MACHEREY-NAGEL Biologie moléculaire Bioanalysis Manuel d’utilisation User manual ADN génomique des plantes n NucleoSpin® Plant II n NucleoSpin® Plant II Midi n NucleoSpin® Plant II Maxi April 2023 / Rev. 14 www.mn-net.com www.mn-net.com ADN génomique des plantes Protocol at a glance (Rev. 14) NucleoSpin® Plant II Mini 1 Homogén­ éi­sation des échantillons 2 Lyse cellulaire Midi 100 mg 400 mg 400 μL PL1 1,7 mL PL1 6 mL PL1 25 μL RNase A 100 μL RNase A 65 °C, 10 min 65 °C, 15 min 65 °C , 20 min Alternative Alternative Alternative 300 μL PL2 1,5 mL PL2 5,3 mL PL2 10 μL RNase A 25 μL RNase A 100 μL RNase A 65 °C, 10 min 65 °C, 15 min 65 °C, 20 min 75 μL PL3 200 μL PL3 700 μL PL3 sur glace, 5 min sur glace, 5 min sur glace, 5 min 4 500 × g, 10 min 4 500 × g, 10 min ≥ 11 000 × g, 2 min 4 Ajustement des conditions de fixation 450 μL PC 5 Fixation de l’ADN 2,3 mL PC ≥ 11 000 × g, 1 min 1er 400 μL PW1 2ième 700 μL PW2 1er 200 μL PW2 ≥ 11 000 × g, 2 min 50 μL PE 65 °C, 5 min ≥ 11 000 × g, 1 min Répéter l’étape d’élution 1 mL PW1 4 500 × g, 2 min 1er 4 500 × g, 2 min 2ième ≥ 11 000 × g, 1 min 3ième 10 mL PC 4 500 × g, 2 min ≥ 11 000 × g, 1 min 7 Elution de l’ADN 1500 mg 10 µL RNase A 3 Filtration / Clarification du lysat 6 Lavage et séchage de la membrane de silice Maxi 3 mL PW2 4 500 × g, 2 min 2ième 4 500 × g, 2 min 3ième 1 mL PW2 4 mL PW1 10 mL PW2 4 500 × g, 2 min 3ième 2 mL PW2 4 500 × g, 10 min 4 500 × g, 10 min 200 μL PE 1000 μL PE 65 °C, 5 min 65 °C, 5 min 4 500 × g, 2 min 4 500 × g, 2 min Répéter l’étape d’élution Répéter l’étape d’élution MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com ADN génomique des plantes Sommaire 1 Composants 4 1.1 Contenu du kit 4 1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur 6 1.3 A propos de ce manuel 6 2 Description du produit 7 2.1 Principe général 7 2.2 Caractéristiques du kit 8 2.3 Stockage des échantillons de plantes 9 2.4 Homogénéisation des échantillons de plantes 9 2.5 Lyse des échantillons de plantes 10 2.6 Procédures d’élution 13 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs 15 4 Instructions de sécurité 17 4.1 Elimination des déchets ® 5 Protocoles NucleoSpin Plant II 17 18 5.1 ADN génomique des plantes 18 5.2 ADN génomique de champignons 22 5.3 ADN génomique provenant du sol, du compost, du fumier et des excréments d’animaux 23 ® 24 ® 7 Protocole NucleoSpin Plant II Maxi 28 8 Annexes 32 6 Protocole NucleoSpin Plant II Midi 8.1 Guide de résolution des problèmes 32 8.2 Informations de commande 34 8.3 Restrictions d’utilisation / garantie 35 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 3 ADN génomique des plantes 1 Composants 1.1 Contenu du kit NucleoSpin® Plant II 10 preps 740770.10 50 preps 740770.50 250 preps 740770.250 Tampon de lyse PL1 5 mL 25 mL 125 mL Tampon de lyse PL2 4 mL 20 mL 100 mL Tampon de précipitation PL3 1 mL 10 mL 25 mL Tampon de fixation PC 6 mL 30 mL 125 mL Tampon de lavage PW1 6 mL 30 mL 125 mL Tampon de lavage PW2 (Concentré)* 6 mL 25 mL 50 mL Tampon d’élution PE** 13 mL 13 mL 30 mL RNase A (lyophilisée)* 1,5 mg 6 mg 2 × 15 mg Filtres NucleoSpin® Plant (anneaux violets) 10 50 250 Colonnes NucleoSpin® Plant II (anneaux verts) 10 50 250 Tubes collecteurs (2 mL) 20 100 500 Manuel d’utilisation 1 1 1 REF * Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3. ** Composition du tampon d’élution PE : 5 mM Tris/HCl, pH 8,5 4 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 ADN génomique des plantes Contenu du kit suite NucleoSpin® Plant II Midi NucleoSpin® Plant II Maxi 20 preps 740771.20 10 preps 740772.10 Tampon de lyse PL1 75 mL 75 mL Tampon de lyse PL2 60 mL 60 mL Tampon de précipitation PL3 10 mL 10 mL Tampon de fixation PC 60 mL 125 mL Tampon de lavage PW1 30 mL 75 mL Tampon de lavage PW2 (Concentré)* 25 mL 50 mL Tampon d’élution PE** 13 mL 30 mL RNase A (lyophilisée)* 6 mg 10 mg Filtres NucleoSpin® Plant Midi / Maxi (plus tubes collecteurs) 20 10 NucleoSpin® Plant II Colonnes Midi / Maxi ( plus tubes collecteurs) 20 10 Tubes collecteurs (15 mL / 50 mL) 20 10 Manuel d’utilisation 1 1 REF * Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3. ** Composition du tampon d’élution PE : 5 mM Tris/HCl, pH 8,5 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 5 ADN génomique des plantes 1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur Réactifs • 96 – 100 % d’éthanol Consommables • Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (NucleoSpin® Plant II) ou tubes de 15 / 50 mL (NucleoSpin® Plant II Midi / Maxi) pour l’élution • Cônes de pipette jetables Equipement • Pipettes manuelles • Centrifugeuse pour microtubes (NucleoSpin® Plant II) ou centrifugeuse appropriée avec rotors pivotants capable d’atteindre 4 500 × g pour des tubes de 15 mL / 50 mL (NucleoSpin® Plant II Midi / Maxi). • Bloc chauffant ou bain-marie pour l’incubation et le préchauffage du tampon d’élution PE (à 65 °C) • Équipement pour le broyage et l’homogénéisation des échantillons (voir paragraphe 2.4) • Équipements de protection individuelle (blouse, gants, lunettes) 1.3 A propos de ce manuel Il est fortement recommandé de lire les paragraphes détaillés du protocole de ce manuel d’utilisation si le kit NucleoSpin® Plant II / Midi / Maxi est utilisé pour la première fois. Les utilisateurs expérimentés peuvent cependant se référer au résumé du protocole. Le résumé du protocole est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil supplémentaire de référence rapide pendant l’exécution de la procédure de purification. Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante : www.mnnet.com. Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes. 6 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 ADN génomique des plantes 2 Description du produit 2.1 Principe général Les échantillons de plantes sont homogénéisés par traitement mécanique. L’ADN peut ensuite être extrait avec des tampons de lyse PL1 ou PL2 contenant des sels chaotropiques, des agents dénaturants et des détergents. Les lysats bruts doivent être clarifiés par centrifugation et/ou filtration à l’aide des filtres NucleoSpin® Plant fournis avec les kits afin d’éliminer les polysaccharides, les contaminations et les débris cellulaires résiduels. Le filtrat clarifié est mélangé au tampon de fixation PC pour créer les conditions d’une fixation optimale de l’ADN sur la membrane de silice. Après avoir chargé ce mélange sur la colonne, les contaminants sont éliminés à l’aide des tampons de lavage PW1 et PW2. L’ADN génomique peut enfin être élué avec le tampon d’élution PE à faible teneur en sel (5 mM Tris/HCl, pH 8,5) ou de l’eau exempte de nucléase et est prêt à être utilisé pour les réactions suivantes. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 7 ADN génomique des plantes 2.2 Caractéristiques du kit • Les kits NucleoSpin® Plant II sont conçus pour l’extraction d’ADN génomique à partir de tissus végétaux à l’aide de deux systèmes de tampons de lyse optimisés basés sur les méthodes CTAB et SDS établies. • Les filtres NucleoSpin® Plant sont inclus pour clarifier facilement les lysats bruts. • La RNase A est incluse pour éliminer l’ARN et permettre la quantification photométrique de l’ADN génomique pur. • Le tampon de fixation PC optimisé et le tampon de lavage PW1 chaotropique éliminent complètement les protéines, l’ARN, les métabolites et autres inhibiteurs de la PCR. • L’ADN élué est prêt à être utilisé pour des réactions ultérieures telles que la PCR, l’analyse de restriction, le Southern Blot, etc. • Réserver à l’usage de la recherche Table 1: Résumé des caractéristiques du kit NucleoSpin® Plant II NucleoSpin® Plant II Midi NucleoSpin® Plant II Maxi Technologie Technologie membrane de silice Technologie membrane de silice Technologie membrane de silice Format Mini colonnes à centrifuger Midi colonnes à centrifuger Maxi colonnes à centrifuger Échantillon Jusqu’à 100 mg de poids humide Jusqu’à 20 mg de poids sec Jusqu’à 400 mg de poids humide Jusqu’à 80 mg de poids sec Jusqu’à 1500 mg de poids humide Jusqu’à 300 mg de poids sec Clarification du lysat Filtres NucleoSpin® Plant Filtres NucleoSpin® Plant Midi Filtres NucleoSpin® Plant Maxi Taille du fragment 50 pb environ 50 kbp 50 pb environ 50 kbp 50 pb environ 50 kbp Rendement typique 1 – 30 μg 10 – 100 μg 50 – 300 μg A260/A280 1.8 – 1.9 1.8 – 1.9 1.8 – 1.9 Volume d’élution 2 × 50 μL 200 – 400 μL 1000 – 2000 μL Temps de préparation 30 min/6 preps 90 min/6 preps 90 min/6 preps Capacité de fixation 50 μg 200 μg > 500 μg Paramètres 8 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 ADN génomique des plantes 2.3 Stockage des échantillons de plantes Les échantillons de plantes peuvent être conservés dans de l’éthanol, lyophilisés ou congelés. Le matériel frais peut être conservé à 4 °C pendant un jour, mais doit être congelé à -20 °C pour une conservation plus longue. 2.4 Homogénéisation des échantillons de plantes Les tissus végétaux étant très robustes, la procédure de lyse est plus efficace avec des échantillons bien homogénéisés et réduits en poudre. Les méthodes appropriées comprennent tout type d’homogénéisateurs commerciaux (homogénéisateur à rotor-stator) ou des broyeurs à billes utilisant des billes d’acier ou de verre. Cependant, nous recommandons de broyer avec un mortier et un pilon en présence d’azote liquide pour obtenir des rendements optimaux. Après homogénéisation et traitement de l’échantillon avec du tampon de lyse, le lysat brut peut être clarifié facilement soit avec des filtres NucleoSpin® Plant, soit par centrifugation. Méthodes d’homogénéisation des échantillons • Homogénéisation avec un mortier et un pilon en présence d’azote liquide : Congeler le matériel végétal dans de l’azote liquide et ne pas laisser l’échantillon se décongeler à tout moment pendant l’homogénéisation. Prérefroidir le mortier et le pilon à l’aide d’azote liquide. Broyer soigneusement l’échantillon congelé jusqu’à obtention d’une poudre fine et remplir de temps en temps le mortier avec de l’azote liquide pour maintenir l’échantillon congelé. Utiliser une spatule préalablement refroidie pour transférer l’échantillon dans des tubes préalablement refroidis. S’assurer qu’aucun azote liquide n’est transféré ou que tout l’azote s’est évaporé avant de fermer le tube. • Billes d’acier VA : Mettre 4 – 5 billes (diamètre : 7 mm) et le matériel végétal dans un tube en plastique de 15 mL (Falcon), refroidir le tube dans de l’azote liquide et vortexer pendant environ 30 secondes (p.e. avec un Multi Pulse Vortex, Schütt Labortechnik GmbH, www. schuett-labortechnik.de). Répéter la procédure de refroidissement et de vortex jusqu’à ce que l’ensemble du matériel végétal soit broyé en une fine poudre. Refroidir le tube une fois de plus et retirer les billes en les faisant rouler doucement ou en utilisant un aimant. Maintenir le matériel congelé pendant toute la durée de la procédure d’homogénéisation. Ne pas ajouter d’azote dans le tube, car cela entraîne l’agglomération et la perte du matériel végétal attaché aux billes. • Les homogénéisateurs à rotor-stator ne sont utiles que pour broyer les plantes molles en présence d’un tampon de lyse. Maintenir l’homogénéisateur immergé en permanence pour réduire la formation de mousse. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 9 ADN génomique des plantes 2.5 Lyse des échantillons de plantes Augmentation de la quantité des échantillons Les protocoles standard des kits NucleoSpin® Plant II / Midi / Maxi permettent la procédure de 10 à 1500 mg de matériel végétal. Cela permet généralement d’obtenir 1 à 300 μg d’ADN de haute qualité. Cependant, la quantité d’ADN à laquelle on peut s’attendre par mg d’échantillon dépend de la taille et de la ploïdie du génome. Par exemple, 100 mg de blé frais avec un génome hexaploïde (1,7 × 1010 pb) contiennent 30 μg d’ADN, alors que la même quantité d’Arabidopsis avec un génome diploïde plus petit (1,9 × 108 pb) ne donne que 3 μg d’ADN. Ainsi, il peut être avantageux de réaliser une procédure avec plus de masse d’échantillon recommandée (jusqu’à 5 fois) pour obtenir un rendement raisonnable d’ADN. Cependant, pour assurer une lyse complète, tous les volumes de tampon de lyse de l’étape 2 du protocole doivent être augmentés proportionnellement et de multiples étapes de chargement sont nécessaires. Des tampons de lyse supplémentaires (PL1, PL2, PL3, RNase) doivent être achetés séparément (voir informations de commande). Choix du système optimal de tampons de lyse Les plantes sont très hétérogènes et contiennent des quantités variables de polyphénols, de composants acides ou de polysaccharides qui peuvent conduire à une extraction moins performante en quantité d’ADN ou dans les applications avales. C’est pourquoi nous proposons deux tampons de lyse différents pour une procédure optimale, des rendements élevés et une excellente qualité d’ADN avec la plupart des espèces végétales. Le protocole standard utilise le tampon de lyse PL1, qui est basé sur la procédure CTAB établie. En outre, le tampon de lyse PL2 à base de SDS est également fourni et nécessite une précipitation ultérieure des protéines par l’acétate de potassium (tampon de précipitation PL3). Pour certaines espèces végétales, les tampons de lyse PL1 et PL2 peuvent être utilisés avec des résultats similaires. Cependant, pour la plupart du matériel végétal, l’efficacité de la lyse est différente en raison de la charge négative du SDS et de la charge positive du CTAB. Le tableau 2 donne un aperçu des données des clients sur différentes espèces de plantes et le système de tampon correspondant qui a été testé avec succès en utilisant le kit NucleoSpin® Plant II. Important ! Pour une grande variété d’espèces végétales, les deux tampons de lyse permettent d’obtenir de bons résultats. Le tableau 2 n’est utilisé que pour une orientation approximative et pour indiquer quel système de tampons a déjà été testé. Afin de trouver les conditions optimales de lyse lors de la première utilisation d’un certain échantillon de plante, il est recommandé d’effectuer des préparations en parallèle d’un lot de matériel broyé de manière homogène avec les deux tampons de lyse. 10 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 ADN génomique des plantes Table 2: Espèces végétales testées avec NucleoSpin® Plant II Tampon de lyse testé avec succès Espèces végétales Tissu végétal / organe Abies alba (sapin) Aiguille Acer griseum Feuille Amorphophallus titanum Feuille Non testé Apium graveolens (céleri) Corm Arabidopsis thaliana Feuille Boreava orientalis Feuille, échantillon d’herbier Carex annectens Feuille Carex waponahkikensis Feuille, séchée au gel de silice Cleisostoma racemiferum Rachis d’inflorescence, séché sur gel de silice Non testé Doritis pulcherrima Feuille, séchée au gel de silice Non testé Eichornia azurea Feuille Non testé Encephalartos natalensis Feuille Non testé Galium aparine Feuille Hordeum sp. (orge) Feuille Isatis kotschyana Feuille, échantillon d’herbier Laurus azorica (laurier) Feuille Non testé Lupinus sp. (lupin) Feuille Lycopersicon esculentum (tomate) Tige Myagrum perfoliatum Feuille, échantillon d’herbier Oryza sativa (riz) Feuille Persea feru./caerulea Feuille Non testé Pteridium sp. Feuille Non testé Pterocarya fraxiniofolia Feuille Non testé MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 PL1 PL2 11 ADN génomique des plantes Table 2: Espèces végétales testées avec NucleoSpin® Plant II Quercus cerris Feuille Quercus frainetto Feuille Rosa sp. (rose) Feuille Rubus fruticosus (mûre) Feuille Sameraria nummularia Feuille, échantillon d’herbier Secale sp. (seigle) Feuille Stereochilus sp. Feuille, séchée au gel de silice Non testé Tauscheria lasiocarpum Feuille, échantillon d’herbier Trachycarpus takil Feuille Non testé Trichoglottis sp. Feuille, séchée au gel de silice Non testé Triticum aestivum (blé) Feuille Vigna radiata (haricot mungo) Racine Zea mays (maïs) Feuille Zea mays (maïs) Céréales, séchées, broyées grossièrement Mycélium fongique (non spécifié) Non testé Algues vertes (non spécifiées) Non testé 12 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 ADN génomique des plantes 2.6 Procédures d’élution Les graphiques suivants montrent les rendements d’ADN (ligne continue) et les concentrations d’ADN résultantes (ligne pointillée) en fonction du volume du tampon d’élution. L’élution se fait soit en une seule étape d’élution (A), soit en deux étapes d’élution successives avec le volume de tampon d’élution indiqué chacune (B). 0.40 DNA yield [µg] 20 B A 15 0.35 0.30 0.25 0.20 10 A 5 B 0 0.15 0.10 DNA concentration [µg/µL] 0.45 25 0.05 0 0 25 50 75 100 125 Elution volume [µL] Figure 1 Profil d’élution du NucleoSpin® Plant II L’ADN génomique de 100 mg de feuilles de blé fraîches a été purifié et élué une fois (A) ou deux fois (B) avec 10 – 125 μL de tampon PE. Le rendement et la concentration résultants sont représentés par des lignes continues et pointillées, respectivement. 0.40 90 B 80 A 70 0.35 0.30 60 0.25 50 0.20 40 A 30 20 B 10 0 0 100 200 300 400 500 600 0.15 0.10 DNA concentration [µg/µL] DNA yield [µg] 100 0.05 0.00 700 Elution volume [µL] Figure 2 Profil d’élution du NucleoSpin® Plant II Midi L’ADN génomique de 400 mg de feuilles de blé fraîches a été purifié et élué une fois (A) ou deux fois (B) avec 100 – 600 μL de tampon PE. Le rendement et la concentration obtenus sont représentés par des lignes continues et pointillées, respectivement. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 13 ADN génomique des plantes 180 B 160 A 140 0.16 0.14 0.12 0.10 120 100 0.08 80 60 40 A 0.06 B 0.04 DNA concentration [µg/µL] DNA yield [µg] 200 0.02 20 0 0 500 1000 1500 2000 2500 0 3000 Elution volume [µL] Figure 3 Profil d’élution de NucleoSpin® Plant II Maxi L’ADN génomique de 1000 mg de feuilles de blé fraîches a été purifié et élué une fois (A) ou deux fois (B) avec 500 – 2500 μL de tampon PE. Le rendement et la concentration résultants sont représentés par des lignes continues et pointillées, respectivement. Une double élution permet généralement d’obtenir plus d’ADN qu’une seule élution avec le même volume total de tampon. Ceci est particulièrement important pour les petits volumes de tampon. Cependant, les grands volumes ou l’élution en deux fois entraînent une concentration d’ADN plus faible. La procédure d’élution standard est déjà optimisée pour obtenir un rendement de 80 à 90 % en procédant à une double élution à des températures élevées. Toutefois, si des rendements encore plus élevés, une concentration plus importante ou une vitesse maximale sont nécessaires, la procédure d’élution peut être adaptée : Table 3: Paramètres d’élution Procédure ( % du rendement exp.) NucleoSpin® Plant II NucleoSpin® Plant II Midi NucleoSpin® Plant II Maxi Elution standard (85 – 90 %) 50 μL + 50 μL 65 °C, 5 min 200 μL + 200 μL 65 °C, 5 min 1000 μL + 1000 μL 65 °C, 5 min Rendement maximal (95 – 100 %) 100 μL + 100 μL 65 °C, 5 min 400 μL + 400 μL 65 °C, 5 min 2000 μL + 2000 μL 65 °C, 5 min Concentration élevée (75 %) 25 μL + 25 μL 65 °C, 5 min 100 μL + 100 μL 65 °C, 5 min 500 μL + 500 μL 65 °C, 5 min Elution rapide (60 – 70 %) 100 μL TA / 65 °C, 1 – 5 min 400 μL TA / 65 °C, 1 – 5 min 2000 μL TA / 65 °C, 1 – 5 min 14 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 ADN génomique des plantes 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention : Les tampons PL1, PL2, PC et PW1 contiennent du chlorhydrate de guanidine et/ou des détergents comme le CTAB ou le SDS ! Porter des gants et des lunettes ! ATTENTION : Les tampons PC et PW1 contiennent du chlorhydrate de guanidine qui peut former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorite de sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation des échantillons. Tous les composants du kit peuvent être conservés à une température comprise entre 15 et 25 °C et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Avant de débuter une procédure NucleoSpin® Plant II, préparer les éléments suivants : • Tampon de lyse PL1 / PL2 : Vérifier s’il y a un précipité de détergent, en particulier après un stockage à des températures inférieures à 20 °C. Si nécessaire, incuber le flacon pendant plusieurs minutes à 30 – 40 °C et bien mélanger jusqu’à ce que le précipité soit complètement redissous. • Tampon de lavage PW2 : Ajouter le volume d’éthanol (96 – 100 %) indiqué sur le flacon ou dans le tableau ci-dessous au tampon PW2 concentré avant la première utilisation. Marquer l’étiquette du flacon pour indiquer que l’éthanol a été ajouté. Le tampon PW2 est stable à 15 – 25 °C pendant au moins un an. • RNase A : ajouter à la RNase A lyophilisée le volume d’eau indiqué sur le flacon et dans le tableau ci-dessous. Conserver la solution de RNase A à 4 °C pendant 3 mois au maximum. Pour une conservation plus longue (jusqu’à 1 an), la solution de RNase A doit être divisée en petites aliquotes et conservée à -20 °C. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 15 NucleoSpin® Plant II NucleoSpin® Plant II 10 preps 740770.10 50 preps 740770.50 250 preps 740770.250 Tampon de lavage PW2 (concentré) 6 mL ajouter 24 mL d’ éthanol 25 mL ajouter 100 mL d’éthanol 50 mL ajouter 200 mL d’éthanol RNase A 1,5 mg dissous dans 150 μL H2O 6 mg dissoudre dans 600 μL H2O 2 × 15 mg à dissoudre dans 1500 μL H2O chacun REF NucleoSpin® Plant II Midi NucleoSpin® Plant II Maxi 20 preps 740771.20 10 preps 740772.10 Tampon de lavage PW2 (concentré) 25 mL ajouter 100 mL d’éthanol 50 mL ajouter 200 mL d’éthanol RNase A 6 mg dissoudre dans 600 μL H2O 10 mg dissoudre dans 1100 μL H2O 16 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 REF NucleoSpin® Plant II 4 Instructions de sécurité Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® Plant II, portez des vêtements de protection appropriés (p.e. une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds). Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon PC et le tampon PW1 peut former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, ne pas ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation des échantillons. Les déchets générés par le NucleoSpin® Plant II n’ont pas été testés pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement dénaturant, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales. 4.1 Elimination des déchets Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 17 NucleoSpin® Plant II 5 Protocoles NucleoSpin® Plant II 5.1 ADN génomique des plantes Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon de lavage PW2 et la RNase A ont été préparés conformément au paragraphe 3. • Préchauffer le tampon d’élution PE à 65 °C. Note : Les kits NucleoSpin® Plant II comprennent deux tampons de lyse différents pour des résultats optimaux avec la plupart des espèces de plantes courantes. Veuillez-vous référer au paragraphe 2.5 pour choisir le système de tampon de lyse optimal pour votre échantillon de plante et pour obtenir des informations sur la façon de traiter encore plus d’échantillons que ce qui est recommandé dans le protocole suivant. 1 Homogénéisation de l’échantillon Homogénéiser jusqu’à 100 mg de poids humide ou jusqu’à 20 mg de poids sec (lyophilisé) de matériel végétal (pour les méthodes d’homogénéisation, voir le paragraphe 2.4). Homogénéiser les échantillons Procéder à la lyse cellulaire en utilisant le tampon PL1 (étape 2 a) ou alternativement le tampon PL2 (étape 2 b). 2a Lyse cellulaire à l’aide du tampon PL1 Transférer la poudre obtenue dans un nouveau tube et ajouter 400 μL de tampon PL1. Vortexer soigneusement le mélange. Note : Si l’échantillon ne peut pas être remis en suspension facilement parce que, par exemple, la poudre de plantes absorbe trop de tampon, il est possible d’ajouter du tampon PL1. Note : Les volumes de RNase A (étape 2 a) et de tampon PC (étape 4) doivent être augmentés proportionnellement. Ajouter 10 μL de solution de RNase A et mélanger soigneusement l’échantillon. Incuber la suspension pendant 10 min à 65 °C. Note : Pour certaines plantes, il peut être avantageux d’augmenter le temps d’incubation à 30 – 60 min. Passez à l’étape 3. 18 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 + 400 μL PL1 + 10 μL RNase A 65 °C, 10 min NucleoSpin® Plant II 2b Lyse cellulaire à l’aide du tampon PL2 Transférer la poudre obtenue dans un nouveau tube et ajouter 300 μL de tampon PL2. Vortexer soigneusement le mélange. Note : Si l’échantillon ne peut pas être remis en suspension facilement parce que, par exemple, la poudre de plantes absorbe trop de tampon, il est possible d’ajouter du tampon PL2. Note : Les volumes de RNase A, de tampon PL3 (étape 2b) et de tampon PC (étape 4) doivent être augmentés proportionnellement. Ajouter 10 μL de solution de RNase A et mélanger soigneusement l’échantillon. Incuber la suspension pendant 10 min à 65 °C. + 300 μL PL2 + 10 μL RNase A 65 °C, 10 min + 75 μL PL3 sur glace 5 min Note : Pour certaines plantes, il peut être avantageux d’augmenter le temps d’incubation à 30 – 60 min. Ajouter 75 μL de tampon PL3, mélanger soigneusement et incuber pendant 5 minutes sur la glace pour précipiter complètement le SDS. Passez à l’étape 3. 3 Filtration / Clarification du lysat brut Placer un filtre NucleoSpin® (anneau violet) dans un nouveau tube collecteur (2 mL) et charger le lysat sur la colonne. Centrifuger pendant 2 min à 11 000 × g, recueillir le filtrat clarifié et jeter le filtre NucleoSpin®. Si tout le liquide n’est pas passé sur le filtre, répéter l’étape de centrifugation. 11 000 × g, 2 min Si un culot est visible dans le filtrat, transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni). Alternativement, centrifuger le lysat brut pendant 5 min à 11 000 × g et transférer le surnageant dans un nouveau tube ou passer le surnageant pré-clarifié à travers le filtre NucleoSpin® pour éliminer complètement les particules solides. 4 Ajustement des conditions de fixation de l’ADN Ajouter 450 μL de tampon PC et mélanger soigneusement en pipettant de haut en bas (5 fois) ou en vortexant. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 + 450 μL PC 19 NucleoSpin® Plant II 5 Fixation de l’ADN Placer une colonne NucleoSpin® Plant II (anneau vert) dans un nouveau tube collecteur (2 mL) et charger un maximum de 700 μL de l’échantillon. Centrifuger pendant 1 min à 11 000 × g et jeter le filtrat. La capacité de chargement maximale de la colonne NucleoSpin® Plant II est de 700 μL. Pour des volumes d’échantillons plus importants, répéter l’étape de chargement. 6 11 000 × g, 1 min Lavage et séchage de la membrane de silice + 400 μL PW1 1er lavage Ajouter 400 μL de tampon PW1 à la colonne NucleoSpin® Plant II. Centrifuger pendant 1 min à 11 000 × g et jeter le filtrat. Note : Bien que le lavage avec le tampon PW1 augmente la pureté, il peut dans certains cas réduire légèrement le rendement final. 2ème lavage Ajouter 700 μL de tampon PW2 à la colonne NucleoSpin® Plant II. Centrifuger pendant 1 min à 11 000 × g et jeter le filtrat. 3 ème lavage Ajouter à nouveau 200 μL de tampon PW2 à la colonne NucleoSpin® Plant II. Centrifuger pendant 2 min à 11 000 × g afin d’éliminer le tampon de lavage et de sécher complètement la membrane de silice. 20 Charger le lysat MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 11 000 × g, 1 min + 700 μL PW2 11 000 × g, 1 min + 200 μL PW2 11 000 × g, 2 min NucleoSpin® Plant II Midi 7 Elution de l’ADN Placer la colonne NucleoSpin® Plant II dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni). Pipeter 50 μL de tampon PE (65 °C) sur la membrane. Incuber la colonne NucleoSpin® Plant II pendant 5 min à 65 °C. Centrifuger pendant 1 min à 11 000 × g pour éluer l’ADN. Répéter cette étape avec 50 μL de tampon PE supplémentaire (65 °C) et éluer dans le même tube. Note : Pour obtenir un rendement maximal ou des concentrations plus élevées, se référer au paragraphe 2.6 pour les procédures d’élution alternatives. + 50 μL PE 65 °C, 5 min 11 000 × g, 1 min + 50 μL PE 65 °C, 5 min 11 000 × g, 1 min Le tampon d’élution PE ne contient pas d’EDTA. Si une dégradation de l’ADN est observée après le stockage de l’ADN purifié, ajuster l’EDTA dans le tampon PE à 1 mM avant l’élution. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 21 NucleoSpin® Plant II Midi 5.2 ADN génomique de champignons Attention : Des réactifs et du matériel supplémentaires sont nécessaires ! • Éthanol (96 – 100 %) • Chloroforme • Micro-pistill • MN Bead Tubes Type B ou sable de mer 1 Homogénéisation de l’échantillon Laver 50 à 200 mg de mycélium (poids frais) ou de matériel provenant d’une fructification de macrochampignons dans de l’éthanol. Le mycélium peut être obtenu à partir d’une culture liquide ou gratté (avec ou sans agar) à la surface d’un milieu solide. Recouvrir entièrement l’échantillon d’éthanol et mélanger soigneusement. Un court lavage à l’éthanol est suffisant dans la plupart des cas, bien qu’une incubation d’une nuit augmente parfois le rendement en ADN (le stockage à long terme dans l’éthanol est également possible). Retirer l’éthanol en pipettant et en pressant le mycélium. 2 Lyse cellulaire Placer l’échantillon dans des MN Bead Tubes Type B ou dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni) avec 150 mg de sable de mer et ajouter 200 µL de Buffer PL1. Homogénéiser l’échantillon à l’aide d’un micro-pistil et vortexer régulièrement. Ajouter 100 μL supplémentaires de tampon PL1 et continuer à homogénéiser l’échantillon. Note : Si l’échantillon ne peut pas être manipulé facilement parce que, par exemple, l’échantillon absorbe trop de tampon, il est possible d’ajouter du tampon PL1. Note : Le volume de tampon PC (étape 4) doit être augmenté proportionnellement. Optionnel : Si l’échantillon est riche en ARN ou en protéines, nous recommandons d’ajouter 10 μL de RNase A et/ou de protéinase K (5 – 10 mg / mL de solution mère, voir Informations commande), respectivement, à la solution de lyse de PL1 afin de minimiser les contaminants. Incuber pendant 10 min à 65 °C. Pour certains champignons, il peut être avantageux d’augmenter le temps d’incubation à 30 – 60 min. Ajouter 100 μL de chloroforme. Vortexer pendant 10 s et séparer les phases par centrifugation pendant 15 min à 20 000 × g. Pipeter la couche aqueuse supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni). Passer au paragraphe 5.1, étape 3. 22 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 NucleoSpin® Plant II Midi 5.3 ADN génomique provenant du sol, du compost, du fumier et des excréments d’animaux Attention : Un équipement supplémentaire est nécessaire ! • Broyeur à billes (p.e. Pulverisette 0, Fritsch - Idar-Oberstein) ou mortier / pilon • Sable de mer • Extraction buffer: 2 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris/HCl, 2 % (w / v) CTAB, 2 % (w / v) Polyvinylpyrrolidon (MW 40,000), pH 8.0 1 Homogénéisation de l’échantillon Peser 5 g de sol ou 2 g de fumier dans une boîte de Petri. Ajouter du tampon d’extraction jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement imbibé. Chauffer l’échantillon dans un four à micro-ondes (400 W) pendant quelques secondes jusqu’à ce que le tampon d’extraction mousse. Un tampon d’extraction peut être ajouté pour maintenir l’échantillon en suspension. 2 Lyse cellulaire Transférer l’échantillon dans un broyeur de billes ou un mortier. Ajouter 0,5 mL de sable de mer et broyer l’échantillon. 3 Filtration / Clarification du lysat Transférer l’échantillon homogénéisé dans un tube à centrifuger (p.e., Sorvall SS34) et centrifuger pendant 10 min à 5 000 × g. Pipeter 300 μL du surnageant clarifié dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni). Passer au paragraphe 5.1, étape 3. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 23 NucleoSpin® Plant II Maxi 6 Protocole NucleoSpin® Plant II Midi Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon de lavage PW2 et la RNase A ont été préparés conformément au paragraphe 3. • Préchauffer le tampon d’élution PE à 65 °C. • Une centrifugeuse avec un rotor pivotant et des godets appropriés capables d’atteindre 4 500 × g est nécessaire. Note : les kits NucleoSpin® Plant II Midi comprennent deux tampons de lyse différents pour des résultats optimaux avec la plupart des espèces de plantes. Veuillez-vous référer à la section 2.5 pour choisir le système de tampon de lyse optimal adapté à votre échantillon de plante et pour obtenir des informations si vous souhaitez partir de plus de matériel de départ que ce qui est recommandé dans le protocole suivant. 1 Homogénéisation de l’échantillon Homogénéiser jusqu’à 400 mg de poids humide ou jusqu’à 80 mg de poids sec (lyophilisé) de matériel végétal (pour les méthodes d’homogénéisation, voir le paragraphe 2.4). Homogénéiser les échantillons Procéder à la lyse cellulaire en utilisant le tampon PL1 (étape 2 a) ou alternativement le tampon PL2 (étape 2 b). 2 Lyse cellulaire à l’aide du tampon PL1 Transférer la poudre obtenue dans un nouveau tube et ajouter 1,7 mL de tampon PL1. Vortexer soigneusement le mélange. Note : Si l’échantillon ne peut pas être remis en suspension facilement parce que, par exemple, la poudre de plante absorbe trop de tampon, il est possible d’ajouter du tampon PL1. Note : les volumes de RNase A (étape 2 a) et de tampon PC (étape 4) doivent être augmentés proportionnellement. Ajouter 25 μL de solution de RNase A et mélanger soigneusement l’échantillon. Incuber la suspension pendant 15 min à 65 °C. Note : Pour certaines plantes, il peut être avantageux d’augmenter le temps d’incubation à 30 – 60 min. Passer à l’étape 3. 24 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 + 1,7 mL de PL1 + 25 μL RNase A 65 °C, 15 min NucleoSpin® Plant II Maxi 2b Lyse cellulaire à l’aide du tampon PL2 Transférer la poudre obtenue dans un nouveau tube et ajouter 1,5 mL de tampon PL2. Vortexer soigneusement le mélange. Note : Si l’échantillon ne peut pas être remis en suspension facilement parce que, par exemple, la poudre de plantes absorbe trop de tampon, il est possible d’ajouter du tampon PL2. Note : les volumes de RNase A, de tampon PL3 (étape 2 b) et de tampon PC (étape 4) doivent être augmentés proportionnellement. Ajouter 25 μL de solution de RNase A et mélanger soigneusement l’échantillon. Incuber la suspension pendant 15 min à 65 °C. + 1,5 mL de PL2 + 25 μL RNase A 65 °C, 15 min + 200 μL PL3 sur glace, 5 min Note : Pour certaines plantes, il peut être avantageux d’augmenter le temps d’incubation à 30 – 60 min. Ajouter 200 μL de tampon PL3, mélanger soigneusement et incuber pendant 5 min sur la glace pour précipiter complètement le SDS. Passer à l’étape 3. 3 Filtration / Clarification du lysat brut Transférer le lysat dans un filtre NucleoSpin® Midi. Centrifuger pendant 10 min à 4 500 × g, recueillir le filtrat clarifié et jeter le filtre NucleoSpin® Midi. Si tout le liquide n’a pas passé le filtre, répéter l’étape de centrifugation. Si un culot est visible dans le filtrat, transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube de microcentrifugation de 15 mL (non fourni). 4 500 × g, 10 min Alternativement, centrifuger le lysat brut pendant 5 min à 4 500 × g et transférer le surnageant dans un nouveau tube ou passer le surnageant pré-clarifié à travers le filtre NucleoSpin® Midi pour éliminer complètement les particules solides. 4 Ajustement des conditions de fixation de l’ADN Ajouter 2,3 mL de tampon PC au lysat clarifié et mélanger immédiatement en vortexant pendant 30 s. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 + 2,3 mL PC Vortex 30 s 25 NucleoSpin® Plant II Maxi 5 Fixation de l’ADN Charger l’échantillon sur une colonne NucleoSpin® Plant II Midi. Charger l’échantillon Centrifuger pendant 2 min à 4 500 × g et jeter le filtrat. La capacité de chargement maximale de la colonne NucleoSpin® Plant II Midi est de 5 mL. Pour des volumes d’échantillons plus importants, répéter l’étape de chargement. 6 Lavage et séchage de la membrane de silice + 1 mL PW1 1er lavage Ajouter 1 mL de tampon PW1 à la colonne NucleoSpin® Plant II Midi. Centrifuger pendant 2 min à 4 500 × g et jeter le filtrat. Note : Bien que le lavage avec le tampon PW1 augmente la pureté, il peut dans certains cas réduire légèrement le rendement final. 2ème lavage Ajouter 3 mL de tampon PW2 à la colonne NucleoSpin® Plant II Midi. Centrifuger pendant 2 min à 4 500 × g et jeter le filtrat. 3ème lavage Ajouter à nouveau 1 mL de tampon PW2 à la colonne NucleoSpin® Plant II Midi. Centrifuger pendant 10 min à 4 500 × g afin d’éliminer le tampon de lavage et de sécher complètement la membrane de silice. 26 4 500 × g, 2 min MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 4 500 × g, 2 min + 3 mL de PW2 4 500 × g, 2 min + 1 mL de PW2 4 500 × g, 10 min ADN génomique des plantes 7 Elution de l’ADN Placer la colonne NucleoSpin® Plant II Midi dans un nouveau tube collecteur (15 mL). Pipeter 200 μL de tampon PE (65 °C) sur la membrane. Incuber la colonne NucleoSpin® Plant II Midi pendant 5 min à 65 °C. Centrifuger pendant 2 min à 4 500 × g pour éluer l’ADN. Répéter cette étape avec 200 μL de tampon PE additionnel (65 °C) et éluer dans le même tube. Note : Pour obtenir un rendement maximal ou des concentrations plus élevées, se référer au paragraphe 2.6 pour les procédures d’élution alternatives. + 200 μL PE 65 °C, 5 min 4 500 × g, 2 min + 200 μL PE 65 °C, 5 min 4 500 × g, 2 min Le tampon d’élution PE ne contient pas d’EDTA. Si une dégradation de l’ADN est observée après le stockage de l’ADN purifié, ajuster l’EDTA dans le tampon PE à 1 mM avant l’élution. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 27 ADN génomique des plantes 7 Protocole NucleoSpin® Plant II Maxi Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon de lavage PW2 et la RNase A ont été préparés conformément au paragraphe 3. • Préchauffer le tampon d’élution PE à 65 °C. • Une centrifugeuse avec un rotor pivotant et des godets appropriés capables d’atteindre 4 500 × g est nécessaire. Note: The NucleoSpin® Plant II Maxi kits comprennent deux tampons de lyse différents pour des résultats optimaux avec la plupart des espèces de plantes. Veuillez-vous référer à la section 2.5 pour choisir le système de tampon de lyse optimal adapté à votre échantillon de plante et pour obtenir des informations si vous souhaitez partir de plus de matériel de départ que ce qui est recommandé dans le protocole suivant. 1 Homogénéisation de l’échantillon Homogénéiser jusqu’à 1500 mg de poids humide ou jusqu’à 300 mg de poids sec (lyophilisé) de matériel végétal (pour les méthodes d’homogénéisation, voir le paragraphe 2.4). Homogénéiser les échantillons Procéder à la lyse cellulaire en utilisant le tampon PL1 (étape 2 a) ou alternativement le tampon PL2 (étape 2 b). 2 Lyse cellulaire à l’aide du tampon PL1 Transférer la poudre obtenue dans un nouveau tube et ajouter 6 mL de tampon PL1. Vortexer soigneusement le mélange. Note : Si l’échantillon ne peut pas être remis en suspension facilement parce que, par exemple, la poudre de plantes absorbe trop de tampon, il est possible d’ajouter du tampon PL1. Note : Les volumes de RNase A (étape 2 a) et de tampon PC (étape 4) doivent être augmentés proportionnellement. Ajouter 100 μL de solution de RNase A et mélanger soigneusement l’échantillon. Incuber la suspension pendant 20 min à 65 °C. Note : Pour certaines plantes, il peut être avantageux d’augmenter le temps d’incubation à 30 – 60 min. Passer à l’étape 3. 28 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 + 6 mL PL1 + 100 μL RNase A 65 °C, 20 min ADN génomique des plantes 2b Lyse cellulaire à l’aide du tampon PL2 Transférer la poudre obtenue dans un nouveau tube et ajouter 5,3 mL de tampon PL2. Vortexer soigneusement le mélange. Note : Si l’échantillon ne peut pas être remis en suspension facilement parce que, par exemple, la poudre de plantes absorbe trop de tampon, il est possible d’ajouter du tampon PL2. Note : les volumes de RNase A, de tampon PL3 (étape 2 b) et de tampon PC (étape 4) doivent être augmentés proportionnellement. Ajouter 100 μL de solution de RNase A et mélanger soigneusement l’échantillon. Incuber la suspension pendant 20 min à 65 °C. + 5,3 mL PL2 + 100 μL RNase A 65 °C, 20 min + 700 μL PL3 sur glace, 5 min Note : Pour certaines plantes, il peut être avantageux d’augmenter le temps d’incubation à 30 – 60 min. Ajouter 700 μL de tampon PL3, mélanger soigneusement et incuber pendant 5 min sur la glace pour précipiter complètement le SDS. Passer à l’étape 3. 3 Filtration / Clarification du lysat brut Transférer le lysat dans un filtre NucleoSpin® Maxi. Centrifuger pendant 10 min à 4 500 × g, recueillir le filtrat clarifié et jeter le filtre NucleoSpin® Maxi. S’ilreste du liquide dans le filtre, répéter l’étape de centrifugation. Si un culot est visible dans le filtrat, transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube de microcentrifugation de 50 mL (non fourni). 4 500 x g, 10 min Alternativement, centrifuger le lysat brut pendant 5 min à 4 500 × g et transférer le surnageant dans un nouveau tube ou passer le surnageant pré-clarifié à travers le filtre NucleoSpin® Maxi pour éliminer complètement les particules solides. 4 Ajustement des conditions de fixation de l’ADN Ajouter 10 mL de tampon PC au lysat clarifié et mélanger immédiatement en vortexant pendant 30 s. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 + 10 mL PC Vortex 30 s 29 ADN génomique des plantes 5 Fixation de l’ADN Charger l’échantillon sur une colonne NucleoSpin® Plant II Maxi. Charger l’échantillon Centrifuger pendant 2 min à 4 500 × g et jeter le filtrat. La capacité de chargement maximale de la colonne NucleoSpin® Plant II Maxi est de 15 mL. Pour des volumes d’échantillons plus importants, répéter l’étape de chargement. 6 Lavage et séchage de la membrane de silice + 4 mL PW1 1er lavage Ajouter 4 mL de tampon PW1 à la colonne NucleoSpin® Plant II Maxi. Centrifuger pendant 2 min à 4 500 × g et jeter le filtrat. Note : Bien que le lavage avec le tampon PW1 augmente la pureté, il peut dans certains cas réduire légèrement le rendement final. 2ème lavage Ajouter 10 mL de tampon PW2 à la colonne NucleoSpin® Plant II Maxi. Centrifuger pendant 2 min à 4 500 × g et jeter le filtrat. 3ème lavage Ajouter à nouveau 2 mL de tampon PW2 à la colonne NucleoSpin® Plant II Maxi. Centrifuger pendant 10 min à 4 500 × g afin d’éliminer le tampon de lavage et de sécher complètement la membrane de silice. 30 4 500 × g, 2 min MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 4 500 × g, 2 min + 10 mL de PW2 4 500 × g, 2 min + 2 mL de PW2 4 500 × g, 10 min ADN génomique des plantes 7 Elution de l’ADN Placer la colonne NucleoSpin® Plant II Maxi dans un nouveau tube collecteur (50 mL). Pipeter 1000 μL de tampon PE (65 °C) sur la membrane. Incuber la colonne NucleoSpin® Plant II Maxi pendant 5 min à 65 °C. Centrifuger pendant 2 min à 4 500 × g pour éluer l’ADN. Répéter cette étape avec un autre 1000 μL de tampon PE (65 °C) et éluer dans le même tube. Note : Pour obtenir un rendement maximal ou des concentrations plus élevées, se référer au paragraphe 2.6 pour les procédures d’élution alternatives. + 1000 μL PE 65 °C, 5 min 4 500 × g, 2 min + 1000 μL PE 65 °C, 5 min 4 500 × g, 2 min Le tampon d’élution PE ne contient pas d’EDTA. Si une dégradation de l’ADN est observée après le stockage de l’ADN purifié, ajuster l’EDTA dans le tampon PE à 1 mM avant l’élution. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 31 ADN génomique des plantes 8 Annexes 8.1 Guide de résolution des problèmes Problème Causes possibles et suggestions L’homogénéisation du matériel végétal n’était pas suffisante • Pour la plupart des espèces, nous recommandons de broyer avec des billes d’acier ou un mortier et un pilon (voir paragraphe 2.4). Pour le broyage de la paroi cellulaire, il est important d’homogénéiser soigneusement le matériel végétal jusqu’à ce que l’échantillon soit broyé en une fine poudre. • Au lieu d’être congelé dans l’azote liquide, l’échantillon peut également être lyophilisé et facilement broyé à une température comprise entre 15 et 25 °C. Utilisation d’un tampon de lyse sous-optimal • Les efficacités de lyse du tampon PL1 (CTAB) et du tampon PL2 (SDS) sont différentes et dépendent de l’espèce végétale. Essayez les deux tampons dans une purification en parallèle pour trouver le meilleur système de détergent pour lyser votre matériel végétal. Le volume du tampon de lyse utilisé n’est pas optimal. • Rendement d’ADN faible La lyse cellulaire peut être insuffisante et une trop grande quantité d’ADN peut être perdue lors de la clarification du lysat si, par exemple, le matériel sec absorbe trop de tampon de lyse. Utiliser plus de tampon de lyse et augmenter proportionnellement le volume de tampon de fixation PC. Le volume du tampon de fixation utilisé n’était pas optimal. • Augmenter le tampon de fixation PC proportionnellement si plus de tampon de fixation a été utilisé. L’extraction de l’ADN du matériel végétal pendant la lyse a été insuffisante • Augmenter le temps d’incubation dans le tampon de lyse (jusqu’à une nuit). Elution sous-optimale 32 • L’ADN peut être élué dans des volumes plus importants ou en répétant l’étape d’élution jusqu’à trois fois. Incuber la colonne NucleoSpin® Plant II avec le tampon d’élution à 65 °C pendant au moins 5 minutes. • Vérifier également le pH du tampon d’élution, qui doit être compris entre 8,0 et 8,5. Pour garantir un pH correct, utiliser le tampon d’élution PE fourni (5 mM Tris/HCl, pH 8,5). MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 ADN génomique des plantes Problème Causes possibles et suggestions L’échantillon était trop visqueux en raison d’une trop grande quantité d’échantillon ou présence de matière solide lors du transfert sur colonne. • Colmatage du filtre NucleoSpin® • ou la colonne ® NucleoSpin Plant II • • Centrifuger de grandes quantités d’échantillons avant de les charger sur le filtre NucleoSpin® ou le filtre Midi / Maxi. S’assurer que le lysat clarifié est absolument exempt de matières remises en suspension avant de le charger sur la colonne NucleoSpin® Plant II ou Plant II Midi / Maxi. Augmenter la vitesse et la durée de la centrifugation. Utiliser plus de tampon de lyse PL1 ou PL2. L’échantillon est contaminé par la DNase L’ADN est dégradé • Ajuster le tampon d’élution PE à 1 mM EDTA. Vitesse de centrifugation trop élevée • Centrifuger à une vitesse maximale de 11 000 × g. Des vitesses plus élevées peuvent entraîner un cisaillement de l’ADN. Le tampon d’élution contient de l’EDTA. • La qualité de l’ADN est faible L’EDTA peut perturber les réactions ultérieures. Utiliser de l’eau ou le tampon d’élution PE fourni (Tris/HCl 5 mM, pH 8,5) pour l’élution. Elimination de l’éthanol • S’assurer que les deux dernières étapes de lavage ont été effectuées avec le tampon de lavage PW2 et que la membrane a été séchée conformément au protocole. MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 33 ADN génomique des plantes 8.2 Informations de commande Produit REF Conditionnement NucleoSpin Plant II 740770.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 preps NucleoSpin® Plant II Midi 740771.20 20 preps NucleoSpin® Plant II Maxi 740772.10 10 preps Tampon PL1 740918 125 mL Set de tampons PL2 / PL3 (100 mL de tampon PL2 + 25 mL de tampon PL3) 740919 1 sets Tampon PC 740937 125 mL Tampon PW1 740938 125 mL Tampon PW2 concentré (pour 250 mL de tampon PW2) 740939 50 mL RNase A 740505.50 740505 50 mg 100 mg Protéinase K 740506 100 mg Filtres NucleoSpin® Plant (pour la filtration des homogénats cellulaires) 740606 50 Tubes collecteurs (2 mL) 740600 1000 MN Bead TubesType A 740786.50 50 MN Bead TubesType B 740812.50 50 MN Bead TubesType C 740813.50 50 MN Bead TubesType D 740814.50 50 MN Bead TubesType E 740815.50 50 MN Bead TubesType F 740816.50 50 MN Bead TubesType G 740817.50 50 MN Bead Tube Holder 740469 1 ® 34 MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 ADN génomique des plantes 8.3 Restrictions d’utilisation / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés à d’autres fins. La description de l’utilisation prévue des produits se trouve dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez respecter les instructions d’utilisation et les consignes de sécurité de la fiche de données de sécurité respective du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL est accompagné d’une documentation indiquant les spécifications et autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit qu’il répond aux spécifications indiquées. La garantie fournie est limitée aux spécifications des données et aux descriptions figurant dans la documentation originale de MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration ou représentation, écrite ou orale, par les employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL, à l’exception des déclarations écrites signées par un responsable dûment autorisé de MACHEREY‑NAGEL, n’est autorisée. Le consommateur ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de cette garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenus en rapport avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de MACHEREY‑NAGEL dans leur dernière édition, qui peuvent être consultées sur le site Web de l’entreprise. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leurs applications sont susceptibles d’être modifiés. Par conséquent, veuillez contacter notre équipe de service technique pour obtenir les dernières informations sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre distributeur local pour obtenir des informations scientifiques générales. Les descriptions figurant dans la documentation de MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Dernière mise à jour : 08/2022, Rév. 04 Veuillez contacter : MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tél : +49 (0) 24 21‑969‑333 [email protected] MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 14 35 www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 [email protected] CH +41 62 388 55 00 [email protected] FR +33 388 68 22 68 [email protected] US +1 888 321 62 24 [email protected] ">
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