Macherey-Nagel NucleoSpin RNA Plus, Mini kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d’utilisation
Extraction des ARN
n NucleoSpin® RNA Plus
Avril 2023 / Rev. 06
www.mn-net.com
www.mn-net.com
Extraction d’ARN
Résumé du protocole (Rev. 06)
NucleoSpin® RNA Plus
1
Homogénéiser et lyser
l’échantillon
350 μL LBP
2
Éliminer l’ADNg et
filtrer du lysat
11,000 x g,
30 s
3
Ajuster les conditions de fixation
de l’ARN
100 μL BS
4
Fixer l’ARN
Mélanger
Charger l’échantillon
5
Laver et sécher la membrane de
silice
11,000 x g,
15 s
1er lavage
200 μL WB1
2ème lavage
600 μL WB2
3ème lavage
250 μL WB2
1er et 2ème
11,000 x g,
15 s
3ème
11,000 x g,
2 min
30 μL H2O RNase-free
6
Eluer l’ARN
11,000 x g,
1 min
30 μL H2O RNase-free
11,000 x g,
1 min
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com
Extraction des ARN
Table of contents
1 Composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur
5
1.3 Environnement de travail exempt de RNase
5
1.4 A propos de ce manuel
6
2 Description du produit
7
2.1 Principe général
7
2.2 Caractéristiques du kit
7
2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons
9
2.4 Procédures d’élution
11
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
12
4 Instructions de sécurité
13
4.1 Elimination des déchets
®
13
5 Protocole NucleoSpin RNA Plus
14
6 Annexes
17
6.1 Digestion à la rDNase en solution
17
6.2 Guide de résolution des problèmes
19
6.3 Informations de commande
22
6.4 Restrictions de l’utilisation du produit / ​garantie
23
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
3
Extraction des ARN
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoSpin® RNA Plus
10 preps
50 preps
250 preps
740984.10
740984.50
740984.250
Tampon de lyse LBP
5 mL
25 mL
125 mL
Solution de fixation BS
1.5 mL
6 mL
30 mL
Tampon de lavage WB1
3 mL
12 mL
60 mL
Tampon de lavage WB2
(Concentré)*
6 mL
12 mL
50 mL
H2O RNase-free
13 mL
13 mL
60 mL
Colonnes NucleoSpin® gDNA
removal (anneaux jaunes)
10
50
250
Colonnes NucleoSpin® RNA
Plus (anneaux bleu clair - plus
tubes collecteurs)
10
50
250
Tubes collecteurs (2 mL)
20
100
500
Tubes collecteurs (1,5 mL)
10
50
250
Manuel d’utilisation
1
1
1
REF
* Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3.
4
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
Extraction des ARN
1.2
Réactifs, consommables et équipements à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
•
96 – 100 % d’éthanol (pour préparer le tampon de lavage WB2, éthanol non dénaturé
recommandé)
Consommables
•
Tubes de 1,5 mL ou 2,0 mL (pour préparer les lysats)
•
Cônes stériles exempts de RNases
Equipement
•
Pipettes manuelles
•
Vortex
•
Centrifugeuse pour microtubes
•
Équipement pour le broyage et l’homogénéisation des échantillons (voir le chapitre 2.3).
•
Équipements de protection individuelle (p.e., blouse, gants, lunettes)
•
Environnement de travail exempt de RNase A
Note : Les agents réducteurs (p.e. ß-mercaptoéthanol) souvent utilisés pour l’extraction de
l’ARN ne sont généralement pas nécessaires pour les préparations avec le NucleoSpin® RNA
Plus.
1.3
Environnement de travail exempt de RNase
Les composants du kit ont été testés pour garantir qu’ils sont exempts de RNases. Cependant,
un environnement de travail exempt de RNases est également un facteur critique pour la réussite
de l’extraction et de la manipulation de l’ARN. Il convient donc de suivre les recommandations
générales visant à éviter la contamination par les RNases :
•
Maintenir un espace séparé, des pipettes et du matériel dédiés lorsque l’on travaille avec
de l’ARN.
•
Porter des gants pour manipuler l’ARN et les réactifs afin d’éviter tout contact avec la
peau, qui est une source de RNases. Changer fréquemment de gants.
•
Utiliser des tubes en plastique stériles exempts de RNases. Des tubes collecteurs (2 mL,
pour la collecte des filtrats et 1,5 mL pour l’élution) sont fournis dans le kit. Les tubes
pour la préparation du lysat doivent être fournis par l’utilisateur.
•
Utiliser l’eau RNase-free contenue dans le kit pour l’élution.
•
Conserver les flacons de réactifs bien fermés en dehors des étapes d’utilisation
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
5
Extraction des ARN
1.4
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé de lire les paragraphes détaillés du protocole de ce manuel
d’utilisation si le kit NucleoSpin® RNA Plus est utilisé pour la première fois. Les utilisateurs
expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du protocole
est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil supplémentaire de référence rapide
pendant l’exécution de la procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante :
www.mn-net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes.
6
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
Extraction des ARN
2
Description du produit
2.1
Principe général
Le kit NucleoSpin® RNA Plus est conçu pour purifier l’ARN à partir de divers types de cellules
et de tissus. Ce kit est constitué de colonnes NucleoSpin® gDNA Removal qui permettent par
centrifugation d’élimine’ rapidement et efficacement la contamination par l’ADN génomique
sans étape de digestion à la DNase.
Un des principaux facteurs de réussite lors de l’extraction de l’ARN est la prévention de sa
dégradation. Les cellules et tissus sont d’abord lysés par incubation dans une solution de
lyse fortement concentrée en ion chaotropiques, inactivant immédiatement les RNases. Le
Lysat est ensuite déposé sur une colonne NucleoSpin® gDNA Removal (bagues jaunes) pour
à la fois, clarifier le lysat et aussi éliminer l’ADN génomique contaminant. Après ajout de la
solution de fixation (tampon BS) au filtrat, l’ARN est fixé sur une colonne NucleoSpin® RNA Plus
(bagues bleues). Deux étapes consécutives de lavages éliminent les sels, les métabolites, et
les composants cellulaires macromoléculaires. L’ARN purifié est au final élué dans de l’eau
RNase-Free.
La procédure NucleoSpin® RNA Plus s’effectue à température ambiante.
L’éluat doit être traité avec soin car l’ARN est sensible aux traces de contamination par les
RNases, que l’on trouve souvent sur le matériel de laboratoire, les doigts et la poussière. Garder
l’ARN congelé à -20 °C pour un stockage à court terme ou à -70 °C pour un stockage à long
terme afin de garantir la stabilité de l’ARN
2.2
Caractéristiques du kit
•
Les kits NucleoSpin® RNA Plus sont recommandés pour l’extraction d’ARN à partir de
cellules en culture et de tissus. Les kits NucleoSpin® RNA Plus permettent la purification
d’ARN de haute qualité. Les kits NucleoSpin® RNA Plus permettent la purification d’ARN
dont le rapport A260/A280 est généralement supérieur à 1,9 (mesuré dans le tampon TE,
pH 7,5).
•
L’ARN purifié est prêt à être utilisé dans diverses applications en aval.
•
L’ARN purifié avec les kits NucleoSpin® RNA Plus est d’une grande intégrité. L’indice
d’intégrité de l’ARN (RIN) de l’ARN isolé à partir d’échantillons frais de haute qualité (p.e.
cellules eucaryotes ou foie de souris frais) est généralement supérieur à 9. Cependant,
l’intégrité de l’ARN dépend fortement de la qualité de l’échantillon.
•
Les molécules d’ARN isolées avec NucleoSpin® RNA Plus sont de taille supérieure à
environ 200 nucléotides. Ce kit permet d’enrichir l’ARNm puisque la plupart des ARN
< 200 nucléotides (p.e. ARNr 5.8S, ARNr 5S, les ARNt, les microARN - qui représentent
ensemble environ 15 à 20 % de l’ARN total) sont sélectivement exclus.
•
L’ARN purifié avec les kits NucleoSpin® RNA Plus peut généralement contenir des
quantités infimes d’ADN génomique en raison d’un léger relarguage à partir des colonnes
NucleoSpin® gDNA Removal. La probabilité de détection de l’ADN par PCR augmente
avec :
1. le nombre de copies d’ADN par préparation : cible à copie unique < cible plastidiale / ​
mitochondriale < plasmides transfectés dans les cellules.
2. la diminution de la taille de l’amplicon PCR.
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
7
Extraction des ARN
Table 1: Résumé des caractéristiques du kit
Paramètres
NucleoSpin® RNA Plus
Technologie
Système utilisant 2 colonnes à membrane de silice :
1. Colonne pour l’élimination de l’ADN
2. Colonne pour l’extraction de l’ARN
Format
Mini colonne à centrifuger
Échantillon
< 1 × 107 cellules en culture,
< 109 cellules bactériennes,
< 108 cellules de levure,
< 30 mg de tissu
Taille du fragment
> 200 nt
Rendement typique
Cellules HeLa 5 × 106 : 40 – 60 μg
Foie de souris 20 mg : 80 – 100 μg
Rein de souris 20 mg : 40 – 70 μg
Rate de souris 5 mg : 30 – 60 μg
A260/A280
1.9 – 2.1
A260/A230
1.8 – 2.5
RIN (indice d’intégrité de l’ARN)
>9
Volume d’élution
30 – 120 μL
Temps de préparation
20 min/6 preps
Capacité de fixation
200 μg
Utilisation
Réserver à l’usage de la recherche
8
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
Extraction des ARN
2.3
Manipulation, préparation et stockage des échantillons
Il est important d’utiliser une quantité appropriée d’échantillon afin d’obtenir un rendement et
une pureté optimaux de l’ARN. La quantité maximale d’échantillon pouvant être utilisée avec
le kit NucleoSpin® RNA Plus dépend du type d’échantillon et de sa teneur en ARN et en ADN.
Quantité maximale d’échantillon à utiliser par préparation (valeurs approximatives) :
•
Cellules eucaryotes (p.e. cellules HeLa) : 107 cellules
•
Tissu animal : 30 mg (poids humide)
•
Tissu végétal : 100 mg (poids humide)
•
Micro-organismes (p.e. levure) : 30 mg
Collecte des échantillons et inhibition des RNases
L’ARN n’est pas protégé contre la digestion tant que l’échantillon n’est pas congelé ou broyé
en présence d’agents inhibiteurs ou dénaturants de la RNase.
Méthodes de collecte des échantillons :
•
Utiliser l’échantillon fraîchement récolté pour une lyse immédiate et une purification de
l’ARN.
•
Les échantillons peuvent être conservés dans le tampon de lyse après broyage à -70 °C
jusqu’à un an, à 4 °C jusqu’à 24 heures ou jusqu’à plusieurs heures à température
ambiante. Les échantillons congelés dans le tampon de lyse doivent être décongelés
lentement avant de commencer l’extraction de l’ARN.
•
Congeler rapidement l’échantillon dans du N2 liquide immédiatement après la récolte et le
conserver à -70 °C. Les échantillons congelés sont stables jusqu’à 6 mois. Un mortier et
un pilon peuvent être utilisés pour pulvériser l’échantillon à l’état congelé. Veiller à ce que
l’échantillon ne soit pas décongelé avant d’entrer en contact avec le tampon de lyse.
•
Les échantillons peuvent être immergés et conservés dans du RNAlater®. Avant d’utiliser
ce type d’échantillon, il convient d’éliminer l’excès de solution RNAlater® du tissu.
Broyage et homogénéisation des échantillons
Cellules - Lyse de cellules adhérentes cultivées en plaques
Aspirer complètement le milieu de culture cellulaire et ajouter immédiatement le tampon de
lyse dans les puits de la plaque de culture cellulaire. Éliminer complètement le milieu de culture
cellulaire afin de garantir une activité optimale du tampon de lyse. Mélanger les cellules en
culture avec le tampon de lyse est généralement suffisant pour obtenir une lyse complète.
Cellules - Lyse de cellules adhérentes recueillies après trypsinisation
Aspirer le milieu de culture cellulaire et ajouter une quantité égale de PBS afin de laver les
cellules en culture. Aspirer le PBS. Ajouter 0,1 – 0,3 % de trypsine dans du PBS et incuber
pendant une durée appropriée pour détacher les cellules de la surface de la boîte. Après le
détachement des cellules, ajouter le milieu de culture cellulaire, transférer les cellules dans un
tube approprié (non fourni) et les culotter par centrifugation pendant 5 min à 300 x g. Retirer le
surnageant et poursuivre l’ajout du tampon de lyse au culot cellulaire. Mélanger les cellules en
culture avec le tampon de lyse est généralement suffisant pour une lyse complète.
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
9
Extraction des ARN
Les tissus provenant des animaux sont souvent solides et doivent donc être broyés
mécaniquement et lysés. Il est essentiel, pour une préparation efficace de l’ARN, que tout l’ARN
contenu dans l’échantillon soit libéré des cellules par broyage ; en cas de viscosité, l’échantillon
doit être homogénéisé davantage pour réduire la viscosité.
La technique la plus couramment utilisée pour le broyage des tissus provenant des animaux
est le broyage à l’aide d’un pilon et d’un mortier. Broyer l’échantillon en une fine poudre en
présence de N2 liquide. Veiller à ce que l’échantillon ne se décongèle pas pendant ou après
le broyage ou la pesée et ajoutez la poudre congelée à un aliquote appropriée de tampon
de lyse et mélanger immédiatement. Le tissu broyé et lysé est ensuite appliqué à la colonne
NucleoSpin® gDNA Removal (incluse dans le kit) afin de fixer l’ADN et d’éliminer les matières
insolubles.
La décongélation de tissus non broyés doit se faire exclusivement en présence d’un tampon
de lyse lors d’un broyage mécanique simultané, par exemple à l’aide d’un homogénéisateur à
rotor-stator. Cela permet de s’assurer que l’ARN n’est pas dégradé par les RNases avant que
la procédure ne débute. Le rotor broie et homogénéise simultanément l’échantillon par action
mécanique, et casse l’ADN en quelques secondes ou quelques minutes (la durée nécessaire
dépend de l’échantillon). Veiller à conserver l’extrémité du rotor submergée dans le lysat afin de
ne pas former trop de mousse. Choisir un rotor de taille adaptée (5 – 7 mm de diamètre pour
broyer en tubes 1,5 – 2 mL).
Les bactéries et les levures doivent être incubées dans des solutions de lysozyme ou de
lyticase/zymolase, respectivement. Grâce à ce traitement, les parois cellulaires robustes
de ces organismes sont digérées ou au moins affaiblies, ce qui est essentiel pour une lyse
cellulaire efficace par le tampon de lyse du kit. Pour les microorganismes aux parois cellulaires
extrêmement résistantes, comme certaines bactéries Gram-positives, les conditions de lyse
enzymatique peuvent nécessiter des optimisations ou un changement des conditions de
culture. Après la lyse dans le tampon de lyse, l’homogénéisation est effectuée lors de la filtration
sur les colonnes NucleoSpin® gDNA Removal.
Alternativement, les cellules de bactéries et de levures peuvent être brisées avec un broyeur
à billes. Par conséquent, remettre en suspension le culot cellulaire dans le tampon de lyse
RA1, transférer la solution dans un MN Bead Tube (voir informations commande) et broyer les
échantillons par broyage (par exemple, en utilisant le MN Bead Tubes Holder sur un Vortex
Genie® 2). Sur la base des données générées par notre R&D, nous suggérons l’utilisation
de MN Bead Tubes Type A pour les bactéries et les levures. Nous recommandons vivement
d’optimiser la procédure de broyage avec des billes en fonction de votre application et de votre
matériel de départ. Il peut être nécessaire de tester différents tubes de billes MN et temps de
broyage pour obtenir les meilleurs résultats.
Traitement enzymatique : remettre en suspension le culot de cellules bactérien (souches
Gram négatives) dans 100 μL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ; pH 8) contenant
1 mg/mL de lysozyme en vortexant vigoureusement. Incuber à 37 °C pendant 10 min. Pour la
préparation de l’ARN des bactéries Gram positives, remettre en suspension les cellules dans
100 μL de TE contenant 2 mg/mL de lysozyme. Il peut être nécessaire d’optimiser le temps
d’incubation et la concentration en lysozyme, en fonction de la souche bactérienne.
Note : En raison de la concentration beaucoup plus élevée d’équivalents génomiques dans
une préparation d’acide nucléique de bactéries par rapport au matériel eucaryote, il peut être
nécessaire d’utiliser une quantité plus faible de cellules pour la préparation.
Le matériel végétal peut être broyé, par exemple, à l’aide d’un mortier et d’un pilon à l’état
congelé (N2 liquide) avant l’ajout du tampon de lyse, ou à l’aide de Dispomix® (par exemple,
10
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
Extraction des ARN
Xiril / ​VWR), ou de gentleMACSTM Dissotiator (Miltenyi Biotec) immédiatement après l’ajout du
tampon de lyse. Si du matériel végétal congelé est utilisé comme échantillon, s’assurer qu’il ne
sera pas décongelé avant le broyage. Le temps écoulé entre le contact de l’échantillon avec
le tampon de lyse et le broyage doit être aussi court que possible. Pour certaines matières
végétales, jusqu’à 100 mg peuvent être utilisés ; pour d’autres matières végétales, la quantité
maximale d’échantillon est comprise entre 20 et 50 mg.
2.4
Procédures d’élution
Il est possible d’adapter la méthode d’élution et le volume d’eau utilisé en fonction des
applications avales. Plusieurs procédures d’élution sont possibles.
•
Rendement élevé : Effectuer deux étapes d’élution avec 30 μL. Environ 90 à 100 % de
l’acide nucléique lié sera élué.
•
Rendement et concentration élevés : Eluer avec le volume d’élution standard et
appliquer l’éluat une fois de plus sur la colonne pour une nouvelle élution.
•
Élution simple : Éluer une fois avec 60 μL d’eau.
L’ARN élué doit être immédiatement mis et toujours conservé sur de la glace pour une stabilité
optimale, car les RNases presque omniprésentes (articles de laboratoire, empreintes digitales,
poussière) dégradent l’ARN. Pour un stockage à court terme, congeler à -20 °C, pour un
stockage à long terme, congeler à -70 °C.
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
11
Extraction des ARN
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention :
Les tampons LBP et WB2 contiennent du sel chaotropique. Porter des gants et des lunettes !
ATTENTION : Les tampons LBP et WB2 contiennent du sel chaotropique qui peut former des
composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorite de sodium).
NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation
des échantillons.
•
Tous les composants du kit doivent être conservés à température ambiante (15 – 25 °C)
et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Le stockage à des températures inférieures
peut entraîner la précipitation de sels.
Avant de débuter une procédure NucleoSpin® RNA Plus, préparer les éléments suivants :
•
Tampon de lavage WB2 : ajouter le volume indiqué d’éthanol à 96 – 100 % (voir tableau
ci-dessous) au tampon WB2 concentré. Marquer l’étiquette du flacon pour indiquer que
de l’éthanol a été ajouté. Le tampon de lavage WB2 peut être conservé à température
ambiante pendant au moins un an.
NucleoSpin® RNA Plus
10 preps
50 preps
250 preps
REF
740984.10
740984.50
740984.250
Tampon de lavage
WB2 (concentré)
6 mL
Ajouter 24 mL
d’éthanol
12 mL
Ajouter 48 mL
d’éthanol
50 mL
Ajouter 200 mL
d’éthanol
•
La solution de fixation BS est prête à l’emploi.
•
Un agent réducteur (p.e., ß-mercaptoéthanol) n’est pas nécessaire pour les préparations
NucleoSpin® RNA Plus.
12
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
Extraction des ARN
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin®RNA Plus, porter des vêtements de protection
appropriés (p.e., blouse de laboratoire, gants jetables et lunettes de protection). Pour plus
d’informations, consulter les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en
ligne sur http ://www.mn-net.com/msds).
Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon WB1 et le thiocyanate de guanidinium
dans le tampon LBP peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils sont combinés
à de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides
directement aux déchets de préparation d’échantillons.
Les déchets générés par le kit NucleoSpin®RNA Plus n’ont pas été testés pour détecter la
présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel
infectieux résiduel est très improbable en raison du traitement par tampon de lyse fortement
dénaturant, mais elle ne peut pas être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides
doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément
aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
13
NucleoSpin® RNA Plus
5
Protocole NucleoSpin® RNA Plus
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier si le tampon de lavage WB2 a été préparé conformément au chapitre 3.
Homogénéiser et lyser l’échantillon
Ajouter 350 μL de tampon LBP par échantillon et broyer
l’échantillon selon l’une des méthodes décrites au chapitre
2.3.
Note : Le tube de lyse n’est pas inclus dans le kit. L’ajout
d’un agent réducteur (p.e. ß-mercaptoéthanol, DTT ou
TCEP) n’est pas nécessaire. L’échantillon doit être broyé
et lysé le plus totalement possible.
Note : Si des quantités considérables de matériel
d’échantillon non lysé sont encore visibles après le broyage
de l’échantillon (ce qui peut se produire avec certaines
plantes), centrifuger brièvement le lysat (environ 3 s à 2
000 x g) afin de sédimenter les débris de l’échantillon. Si
les sédiments représentent p.e. > 20 % du volume total
du lysat, ne pas les transférer sur la colonne NucleoSpin®
gDNA Removal.
+ 350 μL LBP
Pour certains types d’échantillons (par exemple, certains
types de plantes), il peut être avantageux d’utiliser 500 μL
de tampon de lyse au lieu de 350 μL, en particulier, si de
nombreux débris d’échantillons sont observés après le
broyage de l’échantillon.
Note : L’utilisation de volumes plus élevée de tampon LBP
nécessite des volumes supplémentaires de solution de
fixation BS (non fournie dans le kit).
2
Éliminer l’ADNg et filtrer le lysat
Placer la colonne NucleoSpin® gDNA Removal (anneau
jaune) dans un tube collecteur (2 mL ; fourni), transférer
le lysat homogénéisé dans la colonne NucleoSpin® gDNA
Removal et centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g.
Jeter la colonne et poursuivre la procédure avec le filtrat.
Note : S’assurer qu’il ne reste plus de liquide sur la
membrane de la colonne après la centrifugation. Si
nécessaire, répéter la centrifugation jusqu’à ce que tout le
liquide ait traversé la membrane.
Si (évènement rare) des débris insolubles sont visibles dans
le filtrat, pipeter le filtrat en les évitant. Optimiser la méthode
de broyage pour les futures extractions
14
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
11,000 x g,
30 s
NucleoSpin® RNA Plus
3
Ajuster les conditions de fixation de l’ARN
Ajouter 100 μL de solution de fixation BS au filtrat et bien
mélanger par vortex modéré ou par pipetages successifs.
Note : si le mélange est effectué en vortexant, veiller à éviter
toute projection de liquide, le tube collecteur 2 mL étant
dépourvu de bouchon
!
Note : Si un volume supérieur à 350 μL de tampon de lyse
LBP a été utilisé pour la lyse (par exemple, 500 μL), veiller
à ajouter environ 0,3 volume de tampon de fixation BS
au lysat clarifié afin d’ajuster les conditions de fixation de
l’ARN.
Note : L’utilisation de volumes plus élevé de tampon LBP
nécessite des volumes supplémentaires de solution de
fixation BS (non fournie dans le kit).
+ 100 μL BS
Mélanger
Après l’ajout de la solution de fixation BS, un précipité
filandreux peut devenir visible, ce qui n’affectera pas
l’extraction de l’ARN. Veiller à désagréger tout précipité en
le mélangeant et en le chargeant entièrement sur la colonne
comme décrit dans l’étape suivante. Ne pas centrifuger
le lysat après l’ajout de la solution de fixation avant de le
charger sur la colonne afin d’éviter de culotter le précipité.
4
Fixer l’ARN
Transférer le lysat entier (~ 450 μL) dans la colonne
NucleoSpin® RNA Plus (anneau bleu clair) préassemblée
avec un tube collecteur. Centrifuger pendant 15 s à
11 000 x g.
Note : Le filtrat (~ 450 μL) peut rester dans le tube collecteur.
Alternativement, jeter le filtrat et réutiliser le tube collecteur
ou placer la colonne dans un nouveau tube collecteur de
2 mL (non fourni).
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
Charger le lysat
11,000 x g,
15 s
15
NucleoSpin® RNA Plus
5
Laver et sécher la membrane de silice
1er lavage
+ 200 μL WB1
Ajouter 200 μL de tampon WB1 à la colonne NucleoSpin®
RNA Plus. Centrifuger pendant 15 s à 11 000 x g. Jeter le
filtrat avec le tube collecteur et placer la colonne dans un
nouveau tube collecteur de 2 mL (fourni).
11,000 x g,
15 s
2ème lavage
Ajouter 600 μL de tampon WB2 à la colonne NucleoSpin®
RNA Plus. Centrifuger pendant 15 s à 11 000 x g. Jeter le
filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur
Note : Veiller à ce que le tampon résiduel des étapes
précédentes soit lavé avec le tampon WB2, en particulier
si le lysat est entré en contact avec l’embout supérieur de
la colonne pendant le chargement du lysat. Rincer cette
partie avec le tampon WB2
+ 600 μL WB2
11,000 x g,
15 s
3ème lavage
Ajouter 250 μL de tampon WB2 à la colonne NucleoSpin®
RNA Plus. Centrifuger pendant 2 min à 11 000 x g pour
sécher complètement la membrane. Placer la colonne dans
un tube collecteur exempt de nucléase (1,5 mL, fourni).
Si, pour une raison quelconque, le niveau de liquide dans
le tube collecteur a atteint la colonne NucleoSpin® RNA
Plus après la centrifugation, jeter le filtrat et centrifuger à
nouveau.
6
11,000 x g,
2 min
Eluer l’ARN
Ajouter 30 μL de H2O RNase-free et centrifuger à
11 000 x g. pendant 1 min.
Ajouter à nouveau 30 μL de H2O RNase-free et centrifuger
à 11 000 x g. pendant 1 min.
L’élution peut également être effectuée avec 1 × 60 μL,
mais le rendement peut être légèrement réduit par rapport
à l’élution avec 2 × 30 μL. Pour d’autres procédures
d’élution, voir le paragraphe 2.4.
16
+ 250 μL WB2
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
+ 30 μL H2O
RNase-free
11,000 x g,
1 min
+ 30 μL H2O
RNase-free
11,000 x g,
1 min
Extraction des ARN
6
Annexes
6.1
Digestion à la rDNase en solution
Le passage de l’échantillon lysé dans la colonne NucleoSpin® gDNA Removal selon le
protocole standard est très efficace pour la fixation de l’ADN, ce qui se traduit par un minimum
d’ADN résiduel dans l’ARN purifié. L’ADN résiduel ne sera pas détectable dans la plupart des
applications en aval. Malgré cela, certaines applications exigent des teneurs en ADN résiduel
encore plus faibles. Cependant, l’élimination de l’ADN à un niveau totalement indétectable est
un défi et l’efficacité de la colonne NucleoSpin® gDNA Removal n’est parfois pas suffisante pour
les applications en aval exigeant une teneur résiduelle en ADN la plus faible possible. Cela peut
être particulièrement le cas si une grande quantité d’échantillon ou un échantillon contenant
beaucoup d’ADN est traité avec la colonne NucleoSpin® gDNA Removal. La quantité d’ADN
résiduel détectée dépend du type d’échantillon, de sa quantité et de sa teneur en ADN, ainsi
que de la sensibilité de détection de la méthode utilisée pour analyser l’ADN résiduel.
Un exemple typique d’une application aussi exigeante est une réaction de RT-PCR dans
laquelle les amorces ne font pas la différence entre l’ADNc (dérivé de l’ARN) et l’ADN génomique
contaminant. En particulier, si
•
les cibles à nombre de copies élevé sont analysées (p.e. familles de gènes multiples,
cibles mitochondriales, plastidiales ou plasmidiques (à partir de transfections))
•
le gène cible a un niveau d’expression très faible
•
l’amplicon est relativement petit (< 200 pb).
La digestion de l’ADN en solution peut détruire efficacement l’ADN contaminant. Toutefois, un
contrôle rigoureux de la RNase et une purification ultérieure de l’ARN (afin d’éliminer le tampon,
les sels, la DNase et l’ADN digéré) sont généralement nécessaires.
La RNase-free recombinante de haute qualité (REF 740963) facilite une telle digestion en
solution afin d’éliminer même les traces d’ADN contaminant.
A
Digérer l’ADN (préparation de la réaction)
Ajouter 6 μL de tampon de réaction pour la rDNase et 0,6 μL de rDNase à 60 μL
d’ARN élué.
(Alternativement, mélanger au préalable 100 μL de tampon de réaction pour la rDNase
et 10 μL de rDNase et ajouter 1 / ​10 volume à 1 volume d’ARN élué).
Agiter doucement le tube afin de mélanger la solution. Centrifuger doucement (environ
1 s à 1 000 x g) pour recueillir chaque gouttelette de la solution au fond du tube.
B
Incuber l’échantillon
Incuber pendant 10 min à 37 °C.
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
17
Extraction des ARN
C
Repurifier l’ARN
Repurifier l’ARN à l’aide d’une procédure de purification de l’ARN appropriée, par
exemple en utilisant les kits NucleoSpin® RNA Cleanup , NucleoSpin® RNA Cleanup XS
(voir informations de commande), ou par précipitation à l’éthanol
Précipitation de l’éthanol, à titre d’exemple :
Ajouter 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M, pH 5,2 et 2,5 volumes d’éthanol
96 – 100 % à 1 volume d’échantillon. Mélanger soigneusement.
Incubate quelques minutes à quelques heures à -20 °C ou 4 °C
Note : Choisir des temps d’incubation longs si l’échantillon contient une faible
concentration d’ARN. Des temps d’incubation courts sont suffisants si l’échantillon
contient une forte concentration d’ARN.
Centrifuger pendant 10 min à vitesse maximale.
Laver le culot d’ARN avec de l’éthanol à 70 %.
Sécher le culot d’ARN et remettre l’ARN en suspension dans de l’H2O RNase-free.
18
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
Extraction des ARN
6.2
Guide de résolution des problèmes
Problème
Causes possibles et suggestions
Contamination par les RNases
•
ARN dégradé / ​
pas d’ARN
Créer un environnement de travail exempt de RNases. Porter des
gants pendant toutes les étapes de la procédure. Changer de
gants fréquemment. Il est recommandé d’utiliser des tubes en
polypropylène stériles et jetables. Garder les tubes fermés dans la
mesure du possible pendant la préparation. Les contenants en verre
doit être autoclavés pendant au moins 2 heures à 250 °C avant
d’être utilisée.
Qualité insuffisante de l’échantillon
•
Contrôler la collecte, le stockage et la lyse des échantillons. Veiller à
ce que les échantillons soient récoltés, stockés et lysés de manière
adéquate afin de préserver l’intégrité de l’ARN.
Mauvaise utilisation ou préparation des réactifs
Faible qualité ou
rendement en
ARN
•
Les réactifs n’ont pas été correctement préparés. Ajouter le volume
indiqué d’éthanol à 96 % au tampon WB2 concentré et mélanger
•
L’échantillon et les réactifs n’ont pas été complètement mélangés.
Toujours vortexer vigoureusement après l’ajout de chaque réactif.
•
Aucune solution de fixation BS n’a été ajoutée après la lyse. La
liaison de l’ARN à la membrane de silice n’est efficace qu’en
présence de la solution de fixation.
Stockage du kit
•
Conserver les composants du kit à température ambiante. Le
stockage à basse température peut provoquer une précipitation de
sel.
•
Garder les bouteilles bien fermées afin d’éviter l’évaporation ou la
contamination.
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
19
Extraction des ARN
La force ionique et le pH influencent l’absorption de l’A260 ainsi que le
rapport A260 / ​A280.
•
Pour les mesures d’adsorption, utiliser 5 mM Tris pH 8.5 comme
diluant. Voir aussi :
− Manchester, K L. 1995. Valeur des rapports A260 / ​A280 pour la
mesure de la pureté des acides nucléiques. Biotechniques 19,
208 – 209.
Faible qualité ou
rendement en
ARN (suite)
− Wilfinger, W W, Mackey, K et Chomczyski, P. 1997. Effet du pH
et de la force ionique sur l’évaluation spectrophotométrique de la
pureté des acides nucléiques. Biotechniques 22, 474 – 481.
Nature des échantillons
•
L’échantillon n’a pas été stocké correctement. Dans la mesure du
possible, utiliser du matériel frais. Si ce n’est pas possible, congeler
rapidement les échantillons dans de l’azote liquide. Les échantillons
doivent toujours être conservés à -70 °C. Ne jamais laisser les tissus
décongeler avant l’ajout du tampon LBP. Effectuer le broyage des
échantillons dans l’azote liquide.
•
Broyage et/ou homogénéisation insuffisants des échantillons.
Assurer un broyage complet de l’échantillon.
Contamination avec du thiocyanate de guanidinium
Faible rapport
A260 / ​A230
•
Charger soigneusement le lysat dans la colonne NucleoSpin® RNA
Plus et essayer d’éviter une contamination de la partie supérieure de
la colonne et du couvercle de la colonne.
•
S’assurer qu’une quantité / ​concentration suffisante d’ARN
est utilisée pour la quantification afin que la valeur A230 soit
significativement plus élevée que le bruit de fond.
•
La mesure d’une faible quantité / ​concentration d’ARN entraînera des
valeurs instables du rapport A260/230.
Échantillons biologiques
Colonne
NucleoSpin®
colmatée / ​
Faible qualité ou
rendement de
l’ARN
20
•
Utilisation d’une trop grande quantité d’échantillons. Une surcharge
peut entraîner une diminution du rendement global. Réduire la
quantité d’échantillon ou utiliser un plus grand volume de tampon
de lyse.
•
Broyage et/ou homogénéisation insuffisants des échantillons.
Veiller à un broyage complet de l’échantillon et utiliser la colonne
NucleoSpin® gDNA Removal pour éliminer l’ADN et faciliter
l’homogénéisation du matériel de départ broyé.
•
Augmenter la force g et la durée de centrifugation si nécessaire.
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
Extraction des ARN
Trop de matériel de départ utilisé
•
Réduire la quantité de cellules ou de tissus utilisés.
Le système de détection de l’ADN est trop sensible
Contamination
de l’ARN
par l’ADN
génomique
La colonne NucleoSpin® gDNA Removal permet de réduire efficacement
la contamination par l’ADN. Toutefois, il n’est pas possible de garantir
que l’ARN purifié est exempt à 100 % d’ADN ; par conséquent, dans des
applications très sensibles, il peut encore être possible de détecter de
l’ADN. La probabilité de détection de l’ADN par PCR augmente avec :
− le nombre de copies d’ADN par préparation : cible à copie unique
< cible plastidiale / ​mitochondriale < plasmide transfecté dans les
cellules
− la diminution de la taille de l’amplicon PCR.
•
Utiliser si possible des cibles PCR plus grandes (p.e. > 500 bp) ou
des amorces couvrant les introns.
•
Utiliser le protocole additionnel 6.1 pour la digestion ultérieure
de la rDNase en solution.
Contamination par de l’éthanol ou du sel
Performance
sous-optimale
de l’ARN dans
les expériences
en aval
•
Ne pas laisser le filtrat toucher la sortie de la colonne après le
deuxième lavage au tampon WB2. Veiller à centrifuger la vitesse
correspondante pendant la durée correspondante afin d’éliminer
complètement le tampon éthanolique WB2.
•
Vérifier que le tampon WB2 a été équilibré à la température ambiante
avant utilisation. Le lavage à des températures plus basses réduit
l’efficacité de l’élimination des sels par le tampon WB2.
Conserver correctement l’ARN isolé
•
L’ARN élué doit toujours être conservé sur de la glace pour
une stabilité optimale, car les traces de contamination par les
RNases omniprésentes (matériel de laboratoire, doigts, poussière)
dégraderont l’ARN purifié. Pour un stockage à court terme, congeler
à -20 °C, pour un stockage à long terme, congeler à -70 °C.
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
21
Extraction des ARN
6.3
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoSpin RNA Plus
740984.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® RNA
740955.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® RNA Midi
740962.20
20
NucleoSpin® miRNA
740971.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250 preps
NucleoSpin® RNA / Protéine
740933.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® TriPrep
740966.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® totalRNA FFPE XS
740969.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® totalRNA FFPE
740982.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® RNA Blood
740200.10 / .50
10 / 50
NucleoSpin® RNA Blood Midi
740210.20
20
NucleoSpin® 8 RNA Blood
740220 / ​.5
12 × 8 / ​60 × 8
NucleoSpin® 96 RNA Blood
740225.2 / ​.4
2 × 96 / ​4 × 96
NucleoSpin® RNA Clean‑up
740948.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® RNA XS
740902.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® RNA Clean‑up XS
740903.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
rDNase Set
740963
1
Tubes collecteurs (2 mL)
740600
1000
MN Bead Tubes Type B
740812.50
50
MN Bead Tubes Type C
740813.50
50
®
Visitez le site www.mn‑net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit.
22
MACHEREY-NAGEL – 04/2023, Rev. 06
Extraction des ARN
6.4
Restrictions de l’utilisation du produit / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils
ne sont pas destinés à être utilisés à d’autres fins. La description de l’utilisation prévue des
produits se trouve dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser
nos produits, veuillez respecter les instructions d’utilisation et les consignes de sécurité de la
fiche de données de sécurité respective du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL est accompagné d’une documentation indiquant les
spécifications et autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit qu’il répond aux
spécifications indiquées. La garantie fournie est limitée aux spécifications des données et aux
descriptions figurant dans la documentation originale de MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre
déclaration ou représentation, écrite ou orale, par les employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL, à l’exception des déclarations écrites signées par un responsable dûment
autorisé de MACHEREY‑NAGEL, n’est autorisée. Le consommateur ne doit pas s’y fier et elles
ne font pas partie d’un contrat de vente ou de cette garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenus en rapport avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL dans leur dernière édition, qui peuvent être consultées sur le site Web de
l’entreprise. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leurs applications sont susceptibles d’être modifiés. Par conséquent, veuillez
contacter notre équipe de service technique pour obtenir les dernières informations sur les
produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre distributeur local pour
obtenir des informations scientifiques générales. Les descriptions figurant dans la documentation
de MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rév. 04
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NucleoSpin® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG.
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enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
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marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
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Clean up
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DNA
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