Macherey-Nagel NucleoSpin RNA Plus XS, Micro kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
Manuel
d’utilisation
User manual
Extraction des ARN
n NucleoSpin® RNA Plus XS
Décembre 2022 / Rev. 07
www.mn-net.com
www.mn-net.com
Extraction des ARN
Résumé du protocole (Rev. 07)
NucleoSpin® RNA Plus XS
1 Homogénéiser
et lyser
l’échantillon
100 μL LB1
Homogénéiser
100 μL LB2
100 x g,
2 Éliminer l’ADNg
et filtrer le lysat
2 min
11,000 x g,
10 s
3 Ajuster les
conditions de
fixation
150 μL BSXS
4 Fixer l’ARN
Charger le lysat
Mélanger
300 x g,
1 min
11,000 x g,
10 s
5 Laver et sécher
la membrane
de silice
1er lavage
100 μL MDB
11,000 x g,
10 s
2ème lavage
500 μL WB2
11,000 x g,
10 s
3ème lavage
200 μL WB2
< 20,000 x g,
2 min
6 Eluer l’ARN
10 – 20 μL RNase-free H2O
11,000 x g,
1 min
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com
Extraction des ARN
Table of contents
1 Composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur
5
1.3 Environnement de travail exempt de RNases
5
1.4 A propos de ce manuel
6
2 Description du produit
7
2.1 Principe général
7
2.2 Caractéristiques du kit
7
2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons
9
2.4 Procédures d’élution
10
2.5 Stabilité de l’ARN purifié
10
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
11
4 Instructions de sécurité
12
4.1 Elimination des déchets
®
12
5 Protocole NucleoSpin RNA Plus XS
13
6 Annexes
16
6.1 Élimination de l’ADN
16
6.2 Guide de résolution des problèmes
18
6.3 Informations de commande
21
6.4 Restrictions de l’utilisation / ​garantie
22
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
3
Extraction des ARN
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoSpin® RNA Plus XS
10 preps
740990.10
50 preps
740990.50
250 preps
740990.250
Tampon de lyse LB1
6 mL
6 mL
30 mL
Tampon de lyse LB2
6 mL
6 mL
30 mL
Solution de fixation BSXS
10 mL
10 mL
50 mL
Tampon de lavage MDB
10 mL
10 mL
30 mL
Tampon de lavage WB2
(concentré)
6 mL
12 mL
50 mL
H2O RNase-free
13 mL
13 mL
13 mL
Colonnes NucleoSpin®
gDNA Removal XS (anneau
jaune)
10
50
250
Colonnes NucleoSpin®
RNA Plus XS (anneau bleu
clair plus tube collecteur)
10
50
250
Tube collecteur (2 mL)
20
100
500
Collection Tube (1.5 mL)
10
50
250
Notice d'utilisation
1
1
1
REF
4
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
Extraction des ARN
1.2
Réactifs, consommables et équipements à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
•
Éthanol à 96 – 100 % (pour préparer le tampon de lavage WB2, il est recommandé
d’utiliser de l’éthanol non dénaturé)
Consommables
•
Tubes de 1,5 mL ou 2,0 mL ou tubes de réaction PCR (pour préparer les lysats)
•
Micro pilon à usage unique (Optionnel, pour l’homogénéisation de l’échantillon)
•
Cônes stériles exempts de RNases
•
MN Bead Tubes Type A ou C (Optionnel, voir Informations de commande)
Equipement
•
Pipettes manuelles
•
Vortex
•
Centrifugeuse pour microtubes
•
Équipement pour le broyage et l’homogénéisation des échantillons (voir le chapitre 2.3).
•
Équipements de protection individuelle (p.e., blouse, gants, lunettes)
Note : des agents réducteurs supplémentaires (p.e. ß-mercaptoéthanol, DTT, TCEP) ne sont
pas nécessaires pour les préparations NucleoSpin® RNA Plus XS.
1.3
Environnement de travail exempt de RNases
Les composants du kit ont été testés pour garantir l’absence de RNases. Cependant, un
environnement de travail exempt de RNases est également un facteur critique pour la réussite
de l’extraction et de la manipulation de l’ARN. Il convient donc de suivre les recommandations
générales visant à éviter la contamination par les RNases :
•
Maintenir une zone séparée, des pipettes et du matériel exempts de RNases lorsque l’on
travaille avec de l’ARN.
•
Porter des gants pour manipuler l’ARN et les réactifs afin d’éviter tout contact avec la
peau, qui est une source de RNases. Changer fréquemment de gants.
•
Utiliser des tubes en plastique stériles exempts de RNases. Des tubes collecteurs (2 mL,
pour récupérer les filtrats et 1,5 mL pour l’élution) sont fournis dans le kit. Les tubes pour
la préparation du lysat doivent être fournis par l’utilisateur.
•
Utiliser l’eau RNase-free fournie avec le kit pour l’élution.
•
Garder tous les composants du kit dans leur emballage et tous les contenants
hermétiquement fermés en dehors des étapes de pipettage.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
5
Extraction des ARN
1.4
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé de lire les paragraphes détaillés du protocole de ce manuel
d’utilisation si le kit NucleoSpin® RNA Plus XS est utilisé pour la première fois. Les utilisateurs
expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du protocole
est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil supplémentaire de référence rapide
pendant l’exécution de la procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante :
www.mn-net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes.
6
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
Extraction des ARN
2
Description du produit
2.1
Principe général
Le kit NucleoSpin® RNA Plus XS est conçu pour purifier l’ARN à partir de petites quantités de
divers types de cellules et de tissus. Ce kit contient la colonne NucleoSpin® gDNA Removal XS
qui permet d’éliminer rapidement et efficacement l’ADN génomique sans étape de digestion à
la DNase.
L’un des aspects les plus importants lors de l’extraction de l’ARN est d’empêcher la dégradation
de l’ARN. Les cellules et les tissus sont d’abord lysés par incubation dans un tampon de lyse
fortement concentré en ions chaotropiques (LB1 + LB2), qui inactive immédiatement les
RNases. Le lysat est ajouté à la colonne NucleoSpin® gDNA Removal XS (anneaux jaunes)
pour clarifier le lysat et éliminer l’ADNg contaminant. Après l’ajout de la solution de fixation
BSXS au filtrat, l’ARN est fixé à la colonne NucleoSpin® RNA Plus XS (anneaux bleu clair).
Les étapes de lavage ultérieures éliminent les sels, les métabolites et les composants cellulaires
macromoléculaires. L’ARN de haute qualité est élué avec du H2O RNase-free.
La préparation de l’ARN à l’aide des kits NucleoSpin® RNA Plus XS peut être effectuée à
température ambiante.
L’éluat doit être traité avec soin car l’ARN est très sensible aux traces de contamination par
les RNases, souvent présentes sur le matériel de laboratoire, les doigts et la poussière. Garder
l’ARN congelé à -20 °C pour un stockage à court terme ou à -70 °C pour un stockage à long
terme afin de garantir la stabilité de l’ARN.
2.2
Caractéristiques du kit
•
Les kits NucleoSpin® RNA Plus XS sont recommandés pour l’extraction d’ARN à partir
de petites quantités de cellules en culture et de tissus. Les kits NucleoSpin® RNA Plus
XS permettent la purification d’ARN de haute qualité. Le rapport ARN A₂₆₀/A₂₈₀ est
généralement supérieur à 1,9 (mesuré dans un tampon TE, pH 7,5).
•
L’ARN purifié est prêt à être utilisé dans diverses applications en aval.
•
L’ARN purifié avec le kit NucleoSpin® RNA Plus XS est d’une grande intégrité. L’indice
d’intégrité de l’ARN (RIN) ou l’indice de qualité de l’ARN (RQN) de l’ARN purifié à partir
d’échantillons frais de haute qualité (p.e. cellules eucaryotes ou foie de souris frais) est
généralement supérieur à 8. Toutefois, l’intégrité de l’ARN dépend fortement de la qualité
de l’échantillon et d’une concentration suffisante d’ARN.
•
Les molécules d’ARN purifées avec le kit NucleoSpin® RNA Plus XS sont d’une
taille supérieur à 100 nucléotides. Ainsi, le kit NucleoSpin® RNA Plus XS permet un
enrichissement en ARNm et en ARNr. L’ARN purifié avec les kits NucleoSpin® RNA Plus
XS peut contenir d’infimes quantités d’ADN génomique en raison du relatguage de ces
molécules de la colonne NucleoSpin® gDNA Removal XS. La probabilité de détection de
l’ADN contaminant par PCR augmente avec :
1. Le nombre de copies d’ADN par préparation : cible à copie unique < cible plastidiale / ​
mitochondriale < plasmides transfectés dans les cellules.
2. la diminution de la taille de l’amplicon PCR.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
7
Extraction des ARN
Tableau 1 : Résumé des caractéristiques du kit
Paramètres
NucleoSpin® RNA Plus XS
Technologie
Système avec 2 colonnes à membrane de
silice :
1. colonne XS pour l’élimination de l’ADN
2. Colonne XS pour l’extraction de l’ARN
Utilisation
Réserver à l’usage de la recherche
Format
Mini colonne à centrifuger - Modèle XS
Procédure
Manipulation manuelle et centrifugation
Échantillon
< 10⁵ cellules en culture < 5 mg de tissu
Taille du fragment
> 100 nt
Rendement typique
10⁵ cellules HeLa : environ 500 – 2000 ng
10⁴ cellules HeLa : environ 50 – 200 ng
10³ cellules HeLa : environ 5 – 20 ng
10² cellules HeLa : environ 0,5 – 2 ng
10¹ cellules HeLa : environ 0,05 – 0,2 ng
1 cellule HeLa : environ 0,005 – 0,02 ng
5000 µg de foie : environ 300 – 500 ng
500 µg de foie : environ 300 – 500 ng
50 µg de foie : environ 100 – 250 ng
5 µg de foie : environ 25 – 70 ng
0,5 µg de foie : environ 2,5 – 8 ng
0,05 µg de foie : environ 0,25 – 1,2 ng
0,005 µg de foie : 0,025 – 0,2 ng
A260/A280
1.9 – 2.2*
A260/A230
1.5 – 2.5*
Niveau d’intégrité de l’ARN (RIN)
> 8*
Volume d’élution
5 – 30 µL
Temps de préparation
18 min/6 preps
Capacité de fixation
110 µg
*La qualité de la détermination des rapports dépend fortement d’une quantité suffisante
d’ARN mesurée. Veiller à utiliser une quantité suffisante d’ARN qui a été validée pour
permettre une détermination significative du rapport !
8
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
Extraction des ARN
2.3
Manipulation, préparation et stockage des échantillons
La quantité maximale d’échantillon pouvant être utilisée avec le kit NucleoSpin® RNA Plus XS
dépend du type d’échantillon et de sa teneur en ARN et en ADN.
Quantité maximale d’échantillon à utiliser par préparation (valeurs approximatives) :
•
Cellules eucaryotes (p.e., cellules HeLa) : 105 cellules
•
Tissu animal : 5 mg (poids humide) p.e. foie, rein, ou 1 mg rate (poids humide)
Stockage des échantillons et inhibition des RNases
Les RNases dégradent rapidement l’ARN contenu dans les échantillons si ceux-ci ne sont pas
protégés de l’activité des RNases après la collecte.
•
Utiliser l’échantillon fraîchement collecté pour une lyse immédiate et une purification de
l’ARN.
•
Conserver les échantillons dans le tampon de lyse après broyage à -70 °C jusqu’à un
an, à 4 °C jusqu’à 24 heures ou à température ambiante jusqu’à plusieurs heures. Les
échantillons congelés dans le tampon de lyse doivent être décongelés lentement avant de
commencer l’extraction de l’ARN.
•
Congeler rapidement l’échantillon dans de l’azote liquide immédiatement après la récolte
et le conserver à -70 °C. Les échantillons congelés sont stables jusqu’à 6 mois. Un
mortier et un pilon peuvent être utilisés pour pulvériser l’échantillon à l’état congelé. Veiller
à ce que l’échantillon ne soit pas décongelé avant d’entrer en contact avec le tampon de
lyse.
•
Submerger et conserver les échantillons dans la solution de stabilisation NucleoProtect®
RNA ou RNAlater®. Veiller à une imprégnation complète de l’échantillon avec la solution
de stabilisation avant de le congeler. Retirer l’excès de solution de stabilisation de
l’échantillon avant l’extraction de l’ARN conformément au manuel d’utilisation de la
solution de stabilisation.
Broyage et homogénéisation de l’échantillon
Cellules adhérentes
Aspirer complètement le milieu de culture cellulaire et ajouter immédiatement le tampon de
lyse LB1 dans la boîte de culture cellulaire. L’élimination de milieu doit être complète afin de
permettre une activité de lyse optimale du tampon de lyse. Pour la lyse, vortexer vigoureusement
les cellules.
Trypsiniser les cellules adhérentes en croissance :
Aspirer le milieu de culture cellulaire et ajouter une quantité équivalente de PBS afin de laver
les cellules en culture. Aspirer le PBS. Ajouter 0,1 – 0,3 % de trypsine dans du PBS et incuber
pendant une durée appropriée pour détacher les cellules de la surface de la boîte. Après le
détachement des cellules, ajouter le milieu de culture cellulaire, transférer les cellules dans un
tube approprié (non fourni) et les culotter par centrifugation pendant 5 min à 300 x g. Retirer le
surnageant et poursuivre l’ajout du tampon de lyse au culot cellulaire.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
9
Extraction des ARN
Cellules en suspension
Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g, éliminer complètement le surnageant et ajouter
directement le tampon de lyse LB1 au culot cellulaire. Vortexer vigoureusement pour la remise
en suspension et la lyse.
Échantillons de tissus
•
Le broyage peut être effectué par des billes MN Bead Tubes Type A ou C (voir
informations de commande). En combinaison avec un Vortex-Genie® 2, les tubes peuvent
être montés sur un MN Bead Tube Holder (voir informations de commande). Ajouter
l’échantillon et le tampon de lyse LB1 dans le tube de billes et agiter pendant 5 min. Les
MN Bead Tubes Type A peuvent également être utilisés avec un broyeur à billes. Il n’est
pas recommandé d’utiliser les MN Bead Tubes Type C avec un broyeur à billes. Cela peut
être nécessaire pour certains types de tissus (p.e., poumon, tissu cardiaque). La durée et
la fréquence optimales doivent être déterminées expérimentalement. Il est recommandé
de réduire la quantité de billes dans le tube d’environ 400 µL à environ 70 µL-100 µL de
billes afin de permettre un retrait efficace du lysat du tube de billes.
•
Les pistons pour microtubes peuvent être utilisés pour homogénéiser du matériel
congelé ou du matériel frais dans le tampon de lyse LB1 directement dans un tube de
microcentrifugeuse.
Pour les échantillons de tissus, le lysat doit être clarifié par centrifugation pendant 3 min à
5000 x g. Le surnageant est prêt à être utilisé pour le protocole NucleoSpin® RNA Plus XS.
Pour les cellules cultivées, une clarification n’est généralement pas nécessaire
2.4
Procédures d’élution
Il est recommandé d’utiliser des volumes d’élution compris entre 5 et 30 µL. Le volume d’élution
par défaut est de 10 – 20 µL.
2.5
Stabilité de l’ARN purifié
L’ARN élué doit toujours être conservé sur de la glace pendant le travail pour une stabilité
optimale. La contamination par des RNases presque omniprésentes (sur du matériel de
laboratoire, les doigts, la poussière) peut entraîner la dégradation de l’ARN purifié. Pour un
stockage à court terme, congeler l’ARN à -20 °C, pour un stockage à long terme, congeler à
-70 °C.
10
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
Extraction des ARN
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention :
Les tampons LB1, LB2 et MDB contiennent du sel chaotropique. Porter des gants et des
lunettes !
ATTENTION : Les tampons LB1, LB2 et MDB contiennent du sel chaotropique qui peut former
des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorite de
sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de
préparation des échantillons.
•
Tous les composants du kit doivent être conservés entre 15 et 25 °C et sont stables
jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Le stockage à des températures inférieures peut entraîner
la précipitation de sels.
Avant de débuter une procédure NucleoSpin® RNA Plus XS, préparer les éléments suivants :
•
Tampon de lavage WB2 : ajouter le volume indiqué d’éthanol à 96 – 100 % (voir tableau
ci-dessous) au tampon WB2 concentré. Marquer l’étiquette du flacon pour indiquer que
de l’éthanol a été ajouté. Le tampon de lavage WB2 peut être conservé à 15 – 25 °C
pendant au moins un an.
•
Si nécessaire, aliquoter l’eau RNase-free dans des tubes de 1,5 mL exempt de RNases
(non fournis) afin d’éviter une contamination accidentelle de l’eau par la RNases en cas
d’ouverture répétée du flacon.
NucleoSpin® RNA Plus XS
REF
Tampon de lavage
WB2 (concentré)
10 preps
740990.10
50 preps
740990.50
250 preps
740990.250
6 mL
Ajouter 24 mL
d’éthanol
12 mL
Ajouter 48 mL
d’éthanol
50 mL
Ajouter 200 mL
d’éthanol
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
11
Extraction des ARN
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® RNA Plus XS, porter des vêtements de
protection appropriés (p.e. une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de
protection). Pour plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité appropriées
(FDS disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds).
Attention : Le thiocyanate de guanidinium contenu dans les tampons LB1 et LB2 peut former
des composés très réactifs lorsqu’il est combiné à de l’eau de Javel ! Par conséquent,
n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation
d’échantillons.
Les déchets générés par le kit NucleoSpin® RNA Plus XS n’ont pas été testés pour détecter la
présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel
infectieux résiduel est très improbable en raison du traitement par tampon de lyse fortement
dénaturant, mais elle ne peut pas être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides
doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément
aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
12
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
Extraction des ARN
5
Protocole NucleoSpin® RNA Plus XS
Avant de débuter la procédure :
Vérifier si le tampon de lavage WB2 a été préparé conformément au chapitre 3.
1
Homogénéiser et lyser l’échantillon
Broyer et clarifier l’échantillon selon l’une des méthodes
décrites au chapitre 2.3 en utilisant 100 µL de tampon
de lyse LB1.
100 μL LB1
Homogénéiser
100 μL LB2
Cellules
Ajouter LB1 et vortexer vigoureusement.
Tissus
Homogénéiser en présence de LB1 en utilisant un pilon
de microtube ou par broyage avec des billes.
Clarifier les lysats de tissus par centrifugation pendant
3 min à 5000 x g. Si un culot visible est observé, il est
recommandé de transférer le surnageant dans un tube
frais et de jeter le culot.
Note : Le tube de lyse n’est pas inclus dans le kit. L’ajout
d’un agent réducteur (p.e. ß-mercaptoéthanol, DTT ou
TCEP) n’est pas nécessaire.
Ajouter un volume de tampon de lyse LB2 au lysat
(typiquement 100 µL) et mélanger.
Note : 100 µL de LB1 suffisent pour la lyse d’échantillons
d’un volume < 20 µL (p.e., 1 mg de tissu ou des
suspensions de cellules à faible titre). Pour la procédure
d’échantillons plus importants (p.e. suspensions
cellulaires de > 20 µL) ou si un volume de lysat plus
important est souhaité (p.e. pour le broyage avec les
billes), augmenter proportionnellement les volumes de
tampon de fixation LB1, LB2 et de solution de fixation
BSXS. Attention, il ne faut pas dépasser 180 µL de
LB1 (+ 180 µL de LB2 + 270 µL de BSXS) en raison du
volume restreint de la colonne et du tube collecteur. Si des
volumes plus importants de LB1 (REF 740368.30) et LB2
(REF 740369.30) sont utilisés, du tampon supplémentaire
doit être commandé séparément, voir 6.3 Informations de
commande.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
13
NucleoSpin® RNA Plus XS
2
Éliminer l’ADNg et filtrer le lysat
Placer une colonne NucleoSpin® gDNA Removal XS
(anneau jaune) dans un tube collecteur (2 mL, fourni),
transférer le lysat homogénéisé (~200 µL) dans la
colonne et centrifuger pendant 2 min à 100 x g suivi de
10 s à 11 000 x g.
Jeter la colonne et poursuivre le filtrat.
100 x g,
2 min
11,000 x g,
10 s
Note : S’assurer qu’il ne reste plus de liquide sur la
membrane de la colonne après la centrifugation. Si
nécessaire, répéter la centrifugation jusqu’à ce que tout
le liquide ait traversé la membrane. La faible vitesse de
centrifugation permet une élimination performante de
l’ADN génomique..
3
Ajuster les conditions de fixation de l’ARN
Ajouter 150 µL de solution de fixation BSXS (1,5
volume par rapport au LB1) au filtrat et bien mélanger
par en vortexant de manière modérée ou par pipetages
successifs.
150 μL BSXS
Mélanger
Note : Si le mélange se fait par vortex, il faut faire attention
à ne pas renverser de liquide, car le tube collecteur ne
dispose pas de couvercle.
4
Fixer l’ARN
Transférer la totalité du lysat (~350 µL) dans la
colonne NucleoSpin® RNA Plus XS (anneau bleu clair)
préassemblée avec un tube collecteur.
lcharger le lysat
300 x g,
1 min
Centrifuger pendant 1 min à 300 x g suivi de 10 s à
11 000 x g.
Note : Le filtrat peut rester dans le tube collecteur.
14
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
11,000 x g,
10 s
NucleoSpin® RNA Plus XS
5
Laver et sécher la membrane de silice
1er lavage
100 μL MDB
Ajouter 100 µL de tampon de lavage MDB sur la
colonne.
Centrifuger pendant 10 s à 11 000 x g.
Jeter le filtrat avec le tube collecteur et placer la colonne
dans un nouveau tube collecteur de 2 mL (fourni).
2ème lavage
Ajouter 500 µL de tampon WB2 sur la colonne.
11,000 x g,
10 s
500 μL WB2
Centrifuger pendant 10 s à 11 000 x g.
Jeter le filtrat et réutiliser le tube collecteur.
3ème lavage
Ajouter 200 µL de tampon WB2 sur la colonne.
11,000 x g,
10 s
200 μL WB2
Centrifuger pendant 2 min à pleine vitesse (< 20 000 x g)
pour sécher la membrane.
Placer la colonne dans un tube collecteur (1,5 mL,
fourni).
< 20,000 x g,
2 min
Note : Si, pour une raison quelconque, le niveau de
liquide dans le tube collecteur a atteint la colonne après la
centrifugation, jeter le filtrat et centrifuger à nouveau.
6
Eluer l’ARN
Ajouter 10 – 20 µL de H2O RNase-free et centrifuger
1 min à 11 000 x g.
10 – 20 μL
RNase-free
H2O
Note : Le volume d’élution peut varier de 5 µL à 30 µL.
11,000 x g,
1 min
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
15
NucleoSpin® RNA Plus XS
6
Annexes
6.1
Élimination de l’ADN
Si les échantillons à forte teneur initiale en ADN sont analysés par des applications en aval très
sensibles à la contamination par l’ADN, une digestion supplémentaire de l’ADN peut s’avérer
nécessaire. Le protocole pour les traitements à la DNase est donné ci-dessous.
Protocole A : digestion de l’ADN en solution
1
Digérer l’ADN (préparation de la réaction)
Ajouter 1 µL de tampon de réaction pour la rDNase et 0,1 µL de rDNase à 10 µL
d’ARN élué.
Note : On peut aussi mélanger au préalable 100 μL de tampon de réaction pour la
rDNase et 10 μL de rDNase et ajouter 1/10 de volume à un volume d’éluat d’ARN.
Agiter doucement le tube afin de mélanger la solution. Centrifuger doucement (environ
1 s à 1 000 x g) pour recueillir chaque gouttelette de la solution au fond du tube.
2
Incuber l’échantillon
Incuber pendant 10 min à 37 °C.
3
Repurifier l’ARN
Repurifier l’ARN à l’aide d’une procédure de purification de l’ARN appropriée, par
exemple en utilisant les kits NucleoSpin® RNA Clean-up ‑ou NucleoSpin® RNA Cleanup XS (voir 6.3 Informations de commande), ou par précipitation à l’éthanol.
Précipitation de l’éthanol, à titre d’exemple :
Ajouter 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M, pH 5,2 et 2,5 volumes d’éthanol
96 – 100 % à un volume d’échantillon. Mélanger soigneusement.
Incuber de quelques minutes à quelques heures à -20 °C ou 4 °C.
Note : Choisir des temps d’incubation longs si l’échantillon contient une faible
concentration d’ARN.
Des temps d’incubation courts sont suffisants si l’échantillon contient une forte
concentration d’ARN.
Centrifuger pendant 10 min à vitesse maximale.
Laver le culot d’ARN avec de l’éthanol à 70 %.
Sécher le culot d’ARN et remettre l’ARN en suspension dans du H₂O RNase-free.
16
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
Extraction des ARN
Protocole B : digestion de l’ADN sur colonne
1
Reconstitution de la rDNase
Ajouter 4 mL de tampon de réaction pour la rDNase dans un flacon de rDNAse de taille
F et dissoudre la DNase.
2
Digestion sur colonne
Suivre la procédure de purification conformément au paragraphe 5 jusqu’à ce que la
colonne ait été lavée avec 100 µL de tampon de lavage MDB (étape 5).
Appliquer 95 µL de mélange réactionnel rDNase directement au centre de la
membrane de silice de la colonne.
Incuber à température ambiante pendant 15 min.
Poursuivre la procédure 5.1, étape 5, en ajoutant 200 µL de tampon WB2 sur la colonne.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
17
Extraction des ARN
6.2
Guide de résolution des problèmes
Problème
Causes possibles et suggestions
Contamination par des RNases
•
ARN dégradé / ​
Pas d’ARN
Créer un environnement de travail exempt de RNases. Porter des
gants pendant toutes les étapes de la procédure. Changer de gants
fréquemment. Il est recommandé d’utiliser des tubes en polypropylène
stériles et jetables. Garder les tubes fermés dans la mesure du
possible pendant la préparation. La verrerie doit être autoclavée
pendant au moins 2 heures à 250 °C avant d’être utilisée.
Qualité insuffisante de l’échantillon
•
Contrôler la collecte, le stockage et la lyse des échantillons. Veiller à
ce que les échantillons soient récoltés, stockés et lysés de manière
adéquate afin de préserver l’intégrité de l’ARN. Voir le chapitre 3.
Mauvaise utilisation ou stockage inadéquat des réactifs
Faible qualité
ou rendement
de l’ARN
•
Les réactifs n’ont pas été correctement préparés. Ajouter le volume
indiqué d’éthanol à 96 % au tampon WB2 concentré et mélanger.
•
L’échantillon et les réactifs n’ont pas été complètement mélangés.
Toujours vortexer vigoureusement après l’ajout de chaque réactif.
•
Aucune solution de fixation BSXS n’a été ajoutée après la lyse. La
liaison de l’ARN à la membrane de silice n’est efficace qu’en présence
de la solution de fixation.
Stockage du kit
•
Conserver les composants du kit à température ambiante. Le
stockage à basse température peut provoquer une précipitation de
sel.
•
Garder les bouteilles bien fermées afin d’éviter l’évaporation ou la
contamination.
Ajuster le rendement et la pureté de vos acides nucléiques
www.mn-net.com/de/nucleic-acid-fine-tune
18
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
Extraction des ARN
La force ionique et le pH influencent l’absorption de l’A260 ainsi que le
rapport A260/A280.
Pour les mesures d’adsorption, utiliser 5 mM Tris pH 8.5 comme diluant.
Voir aussi :
•
Manchester, K L. 1995. Valeur des rapports A260/A280 pour la mesure
de la pureté des acides nucléiques. Biotechniques 19, 208 – 209.
•
Wilfinger, W W, Mackey, K et Chomczyski, P. 1997. Effet du pH et de
la force ionique sur l’évaluation spectrophotométrique de la pureté des
acides nucléiques. Biotechniques 22, 474 – 481.
Faible qualité
ou rendement Échantillons
de l’ARN (suite) • L’échantillon n’a pas été stocké correctement. Dans la mesure du
possible, utiliser du matériel frais. Si ce n’est pas possible, congeler
rapidement les échantillons dans de l’azote liquide. Les échantillons
doivent toujours être conservés à -70 °C. Ne jamais laisser les tissus
décongeler avant l’ajout du tampon de lyse LB1. Effectuer le broyage
des échantillons dans de l’azote liquide. Il est également possible
d’utiliser des solutions de stabilisation de l’ARN pour protéger l’ARN
de la dégradation (p.e. NucleoProtect® RNA ; voir informations de
commande).
•
Broyage et/ou homogénéisation insuffisants des échantillons. Assurer
un broyage complet de l’échantillon.
Contaminationdu thiocyanate de guanidinium
Faible rapport
A₂₆₀ / ​A₂₃₀
•
Charger soigneusement le lysat dans la colonne NucleoSpin® RNA
Plus XS et éviter une contamination de la partie supérieure de la
colonne et du couvercle de la colonne.
•
S’assurer qu’une quantité / ​concentration suffisante d’ARN est utilisée
pour la quantification afin que la valeur A230 soit significativement plus
élevée que le bruit de fond.
•
La mesure d’une faible quantité / ​concentration d’ARN entraînera des
valeurs instables du rapport A260/A230.
Échantillon
Colonne
NucleoSpin®
colmatée / ​
Faible qualité
ou rendement
de l’ARN
•
Utilisation d’une trop grande quantité d’échantillons. Une surcharge
peut entraîner une diminution du rendement global. Réduire la quantité
d’échantillon ou utiliser un plus grand volume de tampon de lyse.
•
Broyage et/ou homogénéisation insuffisants du matériel de départ.
Veiller à un broyage complet de l’échantillon et utiliser la colonne
NucleoSpin® gDNA Removal XS pour l’élimination de l’ADN et pour
faciliter l’homogénéisation du matériel de départ broyé.
•
Augmenter la force g et la durée de centrifugation si nécessaire.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
19
Extraction des ARN
Trop de matériel cellulaire utilisé
•
Réduire la quantité de cellules ou de tissus utilisés.
Le système de détection de l’ADN est trop sensible
•
La colonne NucleoSpin® gDNA Removal XS permet de réduire
efficacement la contamination par l’ADN. Toutefois, il n’est pas
possible de garantir que l’ARN purifié est exempt à 100 % d’ADN ; par
conséquent, dans des applications très sensibles, il peut encore être
possible de détecter de l’ADN. La probabilité de détection de l’ADN
par PCR augmente avec :
- le nombre de copies d’ADN par préparation : cible à copie unique
< cible plastidiale / ​mitochondriale < plasmide transfecté dans les
cellules
- diminution de la taille de l’amplicon PCR.
•
Utiliser si possible des cibles PCR plus grandes (p.e. > 500 bp) ou des
amorces encadrant des introns.
•
Utiliser le protocole additionnel 6.1 pour la digestion de la rDNase
en solution.
Contamination
de l’ARN
par l’ADN
génomique
Contamination par de l’éthanol ou du sel
•
Ne pas laisser le filtrat toucher la sortie de la colonne après le
deuxième lavage au tampon WB2. Veiller à centrifuger à la vitesse
correspondante pendant la durée correspondante afin d’éliminer
complètement le tampon éthanolique WB2.
Performance
• Vérifier que le tampon WB2 a été équilibré à la température ambiante
sous-optimale
avant utilisation. Le lavage à des températures plus basses réduit
de l’ARN
l’efficacité de l’élimination des sels par le tampon WB2.
dans les
expériences en Conserver correctement l’ARN purifié
aval
• L’ARN élué doit toujours être conservé sur de la glace pour une
stabilité optimale, car les traces de contamination par les RNases
omniprésentes (sur le matériel de laboratoire, les doigts, la poussière)
seront susceptibles de dégrader l’ARN purifié. Pour un stockage
à court terme, congeler à -20 °C, pour un stockage à long terme,
congeler à -70 °C.
Trop d’échantillons
Contamination
excessive en
ADNg
•
A : Utiliser 150 µL de LB1 et 50 µL de LB2 au lieu d’un rapport
1 :1. Ceci réduira la contamination par l’ADNg, mais également le
rendement ARN. Cependant le ratio ARN/ADN sera amélioré.
•
B : Effectuer une digestion de l’ADN en solution ou sur colonne
conformément au paragraphe 6.1.
Conserver correctement l’ARN purifié
20
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
Extraction des ARN
LB2 non appliqué
Pas de
rendement en
ARN
6.3
•
Pour des résultats optimaux, la lyse doit être effectuée dans le LB1,
puis le lysat doit être mélangé avec un volume de LB2. Si seule la LB1
est utilisée, l’ADN et l’ARN se fixeront à la colonne NucleoSpin® gDNA
Removal XS.
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
®
740990.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
®
NucleoSpin RNA Plus
740984.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
NucleoZOL
740404.200
200 mL
NucleoSpin RNA Plus XS
NucleoSpin® RNA Set for NucleoZOL
740406.50
50
®
740948.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
®
NucleoSpin RNA Clean-up XS
740903.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​5​0 / ​250
rDNase Set
740963
1
Tubes collecteurs
740600
1000
Tampon de lyse LB1
740368.30
30 mL
Tampon de lyse LB2
740369.30
30 mL
MN Bead Tubes Type A
740786.50
50
MN Bead Tubes Type C
740813.50
50
MN Bead Tube Holder
740469
1
NucleoProtect® RNA
740400.50 / ​.250 / ​.500
50 / ​250 / ​500 mL
NucleoSpin RNA Clean-up
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07
21
Extraction des ARN
6.4
Restrictions de l’utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils
ne sont pas destinés à être utilisés à d’autres fins. La description de l’utilisation prévue des
produits se trouve dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser
nos produits, veuillez respecter les instructions d’utilisation et les consignes de sécurité de la
fiche de données de sécurité respective du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL est accompagné d’une documentation indiquant les
spécifications et autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit qu’il répond aux
spécifications indiquées. La garantie fournie est limitée aux spécifications des données et aux
descriptions figurant dans la documentation originale de MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre
déclaration ou représentation, écrite ou orale, par les employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL, à l’exception des déclarations écrites signées par un responsable dûment
autorisé de MACHEREY‑NAGEL, n’est autorisée. Le consommateur ne doit pas s’y fier et elles
ne font pas partie d’un contrat de vente ou de cette garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenus en rapport avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL dans leur dernière édition, qui peuvent être consultées sur le site Web de
l’entreprise. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leurs applications sont susceptibles d’être modifiés. Par conséquent, veuillez
contacter notre équipe de service technique pour obtenir les dernières informations sur les
produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre distributeur local pour
obtenir des informations scientifiques générales. Les descriptions figurant dans la documentation
de MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Veuillez contacter :
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Tel.: +49 24 21 969‑333
support@mn‑net.com
Marques déposées / ​clause de non-responsabilité :
RNAlater® est une marque déposée d’AMBION, Inc.
NucleoSpin® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG
Vortex-Genie® 2 est une marque déposée de Scientific Industries.
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux
marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
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Plasmid DNA
Clean up
RNA
DNA
Viral RNA and DNA
Protein
High throughput
Accessories
Auxiliary tools
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