Macherey-Nagel NucleoMag DNA Forensic kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
Manuel
d’utilisation
User manual
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
n NucleoMag® DNA Forensic
Février 2024 / Rev. 04
www.mn-net.com
www.mn-net.com
Contact MN
Germany and international
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
Tel.:
+49 24 21 969-0
Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only)
E-mail: [email protected]
Technical Support Bioanalysis
Tel.:
+49 24 21 969-333
E-mail: [email protected]
USA
MACHEREY-NAGEL Inc.
924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA
Toll-free: 888 321 6224 (MACH)
E-mail: [email protected]
France
MACHEREY-NAGEL SAS
1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France
Tel.:
+33 388 68 22 68
E-mail: [email protected]
MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 €
Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531
Switzerland
MACHEREY-NAGEL AG
Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland
Tel.:
+41 62 388 55 00
E-mail: [email protected]
www.mn-net.com
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
Sommaire
1 Composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Consommables et équipements à fournir par l’utilisateur
5
1.3 A propos de ce manuel
5
2 Description du produit
6
2.1 Principe général
6
2.2 Caractéristiques du kit
6
2.3 Systèmes de séparation magnétique
8
2.4 Réglage des paramètres d’agitation
9
2.5 Manipulation des billes
10
2.6 Procédures d’élution
11
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
12
4 Instructions de sécurité
13
4.1 Elimination des déchets
13
5 Protocole pour l’extraction d’ADN génomique à partir d’échantillons médico-légaux
14
6 Annexes
20
6.1 Guide de résolution des problèmes
20
6.2 Les informations de commande
22
6.3 Restriction de l’utilisation du produit / ​garantie
23
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
3
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoMag® DNA Forensic
1 × 96 preps
744660.1
4 × 96 preps
744660.4
Billes NucleoMag® F-Beads
1,4 mL
2 × 2,6 mL
Tampon de lyse FOL
50 mL
250 mL
Tampon de fixation FOB
100 mL
300 mL
Tampon de lavage FOW1
80 mL
200 mL
Tampon de lavage FOW2
25 mL
100 mL
Tampon d’élution FOE
13 mL
60 mL
Protéinase K liquide
2 × 1250 µL
9 mL
Agent réducteur TCEP
14 mg
2 × 14 mg
1
1
REF
Manuel d’utilisation
* Pour la préparation des réactifs et des conditions de stockage, voir le chapitre 3.
4
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
1.2
Consommables et équipements à fournir par l’utilisateur
Produit
REF
Conditionnement
Séparateur magnétique
NucleoMag® SEP (voir chapitre 3).
744900
1
Plaque de séparation pour la séparation des billes
magnétiques,
Square-well Block (Bloc 96 puits avec des puits carrés
de 2.1 mL)
740481
740481.24
4
24
Tubes de lyse pour l’incubation des échantillons et
la lyse,
p.e., Rack of Tubes Strips (1 set comprend 1 Rack, 12
barrettes de 8 tubes (puits de 1,2 mL) chacune, et 12
barrettes de 8 bouchons)
740477
740477.24
4 sets
24 sets
Plaque d’élution pour la collecte d’acides nucléiques
purifiés,
p.e., plaque d’élution à fond en U (microplaque de 96
puits de 0,3 mL avec des puits à fond en U)
740486.24
24
Pour l’utilisation du kit sur l’instrument KingFisher®
96 :
744950
1 set
p.e., kit d’accessoires 96 puits A pour KingFisher®
(Square-well Blocks, Deep-well tip combs, Plates pour
4 × 96 NucleoMag® Trace preps utilisant la plateforme
KingFisher® 96)
1.3
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé aux personnes qui utilisent pour la première fois le kit NucleoMag®
DNA Forensic de lire les paragraphes détaillés du protocole de ce manuel d’utilisation. Les
utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du
protocole est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil complémentaire permettant
de se référer rapidement aux différentes étapes lors de la procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante :
www.mn-net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
5
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
2
Description du produit
2.1
Principe général
La procédure NucleoMag® DNA Forensic est basée sur l’adsorption réversible des acides
nucléiques sur des billes paramagnétiques dans des conditions de tampons appropriées. La
lyse est réalisée par incubation des échantillons avec la protéinase K à 56 °C (optionnel : à TA).
Pour ajuster les conditions de fixation des acides nucléiques aux billes paramagnétiques ou à
la membrane de silice, le tampon FOB et les NucleoMag® F-Beads sont ajoutés au lysat. Après
la séparation magnétique, les billes paramagnétiques sont lavées trois fois pour éliminer les
contaminants et les sels à l’aide des tampons de lavage FOW1 et FOW2. L’éthanol résiduel des
étapes de lavage précédentes est éliminé par une étape de séchage. Enfin, l’ADN hautement
purifié est élué avec le tampon d’élution à faible teneur en sel (FOE) et peut être directement
utilisé pour des applications en aval. Le kit NucleoMag® DNA Forensic peut être utilisé
manuellement ou automatiquement sur des robots pipeteurs standards ou des séparateurs
magnétiques automatisés.
Nous pouvons fournir une assistance personnalisée, des informations sur les protocoles ou
des programmes vérifiés pour de nombreuses plateformes. Pour plus d’informations, veuillez
contacter notre support technique ou visiter le site www.mn-net.com/automation.
2.2
Caractéristiques du kit
•
NucleoMag® DNA Forensic est conçu pour la préparation rapide, manuelle et
automatisée, d’ADN génomique très pur à partir d’écouvillons buccaux ou d’autres
échantillons médico-légaux, par exemple des taches de sang séché, des échantillons
« trace et toucher « ou des filtres de cigarettes. Le kit est conçu pour être utilisé avec le
séparateur magnétique NucleoMag® SEP (voir les informations de commande) ou tout
autre système de séparation magnétique (voir paragraphe 2.3). Le temps de préparation
manuelle de 96 échantillons est d’environ 120 minutes. L’ADN purifié peut être utilisé
directement comme matrice pour la PCR ou tout autre type de réaction enzymatique.
•
NucleoMag® DNA Forensic permet une automatisation facile sur les instruments
courants de manipulation des liquides ou les séparateurs magnétiques automatisés.
Le temps de préparation réel dépend de la configuration de l’instrument et du système
de séparation magnétique utilisé. Typiquement, 96 échantillons peuvent être purifiés en
moins de 120 minutes en utilisant le NucleoMag® SEP sur la plateforme d’automatisation.
•
Le kit fournit des réactifs pour la purification d’un maximum de 7 µg d’ADN génomique
pur à partir d’échantillons appropriés (rendements typiques pour l’extraction d’ADN à
partir d’écouvillons buccaux : 1 – 3 µg d’ADN). En fonction du volume d’élution utilisé, des
concentrations de 10 – 30 ng/µL peuvent être obtenues.
•
Après lyse des échantillons avec la protéinase K à 56 °C (recommandé, optionnel : le
traitement à la protéinase K peut être effectué à TA), le NucleoMag® DNA Forensic peut
6
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
être entièrement traité à température ambiante ; toutefois, l’élution à 56 °C augmentera le
rendement d’environ 15 à 20 %.
•
Les NucleoMag® F-Beads sont des billes superparamagnétiques hautement réactives.
La capacité de fixation est de 0,4 µg d’ADNg pour 1 µL de suspension de NucleoMag®
F-Beads ; 1 µL de suspension contient 140 µg de billes.
•
Le kit NucleoMag® DNA Forensic est conforme à toutes les exigences de la norme
ISO 18385.
•
La norme ISO 18385 spécifie les exigences relatives à la fabrication de produits utilisés
pour la collecte, le stockage et l’analyse de matériel biologique à des fins d’ADN médicolégal. Nous avons mis en œuvre la norme ISO 18385 pour la production de kits destinés
à des applications médico-légales. Par conséquent, nous avons minimisé le risque de
contamination par l’ADN humain dans tous nos produits étiquetés pour l’extraction
d’acides nucléiques à partir d’échantillons médico-légaux. Tous les consommables
utilisés dans notre gamme de produits médico-légaux sont traités (après production) avec
de l’oxyde d’éthylène (OE), la méthode recommandée pour éliminer l’ADN amplifiable
avant l’échantillonnage médico-légal*.
•
Réserver à l’usage de la recherche
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
7
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
2.3
Systèmes de séparation magnétique
Pour une manipulation appropriée du kit NucleoMag® DNA Forensic, l’utilisation du séparateur
magnétique NucleoMag® SEP est recommandée. La séparation est effectuée dans un Squarewell Blocks (voir les informations de commande). Le kit peut également être utilisé avec d’autres
séparateurs courants.
Séparateur magnétique
Plaque ou tube de séparation
®
NucleoMag SEP (MN REF 744900)
Square-well Block (MN REF 740481)
Tecan Te-MagS™
Tubes de 1,5 mL sans couvercle (Sarstedt)
Séparation à aimants statiques
Les séparateurs dotés d’aimants magnétiques statiques, par exemple le NucleoMag® SEP ou
d’autres séparateurs magnétiques courants, conviennent à une utilisation manuelle et à une
utilisation sur des stations de travail de manipulation de liquides : ce type de séparateur est
recommandé en combinaison avec un agitateur de microplaques approprié pour une remise en
suspension optimale des billes pendant les étapes de lavage et d’élution. Alternativement, les
billes peuvent être remises en suspension dans le tampon par pipetages successifs. Pour une
utilisation entièrement automatisée sur les stations de travail de manipulation des liquides, un
bras manipulateur est nécessaire ; la plaque est transférée vers le séparateur magnétique pour
la séparation des billes et transférée vers le module d’agitation pour la remise en suspension
des billes.
Systèmes magnétiques mobiles
Séparateurs à aimants magnétiques mobiles : Les aimants magnétiques sont déplacés d’un
côté à l’autre du puits et vice versa. Les billes suivent ce mouvement et sont ainsi entraînées
à travers le tampon pendant les étapes de lavage et d’élution. La séparation a lieu lorsque le
système s’arrête.
Séparateurs automatisés
Séparateurs à aimants mobiles : Les billes magnétiques sont transférées dans des plaques ou
des tubes appropriés. Les billes sont remises en suspension à l’aide des aimants recouverts de
protection. Après la fixation, le lavage ou l’élution, les billes sont à nouveau recueillies avec les
aimants recouverts de protection et transférées dans la plaque ou le tube suivant.
8
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
2.4
Réglage des paramètres d’agitation
Lors de l’utilisation d’un agitateur de plaques pour les étapes de lavage et d’élution, les
réglages des paramètres d’agitation doivent être soigneusement ajustés pour chaque plaque
de séparation spécifique et chaque agitateur afin d’éviter toute contamination croisée d’un puits
à l’autre. Procéder comme suit :
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour les étapes de fixation et de lavage :
•
Verser 600 µL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque
sur l’agitateur et commencer à agiter avec une vitesse modérée pendant 30 secondes.
Éteindre l’agitateur et vérifier la présence de petites gouttelettes d’eau colorée à la surface
de la plaque.
•
Augmenter la de vitesse, agiter pendant 30 secondes supplémentaires et vérifier à
nouveau la présence de gouttelettes à la surface de la plaque.
•
Continuer à augmenter la vitesse jusqu’à ce qu’à obtenir des gouttelettes sur le dessus
de la plaque de séparation. Réduire la vitesse, vérifier à nouveau et utiliser ce réglage pour
l’étape de lavage.
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour l’étape d’élution :
•
Introduire 100 à 200 µL d’eau colorée dans les puits de la plaque de collecte et procéder
comme décrit ci-dessus.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
9
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
2.5
Manipulation des billes
Distribution des billes
Une distribution homogène des billes magnétiques dans les différents puits de la plaque
de séparation est essentielle pour assurer une grande cohérence d’un puits à l’autre. Par
conséquent, avant de distribuer les billes, s’assurer que les billes sont complètement remises
en suspension. Bien agiter le flacon de stockage ou le placer brièvement sur un vortex. Le
fait de mélanger au préalable les billes magnétiques avec le tampon de fixation permet une
distribution plus homogène des billes dans les différents puits de la plaque de séparation.
Lors de l’automatisation, il est recommandé de procéder à une étape de prémélange avant
d’aspirer le mélange billes / ​tampon de fixation du réservoir afin de maintenir les billes remises
en suspension.
Temps de séparation magnétique
L’attraction des billes magnétiques sur les aimants dépend de la force magnétique des aimants,
de la plaque de séparation sélectionnée, de la distance entre la plaque de séparation et les
aimants et du volume à traiter. Les durées individuelles pour l’attraction complète des billes sur
les aimants magnétiques doivent être vérifiés et ajustés sur chaque système. Il est recommandé
d’utiliser les plaques ou tubes de séparation spécifiés par le fournisseur du séparateur
magnétique.
Lavage des billes
Le lavage des billes peut être réalisé en agitant ou en mélangeant. Contrairement au mélange
par pipetages successifs, le mélange par agitateur ou magnétique permet de mélanger
simultanément tous les échantillons. Cela permet de réduire le temps et le nombre d’embouts
nécessaires à la préparation. La remise en suspension par pipetages successifs est cependant
plus efficace que le mélange par agitateur ou magnétique.
Efficacité de
la remise en
suspension
Vitesse
Possibilité d’un
faible volume
d’élution
Nombre
de cônes
nécessaires
Mélange
magnétique
+
++
+
Faible
Agitateur
++
++
+++
Faible
Pipetage
+++
+*
++
Haut
Méthode
+ : acceptable, ++ : bon, +++ : excellent
* Shaw et al, 2008, Comparison of the effects of sterilisation techniques on subsequent DNA profiling. Int J Legal
Med 122:29 – 33.
10
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
2.6
Procédures d’élution
L’ADN purifié peut être élué directement avec le tampon d’élution FOE fourni. L’élution peut être
effectuée dans un volume ≥ 50 µL. Il est essentiel de recouvrir complètement les NucleoMag®
F-Beads avec le tampon d’élution pendant l’étape d’élution. Le volume de tampon d’élution
distribué dépend du système de séparation magnétique (p.e., la position du culot à l’intérieur
de la plaque de séparation). Pour une élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être
entièrement remis en suspension dans le tampon d’élution. Pour certains séparateurs, des
volumes d’élution plus élevés peuvent être nécessaires pour couvrir la totalité du culot.
L’élution est possible à température ambiante. Le rendement peut être augmenté de 15 à 20 %
si l’élution est effectuée à 56 °C.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
11
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention : Les tampons FOL, FOB et FOW1 contiennent des sels chaotropiques ! Porter des
gants et des lunettes !
ATTENTION : Les tampons FOB et FOW1 contiennent du thiocyanate de guanidinium qui peut
former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorite
de sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de
préparation des échantillons.
Conditions de stockage :
Tous les composants du kit NucleoMag® DNA Forensic doivent être conservés à
température ambiante (15 – 25 °C) et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Le
stockage à des températures inférieures peut entraîner la précipitation de sels. Si une
précipitation de sels est observée, incuber le flacon à 30 – 40 °C pendant quelques
minutes et bien mélanger jusqu’à ce que tout le précipité soit redissous. La performance
des kits n’est pas affectée par la formation réversible de précipités de sels.
•
Avant de débuter la procédure NucleoMag® DNA Forensic, préparer les éléments suivants :
•
Tampon de lavage FOW2 : Ajouter le volume indiqué d’éthanol (96 – 100 %) au tampon
FOW2 concentré avant utilisation. Marquer l’étiquette du flacon pour indiquer que
l’éthanol a été ajouté. Conserver le tampon de lavage FOW2 entre 15 et 25 °C jusqu’à un
an.
•
Agent réducteur TCEP : Ajouter 1 mL de H2O stérile au flacon de TCEP et incuber
pendant plusieurs minutes à température ambiante. Mélanger le flacon pour dissoudre
complètement le TCEP. Conserver le TCEP dissous à -20 °C.
NucleoMag® DNA Forensic
REF
Tampon de lavage
FOW2
(concentré)
Agent réducteur TCEP
12
1 × 96 preps
744660.1
4 × 96 preps
744660.4
25 mL
Ajouter 100 mL d’éthanol
100 mL
Ajouter 400 mL d’éthanol
1 flacon (14 mg)
Ajouter 1 mL de H2O
2 flacons (14 mg/fiole)
Ajouter 1 mL de H2O à chaque
flacon
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® DNA Forensic, portez des vêtements de
protection appropriés (p.e. une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de
protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées
(FDS sont disponibles en ligne sur www.mnnet.com/msds).
Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon FOL et le thiocyanate de guanidinium
dans les tampons FOB et FOW1 peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils sont
combinés avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions
acides directement aux déchets de préparation d’échantillons.
Les déchets générés par le kit NucleoMag® DNA Forensic n’ont pas été testés pour détecter
la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du
matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement
dénaturant et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement exclue. Par
conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être
manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
13
NucleoMag® DNA Forensic
5
Protocole pour l’extraction d’ADN génomique à
partir d’échantillons médico-légaux
Résumé du protocole
•
Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les
paragraphes 1.2 et 2.3, respectivement.
•
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 17 (protocole détaillé).
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier si le tampon de lavage FOW2 et le TCEP ont été préparés conformément au
chapitre 3.
1
Lyse de
l’échantillon
Ajouter 20 µL de protéinase K liquide,
5 µL de solution de TCEP (14 mg/mL) et
450 µL de tampon FOL
Mélanger
56 °C, 1 h
2
Fixation de
l’ADN aux
NucleoMag®
F-Beads
400 µL de lysat
12 µL NucleoMag® F-Beads
580 µL FOB
Mélanger en agitant pendant 10 min
à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
14
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
NucleoMag® DNA Forensic
3
Lavage avec le
tampon FOW1
Retirer le Square-well Blocks du
NucleoMag® SEP
400 µL FOW1
Remettre en suspension : Agiter 1 min
à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
4
Lavage avec le
tampon FOW2
1er lavage
Retirer le Square-well Blocks du
NucleoMag® SEP
400 µL FOW2
Remettre en suspension : Agiter 1 min
à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
15
NucleoMag® DNA Forensic
5
Lavage avec le
tampon FOW2
2ème lavage
Retirer le Square-well Blocks sur le
NucleoMag® SEP
400 µL FOW2
Remettre en suspension : agiter 1 min
à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
6
Séchage
des billes
magnétiques
15 min à TA
7
Elution de l’ADN
Ajouter 25 – 100 µL de FOE
(Optionnel : élution à 56 °C)
Agiter 5 min à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Séparer 2 min et transférer l’ADN dans
la plaque d’élution.
16
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple,
NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.2). Il est recommandé
d’utiliser un Square-well Blocks pour la séparation (voir paragraphe 1.2). L’extraction de l’ADN
peut également être réalisée dans des tubes de réaction avec des séparateurs magnétiques
appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de guide pour l’adaptation
du kit aux instruments robotisés.
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que le tampon de lavage FOW2 et le TCEP ont été préparés conformément au
paragraphe
Collecte d’échantillons
Prélever les échantillons à l’aide d’écouvillons en coton, en Dacron ou en C.E.P.. Frotter
fermement l’intérieur de chaque joue à plusieurs reprises et laissez les écouvillons
sécher à l’air.
La personne concernée ne doit pas avoir consommé de nourriture ou de boisson dans
les 30 min précédant le prélèvement de l’échantillon.
Les échantillons doivent être traités immédiatement ou conservés à 4 °C.
1
Lyse de l’échantillon
Ajouter 20 µL de protéinase K liquide, 5 µL de TCEP (14 mg/ml) et 450 µL de
tampon de lyse FOL à un tube de réaction contenant l’échantillon. Bien mélanger
par agitation vigoureuse ou par pipetages successifs pendant 10 à 15 s. Centrifuger
brièvement (15 s ; 1 500 × g) pour recueillir tout l’échantillon au fond du tube.
Note : Les écouvillons buccaux doivent être immergées dans la solution de lyse. Par
conséquent, selon le type ou la taille de l’écouvillon buccal utilisé, le volume du tampon
FOL doit être augmenté. Il n’est pas nécessaire d’augmenter le volume de protéinase
K ou de TCEP.
Il est également possible d’effectuer la lyse avec le tampon FOL / ​protéinase K/TCEP
dans une plaque NucleoSpin® Trace Filter (voir les informations de commande). Cette
plaque permet une séparation pratique du lysat de l’écouvillon par centrifugation et
réduit la perte de lysat.
Incuber à 56 °C pendant 60 min sous agitation. Pour une lyse optimale, mélanger
de temps en temps pendant l’incubation. S’assurer que les tubes de lyse sont bien
fermés. L’étape de lyse peut également être réalisée dans des barrettes de tubes (voir
les informations de commande).
Après l’incubation de la lyse, centrifuger pour recueillir tout l’échantillon de la lyse des
bouchons et transférer chaque lysat dans les puits d’une Square-well Block. Lors de
l’utilisation d’écouvillons buccaux, retirer l’écouvillon buccal et centrifuger pour obtenir
400 µL de lysat.
Lors de l’utilisation de la plaque NucleoSpin® Trace Filter, centrifuger la plaque
NucleoSpin® Trace Filter empilée sur un bloc 96 puits ’Square-well Block’ pendant
5 min à 5 600 x g pour extraire le lysat de l’écouvillon.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
17
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
2
Fixation de l’ADN aux NucleoMag® F-Beads
A chaque lysat de 400 µL de l’étape précédente, ajouter 12 µL de billes NucleoMag®
F-Beads et 580 µL de tampon de fixation FOB. Mélanger par pipetages successifs
6 fois et agiter pendant 5 min à température ambiante. Alternativement, lors de la
procédure du kit sans agitateur, pipeter de haut en bas 10 fois et incuber pendant 5 min
à température ambiante.
Note : Les NucleoMag® F-Beads et le tampon FOB peuvent être mélangés au
préalable. Pour chaque puits à traiter, mélanger 12 µL de NucleoMag® F-Beads avec
580 µL de tampon MB2. Vortexer brièvement. En fonction du volume mort du réservoir,
des quantités supplémentaires de suspension de billes et de tampon de fixation sont
nécessaires.
Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® F-Beads avant de les retirer du flacon
de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une suspension
homogène se forme.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce
que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à
l’aide d’une pipette.
Note : Ne pas perturber les culots de billes attirés lors de l’aspiration du surnageant.
Le culot de billes peut ne pas être visible lors de cette étape. Prélever le surnageant de
l’autre côté du puits.
3
Lavage avec le tampon FOW1
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 400 µL de tampon FOW1 dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en
suspension (1 – 3 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement
par pipetages successifs.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
4
Lavage avec le tampon FOW2
1er lavage
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 400 µL de tampon FOW2 dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension
(1 – 3 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par
pipetages successifs.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
18
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
5
Lavage avec le tampon FOW2
2ème lavage
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 400 µL de tampon FOW2 dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en
suspension (1 – 3 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement
par pipetages successifs.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
6
Séchage des billes NucleoMag® F-Beads
Sécher les billes à l’air libre pendant 10 à 15 min à température ambiante.
7
Elution de l’ADN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter le volume souhaité de tampon FOE (25 – 100 µL) à chaque puits du Square-well
Block et remettre les billes en suspension en agitant pendant 5 – 10 min à température
ambiante. Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par
pipetages successifs et incuber pendant 5 – 10 min à température ambiante ou à
56 °C.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
soient attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ADN génomique
purifié dans des plaques d’élution ou des barrettes de tubes (voir les informations de
commande).
Note : Le rendement peut être augmenté de 15 à 20 % en utilisant un tampon d’élution
préchauffé (56 °C) ou en incubant la suspension billes/tampon d’élution à 56 °C
pendant 10 min.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
19
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
6
Annexes
6.1
Guide de résolution des problèmes
Problèmes
Causes possible et suggestions
Lyse incomplètes des échantillons
•
L’échantillon n’a pas été complètement homogénéisé et mélangé
avec le tampon de lyse, la protéinase K et le TCEP. Le mélange
doit être agité en permanence. Alternativement, prolonger le
temps d’incubation avec la protéinase K.
Réactifs mal préparés
•
Préparer le tampon FOW2 et le TCEP conformément aux
instructions (paragraphe 3).
Volume de tampon d’élution insuffisant
•
Faible rendement
en ADN
Le culot de billes doit être entièrement recouvert de tampon
d’élution.
Performance insuffisante du tampon d’élution pendant l’étape d’élution
•
Éliminer complètement les tampons résiduels lors des étapes
de séparation. Les tampons résiduels diminuent l’efficacité des
étapes de lavage et d’élution.
Séchage excessif des billes
•
Ne pas laisser sécher les billes, car cela pourrait entraîner une
baisse de l’efficacité de l’élution.
Aspiration d’une partie des billes présents sur l’aimant
•
Ne pas perturber les billes attirées lors de l’aspiration du
surnageant, en particulier lorsque le culot de billes n’est pas
visible dans le lysat.
Aspiration et perte de billes
•
Le temps de séparation magnétique était trop court ou la vitesse
d’aspiration trop élevée.
Procédure de lavage insuffisante
Pureté insuffisante / ​
Faible sensibilité
20
•
Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de séparateur
et de plaque, par exemple, le Square-well Blocks en combinaison
avec le NucleoMag® SEP.
•
S’assurer que les billes sont remises en suspension
complètement pendant la procédure de lavage. Si l’agitation
n’est pas suffisante pour remettre les billes en suspension
complètement, mélanger par pipetages successifs.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
Problèmes
Causes possible et suggestions
Elimination de l’éthanol des tampons de lavage
•
Mauvaise
performance de
l’ADN lors des
applications avales
Veiller à éliminer toute la solution de lavage éthanolique, car
l’éthanol résiduel interfère avec les applications en aval.
Évaporation de l’éthanol des tampons de lavage
•
Fermer hermétiquement les flacons de tampons, éviter
l’évaporation de l’éthanol des flacons de tampons ainsi que
des tampons remplis dans les réservoirs. Ne pas réutiliser les
tampons des réservoirs de tampons.
Durée de séparation magnétique trop courte
•
Perte des billes
Augmenter la durée de séparation pour permettre aux billes
d’être complètement attirées par les aimants magnétiques avant
d’aspirer tout liquide du puits.
Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution)
•
Une vitesse d’aspiration élevée pendant l’étape d’élution peut
entraîner une perte des billes. Réduire la vitesse d’aspiration pour
l’étape d’élution.
Contamination des parties supérieures des puits
Contamination
croisée
•
Ne pas humidifier les bords du Square-well Blocks lors du
transfert du lysat. Si le bord des puits est contaminé, sceller
le Square-well Block avec une feuille PE auto-adhésive (voir
les informations de commande) avant de mettre l’agitateur en
marche.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
21
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
6.2
Les informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoMag DNA Forensic
744660.1
744660.4
1 × 96 preps
4 × 96 preps
NucleoSpin® DNA Forensic
740840.10
740840.50
740840.250
1 × 10 preps 1 × 50
preps
1 × 250 preps
NucleoSpin® Forensic Filters (en vrac)
740988.50B
740988.250B
740988.1000B
50 pièces
250 pièces
1000 pièces
Plaque NucleoSpin® Trace Filters
740677
20
NucleoMag SEP
744900
1
Square-well Blocks
740481
740481.24
4
24
Square-well Blocks, traités à l’oxyde
d’éthylène
740481EO
4
Film PE auto-adhésif
740676
50 feuilles
Rack de Tubes Strips
(le set comprend 1 rack, 12 barrettes
avec 8 tubes chacun, et 12 barrettes de 8
bouchons)
740477
740477.24
4 sets
24 sets
Caps Strips (barrettes de 8 bouchons)
740638
30 barrettes
96-well Accessory Kit A for KingFisher®
744950
1 set
Plaques 96 Deep-Well pour les systèmes
avec des barreaux magnétiques
744955
25
Tip Combs 8-Well pour les systèmes avec
des barreaux magnétiques
744960
50
Kit d’accessoires 8-Well pour les systèmes
avec des barreaux magnétiques (5 × 96
Deep-Well, 10 x Tips Combs 8-Well)
744961
1 set
®
®
Visitez le site www.mn-net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit.
22
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
ADN génomique d’échantillons médico-légaux
6.3
Restriction de l’utilisation du produit / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne
font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société.
MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez
contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur
les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour
obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la
documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
Veuillez contacter :
MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Tel. : +49 24 21 969‑333
[email protected]
Marques déposées :
KingFisher® est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific.
NucleoMag® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG.
Te-MagS™ est une marque déposée de Tecan Group Ltd, Suisse.
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux
marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 04
23
www.mn-net.com
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
DE +49 24 21 969-0 [email protected]
CH +41 62 388 55 00 [email protected]
FR +33 388 68 22 68 [email protected]
US +1 888 321 62 24 [email protected]
">