pas laisser les billes sécher excessivement, l’efficacité de
l’élution en serait impactée.
Aspiration du culot de billes présents sur l’aimant
•
Ne pas perturber les culots de billes sur l’aimant lors de
l’aspiration des surnageants, en particulier lors de la première
séparation lorsque les culots ne sont pas visibles dans les lysats.
Aspiration et perte de billes
•
Le temps de séparation magnétique est trop court ou la vitesse
d’aspiration trop élevée lors du pipetage des liquides.
Procédure de lavage insuffisante
•
Utiliser uniquement des plaques ou tubes recommandés pour
les séparateurs magnétiques, par exemple les blocs 96 puits
carrés ’Square-well Block’ en association avec le séparateur
NucleoMag® SEP.
•
Veiller à resuspendre totalement les billes pendant les lavages. Si
l’agitation est insuffisante, mélanger par pipetage.
Pureté faible
18
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 07
NucleoMag® RNA
Problèmes
Causes possible et suggestions
Contamination par de l’éthanol des tampons de lavage
Performance
insuffisante de
l’ARN dans les
applications avales
•
Eliminer complètement les solutions de lavage après les
séparations, l’éthanol impacte négativement les applications.
Pureté insuffisante
•
Voir ci-dessus.
Durée de séparation magnétique insuffisante
•
Perte de billes
Augmenter le temps de séparation pour permettre aux billes
d’être attirées totalement par les aimants avant d’aspirer le liquide
contenu dans les puits.
Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution)
•
Une vitesse d’aspiration trop élevée pendant l’élution peut induire
une perte de billes. Réduire la vitesse d’aspiration pour l’étape
d’élution.
Contamination des parois
Contaminations
croisées
•
Ne pas contaminer le haut des parois des puits du bloc lors du
transfert des lysats. Si le haut des puits est contaminé, sceller le
bloc avec un film adhésif en PE (voir paragraphe 6.2) avant de
débuter l’agitation.
MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 07
19
Extraction d‘ARN
6.2
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
744350.1
1 × 96 preps
744350.4
4 × 96 preps
NucleoSpin Filters
740606
50
NucleoSpin® RNA Filter Plates
740711
4
NucleoMag® SEP
744900
1
Square-well Blocks
740481.4
4
24
®
NucleoMag RNA
®
740481.24
Films adhésifs en PE
740676
50 feuilles
Rack de barrettes de tubes ’Tube Strips’
(set contenant: 1 rack, 12 barrettes de 8 tubes, et
12 barrettes bouchons)
740477.4
740477.24
4 sets
24 sets
Barrettes de bouchons
740638
30 barrettes
Pour utilisation de l’instrument KingFisher® Flex :
Ex: set d’accessoires ’KingFisher® Accessory Kit B’ 744951
Blocs 96 puits, tip combs, plaques d’élution pour
4 × 96 preps NucleoMag® RNA
1 set
Visiter notre site web www.mn-net.com pour des informations plus détaillées.
20
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
Extraction d‘ARN
6.3
Restrictions d’utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne
font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société.
MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez
contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur
les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour
obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la
documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
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Tel.: +49 24 21 969 333
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Marques déposées:
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NucleoMag® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG
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enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux
marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07
21
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Manuels associés