MACHEREY-NAGEL Biologie moléculaire Bioanalysis Manuel d’utilisation User manual Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes n NucleoMag® Pathogen n NucleoMag® Pathogen Prefilled Plates June 2024 / Rev. 08 www.mn-net.com www.mn-net.com Contact MN Germany and international MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-0 Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only) E-mail: [email protected] Technical Support Bioanalysis Tel.: +49 24 21 969-333 E-mail: [email protected] USA MACHEREY-NAGEL Inc. 924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA Toll-free: 888 321 6224 (MACH) E-mail: [email protected] France MACHEREY-NAGEL SAS 1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France Tel.: +33 388 68 22 68 E-mail: [email protected] MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 € Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531 Switzerland MACHEREY-NAGEL AG Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland Tel.: +41 62 388 55 00 E-mail: [email protected] www.mn-net.com Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes Sommaire 1 Composants 4 1.1 Contenu du kit 4 1.2 Matériel à fournir par l’utilisateur 5 1.3 A propos de ce manuel 5 2 Description du produit 7 2.1 Principe général 7 2.2 Caractéristiques du kit 7 2.3 Systèmes de séparation magnétique 8 2.4 Réglage des paramètres d’agitation 9 2.5 Manipulation des billes 9 2.6 Procédures d’élution 10 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs 11 4 Instructions de sécurité 13 4.1 Elimination des déchets 13 5 Protocole pour l’extraction d’ARN et d’ADN viraux et d’ADN microbien à partir de sang, de tissus homogénéisés, de sérum, de plasma, d’autres fluides corporels et de lavages 14 5.1 Préparation des échantillons 14 5.2 Résumé du protocole 15 5.3 Protocole détaillé 17 ® 6 Protocole pour les plaques pré-remplies NucleoMag Pathogen 6.1 Protocole détaillé pour IsoPure™ Mini et MagnetaPure 32 Plus 7 Annexes 19 20 22 7.1 Guide de résolution des problèmes 22 7.2 Informations de commande 24 7.3 Restrictions d’utilisation / garantie 25 MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 3 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes 1 Composants 1.1 Contenu du kit NucleoMag® Pathogen REF 1 × 96 preps 744210.1 4 × 96 preps 744210.4 NucleoMag® B-Beads 2 × 1,5 mL 10 mL Tampon de lyse NPL1 30 mL 100 mL Tampon de fixation NPB2 110 mL 3 × 110 mL Tampon de lavage NPW3 75 mL 300 mL Tampon de lavage NPW4 75 mL 300 mL Tampon d’élution NPE5* 30 mL 125 mL ARN Carrier ** 400 μg 4 × 400 μg Tampon ARN Carrier 500 μL 4 × 500 μL Protéinase K (lyophilisée) ** 75 mg 3 × 75 mg Tampon de protéinase PB 8 mL 15 mL 1 1 Manuel d’utilisation NucleoMag® Pathogen Prefilled Plates 6 × 16 preps 744211 REF Tampon de lyse NPL1 30 mL Plaque 96 puits pré-remplies de réactifs NucleoMag® Pathogen 6 pièces ARN Carrier* 400 μg Tampon ARN Carrier 500 μL Protéinase K liquide 2 mL 8-well Tip Combs 6 × 2 pièces Notice d’utilisation 1 * Composition du tampon d’élution NPE5 : 5 mM Tris/HCl, pH 8,5 ** Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3. 4 MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes 1.2 Matériel à fournir par l’utilisateur Produit REF Conditionnement Aimant pour la séparation des billes magnétiques, p.e. NucleoMag® SEP NucleoMag® SEP Mini NucleoMag® SEP Maxi NucleoMag® SEP 24 744900 744901 744902 744903 1 1 1 1 Plaque de séparation pour séparer les billes magnétiques, p.e., Square-well Block (bloc 96 puits avec des puits carrés de 2,1 mL) Tubes de lyse pour l’incubation des échantillons et la lyse, p.e., Rack of Tubes Strips (1 set comprend 1 Rack, 12 barrettes de 8 tubes (puits de 1,2 mL) chacune, et 12 barrettes de bouchons) Plaque d’élution pour la collecte des acides nucléiques purifiés, p.e., Elution Plate U-bottom (microplaque de 96 puits avec des puits à fond en U de 300 μL) Pour l’utilisation du kit sur l’instrument KingFisher® Flex : p.e., KingFisher® Accessory Kit A (Deep-well Blocks, Deep-well tip combs, Elution Plates for 4 × 96 NucleoMag® Pathogen preps pour utiliser avec le KingFisher® Flex) Pour l’utilisation du kit sur MagnatePure 32 Plus ou IsoPure Mini : 96 Deep-well plates pour systèmes à barreaux magnétiques Pour l’utilisation du kit sur MagnatePure 32 Plus ou IsoPure Mini : 8-well Tip Combs pour systèmes à barreaux magnétiques 740481 4 740481.24 24 740477 4 sets 740477.24 24 sets 740486.24 24 744950 1 sets 744955 25 pièces 744960 25 × 2 pièces Réactifs : • 80 % d’éthanol 1.3 A propos de ce manuel Il est fortement recommandé aux personnes qui utilisent le kit NucleoMag® Pathogen pour la première fois de lire les paragraphes du présent manuel d’utilisation consacrés au protocole détaillé. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du protocole est conçu pour servir d’outil de référence rapide pendant l’exécution de la procédure de purification. MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 5 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes Toute la documentation technique est disponible sur le site www.mn-net.com. Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes. 6 MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes 2 Description du produit 2.1 Principe général Le kit NucleoMag® Pathogen est conçu pour l’isolement de l’ARN et de l’ADN viraux et de l’ADN bactérien à partir de liquides acellulaires tels que le sérum ou le plasma, le sang, la salive, les suspensions d’échantillons de tissus homogénéisés, les suspensions d’échantillons de selles et les lavages d’écouvillons. Ce kit fournit des réactifs et des billes magnétiques pour l’extraction de 96 échantillons. La procédure est basée sur l’adsorption réversible des acides nucléiques sur les billes paramagnétiques dans des conditions de tampons appropriées. La lyse des échantillons est réalisée par incubation avec un tampon de lyse NPL1 contenant des ions chaotropiques et soutenu par une digestion à la protéinase K. Pour la fixation des acides nucléiques sur les billes paramagnétiques, le tampon de fixation NPB2 et les NucleoMag® B-Beads sont ajoutés au lysat. Après la séparation magnétique, les billes paramagnétiques sont lavées pour éliminer les contaminants et les sels à l’aide des tampons de lavage NPW3, NPW4 et de l’éthanol à 80 %. L’éthanol résiduel des étapes de lavage précédentes est éliminé par séchage à l’air. Enfin, l’ARN et l’ADN pathogènes hautement purs sont élués à l’aide d’un tampon d’élution à faible teneur en sel ou d’eau. L’ARN et l’ADN pathogènes purifiés peuvent être directement utilisés pour des applications en aval. Il est recommandé d’utiliser des contrôles appropriés pour les applications en aval (p.e. contrôles internes, contrôles d’extraction, contrôles positifs/négatifs). Le kit NucleoMag® Pathogen peut être utilisé manuellement ou automatiquement sur des robots pipeteurs ou des séparateurs magnétiques automatisés. Nous pouvons fournir une assistance personnalisée, des informations sur les protocoles ou des programmes vérifiés pour de nombreuses plateformes. Pour plus d’informations, veuillez contacter notre support technique ou visiter le site www.mn-net.com/automation. 2.2 Caractéristiques du kit Le kit NucleoMag® Pathogen est conçu pour la préparation rapide, manuelle et automatisée à petite échelle de l’ARN et de l’ADN viraux et de l’ADN de micro-organismes à partir de divers types d’échantillons cliniques. Le kit est conçu pour être utilisé avec la plaque de séparation magnétique NucleoMag® SEP (voir informations de commande, paragraphe 7.2) ou d’autres systèmes de séparation magnétique (voir paragraphe 2.3). Le temps de préparation manuel de 96 échantillons est d’environ 120 minutes. L’ARN et l’ADN purifiés peuvent être utilisés directement comme matrice pour la RT-PCR, la PCR ou tout type de réaction enzymatique. Réserver à l’usage de la recherche. Les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen (REF 744211) sont des plaques 96 puits profonds pré-remplies spécialement conçues pour être utilisées sur les systèmes MagnetaPure 32 Plus ou IsoPure™ Mini. Le tampon de fixation NPB2, les billes NucleoMag® B-Beads, le tampon de lavage NPW3, NPW4, l’éthanol à 80 % ainsi que le tampon d’élution NPE5 sont pré-remplis dans leurs puits respectifs. La préparation et la lyse des échantillons sont effectuées conformément à la procédure standard du kit NucleoMag® Pathogen. Ensuite, les échantillons lysés sont transférés dans les puits de réactifs contenant le tampon de fixation NPB2 et les billes NucleoMag® B-Beads pour une procédure ultérieure sur les instruments MagnetaPure 32 Plus ou IsoPure™ Mini. L’ARN / ADN purifié, élué dans 100 µL de VEL, peut être utilisé directement comme matrice pour la RT-PCR, la PCR ou tout type de réaction enzymatique. Le kit NucleoMag® Pathogen permet une automatisation facile sur les instruments courants de manipulation des liquides ou les séparateurs magnétiques automatisés. Le temps de préparation réel dépend de la configuration de l’instrument et du système de séparation MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 7 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes magnétique utilisé. Typiquement, 96 échantillons peuvent être purifiés en moins de 120 minutes en utilisant le NucleoMag® SEP sur une plateforme d’automatisation. 2.3 Systèmes de séparation magnétique Pour l’utilisation du NucleoMag® Pathogen, il est recommandé d’utiliser le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. La séparation est effectuée dans un Square-well Block (voir informations de commande, paragraphe 7.2). Le kit peut également être utilisé avec d’autres séparateurs courants. Séparateur magnétique Plaque ou tube de séparation NucleoMag® SEP (MN REF 744900) Square-well Block (MN REF 740481) NucleoMag® SEP Mini (MN REF 744901) Tubes de réaction de 1,5 mL ou 2 mL (Sarstedt) NucleoMag® SEP Maxi (MN REF 744902) Tubes de 50 mL (Falcon) NucleoMag® SEP 24 (MN REF 744903) 24 Square-well Block à fond en U Tecan Te-MagS™ Tubes de 1,5 mL sans couvercle (Sarstedt) Séparateurs à aimants fixes Les séparateurs à aimants fixes, comme le NucleoMag® SEP (utilisable manuellement ou sur automates pipeteurs), sont recommandés en association avec un agitateur pour plaques, permettant une resuspension optimale des billes pendant les étapes de lavages et d’élution. Alternativement, les billes peuvent être resuspendues dans les tampons par plusieurs cycles de pipetage. Pour automatiser totalement la procédure sur un robot pipeteur, un bras manipulateur de plaques est nécessaire, afin de transférer la plaque du séparateur magnétique vers l’agitateur pour la resuspension des billes. Systèmes magnétiques mobiles Séparateurs à aimants mobiles : les aimants / tiges magnétiques sont déplacés d’un côté à l’autre du puits et vice versa. Les billes suivent ce mouvement et sont ainsi entraînées à travers le tampon pendant les étapes de lavage et d’élution. La séparation a lieu lorsque le système s’arrête. Séparateurs automatisés Les billes sont resuspendues par rétractation des aimants à l’intérieur de leur protection. Après chaque étape de fixation, lavage ou d’élution, les billes sont collectées et transportées dans le tube ou plaque correspondant à la solution suivante. MagnetaPure 32 Plus et IsoPure™ Mini Les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen (REF 744211) sont spécifiquement conçues pour être utilisées sur les systèmes à barreaux magnétiques MagnetaPure 32 Plus et IsoPure™ Mini. Les réactifs sont pré-remplis dans les plaques colonne par colonne. La préparation et la lyse des échantillons sont effectuées sur la paillasse et les échantillons lysés sont transférés dans les puits de la plaque pré-remplie contenant le tampon de fixation et les billes magnétiques. 8 MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes 2.4 Réglage des paramètres d’agitation Lors de l’utilisation d’un agitateur de plaques pour les étapes de lavage et d’élution, les réglages des paramètres d’agitation doivent être soigneusement ajustés pour chaque plaque de séparation spécifique et chaque agitateur afin d’éviter toute contamination croisée d’un puits à l’autre. Procéder comme suit : Réglage de la vitesse de l’agitateur pour les étapes de fixation et de lavage : Charger 600 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque sur l’agitateur et commencer à agiter avec un set de vitesse modérée pendant 30 s. Éteindre l’agitateur et vérifier la présence de petites gouttelettes d’eau colorée à la surface de la plaque. Augmenter les paramètres de vitesse, agiter pendant 30 s supplémentaires et vérifier à nouveau la présence de gouttelettes à la surface de la plaque. Continuer à augmenter la vitesse jusqu’à ce que vous observiez des gouttelettes sur le dessus de la plaque de séparation. Réduire ensuite progressivement la vitesse, vérifier l’absence de projections et utiliser ce réglage pour les étapes de lavages. Réglage de la vitesse de l’agitateur pour l’étape d’élution : Charger 100 μL d’eau teintée dans les puits de la plaque de collecte et procéder comme décrit ci-dessus. 2.5 Manipulation des billes Distribution des billes Une distribution homogène des billes magnétiques dans les différents puits de la plaque de séparation est essentielle pour assurer une grande cohérence d’un puits à l’autre. Par conséquent, avant de distribuer les billes, s’assurer que les billes sont complètement remises en suspension. Bien agiter le flacon de stockage ou le placer brièvement sur un vortex. Le fait de mélanger au préalable les billes magnétiques avec le tampon de fixation permet une distribution plus homogène des billes dans les différents puits de la plaque de séparation. Lors de l’automatisation, il est recommandé de procéder à une étape de prémélange avant d’aspirer le mélange billes / tampon de fixation du réservoir afin de maintenir les billes remises en suspension. Durée de séparation magnétique L’attraction des billes magnétiques sur les aimants dépend de la force magnétique des aimants, de la plaque de séparation choisie, de la distance entre la plaque de séparation et les aimants et du volume à traiter. Les temps d’aimantation des billes sur les aimants doivent être vérifiés et ajustés pour chaque système. Il est recommandé d’utiliser les plaques ou tubes de séparation spécifiés par le fournisseur du séparateur magnétique. Lavage des billes Le lavage des billes peut être réalisé par agitation ou pipetage. Contrairement aux pipetages successifs, le mélange par agitation ou magnétique permet un lavage simultané de tous les échantillons. Cela permet de réduire le temps et la consommation du nombre de cônes nécessaires à la préparation. La remise en suspension par pipetages successifs est cependant plus efficace que le mélange par agitation ou magnétique. MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 9 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes Méthode Efficacité de la remise en suspension Vitesse Nombre de cônes nécessaires Mélange magnétique + ++ Faible Agitateur ++ ++ Faible Pipetage +++ +* Haut 2.6 Procédures d’élution L’ARN et l’ADN de l’agent pathogène purifiés peuvent être élués directement avec le tampon d’élution fourni. L’élution peut être effectuée dans un volume ≥ 50 μL. Il est essentiel de recouvrir complètement les billes NucleoMag® avec le tampon d’élution pendant l’étape d’élution. Le volume de tampon d’élution distribué dépend du système de séparation magnétique (p.e., la position du culot à l’intérieur de la plaque de séparation). Pour une élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être entièrement remis en suspension dans le tampon d’élution. Pour certains séparateurs, des volumes d’élution élevés peuvent être nécessaires pour couvrir la totalité du culot. Les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen (REF 744211) contiennent 100 µL de tampon d’élution NPE5 additionné d’azide de sodium à 0,02 % comme conservateur. Vous cherchez une solution d’automatisation pour votre flux de travail avec le kit NucleoMag® Pathogen ? Veuillez contacter : MACHEREYNAGEL ‑GmbH & Co. KG Tél : +49 24 21 ‑969333 [email protected] * Dispositif de pipetage à 8 canaux 10 MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention : NPL1, NPB2 et le tampon ARN Carrier contiennent du sel chaotropique ! Porter des gants et des lunettes ! Tous les composants du kit NucleoMag® Pathogen doivent être conservés à température ambiante (15 – 25 °C) et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette de l’emballage. Les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen doivent être conservées en position verticale à une température comprise entre 15 et 25 °C, sans exposition directe aux rayons UV ou à la lumière du soleil. Ne pas conserver les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen à des températures supérieures à 25 °C ou inférieures à 15 °C. Vérifier que les tampons précipitent et préchauffer la plaque afin de dissoudre les précipités. Lorsqu’elles sont conservées correctement, les plaques préremplies sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Tous les tampons sont livrés prêts à l’emploi. Avant de débuter une procédure NucleoMag® Pathogen, préparez les éléments suivants : Protéinase K : Avant la première utilisation du kit, ajouter 3,35 mL de tampon de protéinase PB à chaque flacon de protéinase K lyophilisée. La solution de protéinase K dissoute doit être conservée à -20 °C. (Note : Les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen sont livrées avec de la protéinase K liquide, prête à l’emploi). ARN Carrier : Avant la première utilisation du kit, ajouter 500 μL de tampon pour ARN Carrier à chaque flacon d’ARN Carrier lyophilisé. Dissoudre l’ARN Carrier et conserver la solution d’ARN Carrier dissoute dans des aliquotes à -20 °C jusqu’à 6 mois. Note : En raison de la procédure de production et de la faible quantité d’ARN Carrier contenue dans le flacon, l’ARN Carrier peut difficilement être visible. NucleoMag® Pathogen REF 1 × 96 preps 744210.1 4 × 96 preps 744210.4 Protéinase K (lyophilisée) 1 flacon (75 mg) 3 flacons (75 mg/flacon) Ajouter 3,35 mL de tampon protéinase Ajouter 3,35 mL de tampon protéinase dans chaque flacon. 1 flacon (400 μg) 4 flacons (400 μg/vial) Ajouter 500 μL de tampon ARN Carrier Ajouter 500 μL de tampon ARN Carrier dans chaque flacon. ARN Carrier (lyophilisé) MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 11 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes NucleoMag® Pathogen Prefilled Plates REF ARN Carrier (lyophilisé) 1 × 96 preps 744210.1 1 flacon (400 μg) Ajouter 500 μL de tampon ARN Carrier 12 MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 NucleoMag® Pathogen 4 Instructions de sécurité Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® Pathogen ou avec les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen, portez des vêtements de protection appropriés (p.e. une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection). Pour plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds). Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon NPL1 et le thiocyanate de guanidinium dans le tampon ARN Carrier peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils sont combinés à de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation d’échantillons. Les déchets générés par le kit NucleoMag® Pathogen ou les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen n’ont pas été testés pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement dénaturant et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales. 4.1 Elimination des déchets Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales. MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 13 NucleoMag® Pathogen 5 Protocole pour l’extraction d’ARN et d’ADN viraux et d’ADN microbien à partir de sang, de tissus homogénéisés, de sérum, de plasma, d’autres fluides corporels et de lavages 5.1 Préparation des échantillons a) Échantillons de sang / salive Un volume d’échantillon de 100 à 200 μL de sang est recommandé. Ne pas utiliser de volumes plus élevés. Lors de la procédure de traitement d’un échantillon de moins de 200 μL, ajuster avec du tampon PBS jusqu’à un volume final de 200 μL. b) Échantillons de tissus Homogénéiser les échantillons de tissus. En général, 5 à 10 mg d’échantillon peuvent être homogénéisés dans 400 μL de tampon PBS à l’aide d’un broyeur à billes. Si nécessaire, des quantités plus importantes d’échantillon peuvent être utilisées (jusqu’à 25 mg). Il convient de tenir compte du fait que les acides nucléiques totaux copurifiés peuvent provoquer une inhibition dans les essais PCR ultérieurs. Centrifuger l’échantillon homogénéisé et utiliser jusqu’à 200 μL de surnageant clarifié pour la suite de la procédure. Si l’on utilise moins de 200 μL, ajuster avec du tampon PBS pour obtenir un volume final de 200 μL. Pour l’extraction de l’ARN viral : Le tissu peut également être broyé dans un tampon contenant du sel chaotropique (par exemple, le tampon RA1, voir les informations Informations de commande) et du bêta-mercaptoéthanol ou de l’agent réducteur TCEP (voir les informations de commande, paragraphe 7.2). c) Ecouvillons Incuber les écouvillons dans du PBS, du chlorure de sodium ou du milieu de culture cellulaire pendant 30 min sous agitation. Retirer ensuite l’écouvillon en le pressant contre les parois du tube pour faire sortir la plus grande partie du liquide ou utiliser nos NucleoSpin® Forensic Filters (filtres à centrifuger simples). Pour la clarification des lysats en format 96 puits, utiliser la plaque NucleoSpin® Trace Filter (voir les informations de commande, paragraphe 7.2). d) Fèces Mélanger 1 volume de fèces (p.e., 500 μL) avec un volume égal de tampon PBS. Mélanger vigoureusement en vortexant pendant 1 min. Laisser les particules se déposer ou centrifuger à faible vitesse (p.e. à 500 x g). Procéder avec le surnageant clarifié. Pour les bactéries difficiles à lyser, un broyage mécanique ou un traitement à l’aide de billes appropriées peut être nécessaire (p.e. tubes de billes de type A, voir les informations de commande au paragraphe 7.2). e) Purification des échantillons extraits par TRIzol®. Après la séparation des phases par centrifugation, procéder avec la phase aqueuse (la phase supérieure incolore ; environ 400 µL). Pour la suite de la procédure, commencer par l’étape 2 du protocole de purification en mélangeant 400 μL de la phase aqueuse avec 600 μL de tampon NPB2 et 20 μL de NucleoMag® B-Beads. Dans la procédure du NucleoZOL, la phase aqueuse peut être utilisée de la même manière que celle décrite ci-dessus. 14 MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 NucleoMag® Pathogen 5.2 Résumé du protocole Pour les exigences en matière de matériel, voir le paragraphe 2.3. Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 17. Avant de débuter la procédure : Vérifier si la protéinase K et l’ARN Carrier ont été préparés conformément au paragraphe 3. 1 Lyse de l’échantillon 200 μL d’échantillon (homogénéisé) 20 μL Protéinase K 4 μL ARN Carrier 180 μL NPL1 Mélanger TA, 15 min ou 56 °C, 15 min 2 Fixer les acides nucléiques aux NucleoMag® B-Beads 600 μL NPB2 20 μL B-Billes Mélanger par agitation pendant 5 à 10 min à TA. (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 3 Lavage avec le tampon NPW3 Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 600 μL NPW3 Remettre en suspension : Agiter 1 min à TA Retirer le surnageant après 2 min de séparation. MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 15 NucleoMag® Pathogen 4 Lavage avec le tampon NPW4 Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 600 μL NPW4 Remettre en suspension : Agiter 1 min à TA Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 5 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 600 μL d’éthanol 80 % Remettre en suspension : Agiter 1 min à TA Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 6 Étape de séchage 7 Elution de l’ARN et de l’ADN Sécher à l’air libre pendant 10 min à température ambiante Retirer le Square-well Block du NucleoMag® SEP 50‑100 μL NPE5 Agitation 5 min à TA (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Séparer 2 min et transférer l’ARN et l’ADN dans la plaque / les tubes d’élution. 16 MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 NucleoMag® Pathogen 5.3 Protocole détaillé Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (p.e. NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés. Il est recommandé d’utiliser un Square-well Block pour la séparation (voir les informations de commande, paragraphe 7.2). L’extraction de l’ARN et de l’ADN des pathogènes peut également être réalisée dans des tubes de réaction avec des séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de guide pour l’adaptation du kit aux instruments robotisés. 1 Lyse de l’échantillon Prédispenser 20 μL de protéinase K et 200 μL d’échantillon dans un tube de réaction approprié. Ajouter 180 μL de tampon de lyse NPL1 au tube de réaction. Optionnel : Ajouter 4 μL de la solution mère d’ARN Carrier dans le tube de réaction. Bien mélanger par pipetages successifs et incuber à température ambiante pendant 15 min avec agitation. L’étape de lyse peut également être réalisée dans des barrettes de tubes (voir informations de commande, paragraphe 7.2). Après l’incubation de la lyse, centrifuger pour collecter l’échantillon des couvercles des tubes de lyse et transférer chaque lysat dans les puits d’un Square-well Block. L’incubation de la lyse peut être effectuée à 56 °C pour augmenter l’efficacité de la lyse, p.e. pour l’extraction d’ADN bactérien à partir de bactéries difficiles à lyser. Optionnel : la lyse peut être soutenue par un prétraitement de l’échantillon avec des billes appropriées pour le broyage mécanique des bactéries difficiles à lyser. 2 Fixer les acides nucléiques aux billes magnétiques Ajouter 20 μL de NucleoMag® B-Beads remises en suspension et 600 μL de tampon de fixation NPB2 à l’échantillon lysé. Mélanger par pipetages successifs 6 fois et agiter pendant 5 min à température ambiante. Alternativement, lors de la procédure du kit sans agitateur, pipeter de haut en bas 10 fois et incuber pendant 5 min à température ambiante. Les billes NucleoMag® B-Beads et le tampon NPB2 peuvent être mélangés préalablement. Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les retirer du flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une suspension homogène soit formée. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le NucleoMag® SEP un séparateur magnétique. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Ne pas perturber les billes attirées lors de l’aspiration du surnageant. MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 17 NucleoMag® Pathogen Prefilled Plates 3 Lavage avec le tampon NPW3 Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 600 μL de tampon NPW3 et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (1 – 3 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par pipetages successifs. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 4 Lavage avec le tampon NPW4 Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 600 μL de tampon NPW4 et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (1 – 3 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par pipetages successifs. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 5 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 600 μL d’éthanol à 80 % et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (1 – 3 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par pipetages successifs. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 6 Sécher les billes magnétiques à l’air libre Sécher à l’air le culot de billes magnétiques pendant 10 min à température ambiante. 7 Elution de l’ARN et de l’ADN Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter le volume souhaité de NPE5 (50 – 100 μL) dans chaque puits du Square-well Block et remettre les billes en suspension par agitation pendant 5 min à température ambiante. Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par pipetages successifs et incuber pendant 5 min à 56 °C. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant les acides nucléiques purifiés dans des microtubes ou des barrettes de tubes (voir informations de commande, paragraphe 7.2). 18 MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 NucleoMag® Pathogen Prefilled Plates 6 Protocole pour les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen Les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen sont spécifiquement conçues pour être utilisées sur les instruments MagnetaPure 32 Plus ou IsoPure™ Mini uniquement. Veuillez contacter notre support technique pour toute question concernant la compatibilité d’instruments comparables. Aperçu schématique de la plaque de réactifs pré-remplie. Transférer 404 µL de lysat clarifé 1 2 Transférer 404 µL de lysat clarifé 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 575 µL NPB2, 20 µL B-Beads A 600 µL NPW3 B 600 µL NPW4 C 600 µL 80% ethanol Empty D 100 µL Tampon d’élution E F G H ADN / ARN purifié ADN / ARN purifié Note : Les fichiers de méthode nécessaires à la procédure de traitement des plaques préremplies NucleoMag® Pathogen sur les instruments IsoPure™ Mini ou MagnetaPure 32 Plus peuvent être demandés à l’adresse suivante : [email protected]. MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 19 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes 6.1 Protocole détaillé pour IsoPure™ Mini et MagnetaPure 32 Plus La préparation (voir paragraphe 5) et la lyse des échantillons doivent être effectuées en dehors de l’instrument. Avant de débuter la procédure : • Porter des lunettes de protection et des vêtements de protection appropriés • Vérifier si l’ARN Carrier a été préparé conformément au chapitre 3. • Vérifier l’absence de précipités dans les tampons conformément au chapitre 3. • Vérifier si le bon programme est installé sur votre instrument. • IsoPure™ Mini : NMPathogen (durée d’exécution d’environ 30 min) • MagnetaPure 32 Plus : NMPathogen (durée d’exécution d’environ 30 min) 1 Lyse des échantillons Prédispenser 20 μL de protéinase K et 200 μL d’échantillon dans un tube de réaction approprié. Ajouter 180 μL de tampon NPL1 au tube de réaction. Optionnel : ajouter 4 μL de la solution mère d’ARN Carrier au tube de réaction. Bien mélanger par pipetages successifs ou par agitation et incuber à température ambiante pendant 15 min avec agitation. Alternativement, l’étape de lyse peut être réalisée dans des barrettes de tubes (voir informations de commande). Pendant ce temps, préparer la plaque 96 puits pré-remplie NucleoMag® Pathogen. Après l’incubation de la lyse, centrifuger pour recueillir les échantillons des couvercles des tubes de lyse. Note : Consultez le paragraphe 5 pour la préparation de l’échantillon. 2 Préparer la/les plaque(s) de réactifs Centrifuger brièvement (par exemple 10 à 15 s à 1 000 × g) la plaque 96 puits préremplie NucleoMag® Pathogen dans une centrifugeuse appropriée pour éliminer les gouttelettes de la face intérieure du film. 3 Retirer le(s) joint(s) Retirez délicatement le joint de la plaque de réactifs en tirant sur le joint d’un côté avec une force égale. Note : Vérifier qu’il n’y a pas de résidus de film sur la plaque et l’enlever avec une pince à épiler si nécessaire. 4 Transférer le(s) lysat(s) clarifié(s) Transférer jusqu’à 400 µL de l’échantillon clarifié et lysé de l’étape 1 dans les puits respectifs des colonnes 1 et 7 des plaques utilisées. Note : Ne pas souiller le bord supérieur de la plaque 96 Deep-well. Note : Jusqu’à 404 µL de lysat clarifié peuvent être transférés si l’ARN Carrier est utilisé. 20 MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes 5 Sélectionner le protocole et lancer l’exécution Charger la (les) plaque(s) sur l’instrument. Insérer les Tip combs sur les rainures de montage. Lancer le run. Note : Equiper tous les barreaux magnétiques avec des Tip combs même pour les puits non utilisés. 6 Transfert de l’éluat L’instrument s’arrête après la dernière étape d’élution. Retirer et jeter les cônes. Décharger la/les plaque(s) de l’instrument et transférer l’éluat pour une procédure ultérieure dans une plaque ou des tubes appropriée (és). MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 21 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes 7 Annexes 7.1 Guide de résolution des problèmes Problème Causes possibles et suggestions Lyse des échantillons incomplète • L’échantillon mélangé avec le tampon de lyse et la protéinase K n’a pas été complètement homogénéisé et mélangé avec le tampon de lyse, la protéinase K. Le mélange doit être agité en permanence. Sinon, prolonger le temps d’incubation avec la protéinase K. Volume de tampon d’élution insuffisant • Faible rendement / faible sensibilité Le culot de billes doit être entièrement recouvert de tampon d’élution et doit être entièrement remis en suspension. Performance insuffisante du tampon d’élution pendant l’étape d’élution • Retirer complètement le tampon du culot de billes après les étapes de fixation et de lavage. Le tampon restant diminue l’efficacité des étapes suivantes. Aspiration d’une partie des billes présents sur l’aimant • Ne pas perturber les billes attirées lors de l’aspiration du surnageant. Il faut être particulièrement prudent lors de l’élimination du lysat des billes, car le lysat est généralement trop opaque pour permettre un contrôle visuel du culot. Aspiration et perte de billes • Durée de séparation magnétique trop courte ou vitesse d’aspiration trop élevée. Procédure de lavage insuffisante Pureté insuffisante / faible sensibilité 22 • Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de séparateur et de plaque, par exemple, Square-well Block en combinaison avec NucleoMag® SEP. • S’assurer que les billes sont remises en suspension complètement pendant la procédure de lavage. Si l’agitation n’est pas suffisante pour remettre les billes en suspension complètement, mélanger par pipetages des tubes appropriée (és). MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes Problème Causes possibles et suggestions Elimination de l’éthanol des tampons de lavage • Mauvaise performance de l’ADN/ARN dans les applications en aval Veillez à éliminer toute la solution de lavage éthanolique à 80 % du lavage final, car l’éthanol résiduel interfère avec les applications en aval. Évaporation de l’éthanol des tampons de lavage • Fermer hermétiquement les flacons de tampons, éviter l’évaporation de l’éthanol des flacons de tampons ainsi que des tampons remplis dans les réservoirs. Ne pas réutiliser les tampons des réservoirs de tampons. Durée de séparation magnétique trop courte • Perte des billes Augmenter la durée de séparation pour permettre aux billes d’être complètement attirées par les aimants avant d’aspirer tout liquide du puits. Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution) • Une vitesse d’aspiration élevée pendant l’étape d’élution peut entraîner une perte des billes. Réduire la vitesse d’aspiration pour l’étape d’élution. MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 23 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes 7.2 Informations de commande Produit REF Conditionnement NucleoMag Pathogen 744210.1 744210.4 1 × 96 preps 4 × 96 preps NucleoMag® Pathogen Prefilled Plates 744211 6 × 16 preps NucleoMag® SEP Mini 744901 1 ® NucleoMag SEPMaxi 744902 1 ® NucleoMag SEP 24 744903 1 Square-well Blocks 740481 740481.24 4 24 Film PE auto-adhésif 740676 50 feuilles Rack de Tubes Strips (le set se compose d’un rack, de 12 Tubes Strips de 8 tubes chacune, et 12 barrettes de 8 bouchons) 740477 740477.24 4 sets 24 sets NucleoSpin® Forensic Filters (mini-filtre à centrifuger semi-perméable ; sous blister individuel) 740988.50 740988.250 50 250 NucleoSpin® Forensic Filters (Bulk) (mini-filtre à centrifuger semi-perméable ; conditionné en vrac) 740988.50B 740988.250B 740988.1000B 50 250 1000 NucleoSpin® Trace Filter Plate (plaque 96 puits de filtration pour p.e. séparer les écouvillons du lysat) 740677 20 MN Bead Tubes Type A 740786.50 50 96-well Accessory Kit A pour KingFisher Square-well Blocks, Deep-well tip Combs, Plaques d’élution pour 4 × 96 NucleoMag® Pathogen preps avec la plateforme KingFisher® Flex 744950 1 set Tampon RA1 (60 mL) 740961 60 mL Agent réducteur TCEP 740395.107 107 mg 96 Deep-well plates pour systèmes à barreaux magnétiques 744955 25 8-well Tip Combs pour système à barreaux magnétiques 744960 50 Kit d’accessoires pour 8 puits systèmes à barreaux magnétiques 744961 1 set ® Visitez le site www.mn-net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit. 24 MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes 7.3 Restrictions d’utilisation / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Dernière mise à jour, Rev. 04 Veuillez contacter : MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tel. : +49 24 21 969‑333 support@mn‑net.com Marques déposées : TRIzol® est une marque déposée de Molecular Research Center, Inc. KingFisher est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific NucleoMag® est une marque déposée de MACHEREYNAGEL ‑GmbH & Co KG Te-MagS est une marque déposée de Tecan Group Ltd, Suisse. Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques enregistrées de leur propriétaire respectif - même s’il ne s’agit pas d’une dénomination spéciale. La mention de produits et de marques n’est qu’une forme d’information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et ne peut être considérée comme une forme de recommandation ou d’évaluation). En ce qui concerne ces produits ou services, nous ne pouvons donner aucune garantie quant au choix, à l’efficacité ou au fonctionnement. MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08 25 Plasmid DNA Clean up RNA DNA Viral RNA and DNA Protein High throughput Accessories Auxiliary tools www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 [email protected] CH +41 62 388 55 00 [email protected] FR +33 388 68 22 68 [email protected] US +1 888 321 62 24 [email protected] ">
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