Macherey-Nagel NucleoMag Pathogen kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
Manuel
d’utilisation
User manual
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
n NucleoMag® Pathogen
n NucleoMag® Pathogen Prefilled Plates
June 2024 / Rev. 08
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Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
Sommaire
1 Composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Matériel à fournir par l’utilisateur
5
1.3 A propos de ce manuel
5
2 Description du produit
7
2.1 Principe général
7
2.2 Caractéristiques du kit
7
2.3 Systèmes de séparation magnétique
8
2.4 Réglage des paramètres d’agitation
9
2.5 Manipulation des billes
9
2.6 Procédures d’élution
10
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
11
4 Instructions de sécurité
13
4.1 Elimination des déchets
13
5 Protocole pour l’extraction d’ARN et d’ADN viraux et d’ADN microbien à partir de sang, de
tissus homogénéisés, de sérum, de plasma, d’autres fluides corporels et de lavages
14
5.1 Préparation des échantillons
14
5.2 Résumé du protocole
15
5.3 Protocole détaillé
17
®
6 Protocole pour les plaques pré-remplies NucleoMag Pathogen
6.1 Protocole détaillé pour IsoPure™ Mini et MagnetaPure 32 Plus
7 Annexes
19
20
22
7.1 Guide de résolution des problèmes
22
7.2 Informations de commande
24
7.3 Restrictions d’utilisation / ​garantie
25
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
3
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoMag® Pathogen
REF
1 × 96 preps
744210.1
4 × 96 preps
744210.4
NucleoMag® B-Beads
2 × 1,5 mL
10 mL
Tampon de lyse NPL1
30 mL
100 mL
Tampon de fixation NPB2
110 mL
3 × 110 mL
Tampon de lavage NPW3
75 mL
300 mL
Tampon de lavage NPW4
75 mL
300 mL
Tampon d’élution NPE5*
30 mL
125 mL
ARN Carrier **
400 μg
4 × 400 μg
Tampon ARN Carrier
500 μL
4 × 500 μL
Protéinase K (lyophilisée) **
75 mg
3 × 75 mg
Tampon de protéinase PB
8 mL
15 mL
1
1
Manuel d’utilisation
NucleoMag® Pathogen Prefilled Plates
6 × 16 preps
744211
REF
Tampon de lyse NPL1
30 mL
Plaque 96 puits pré-remplies de réactifs
NucleoMag® Pathogen
6 pièces
ARN Carrier*
400 μg
Tampon ARN Carrier
500 μL
Protéinase K liquide
2 mL
8-well Tip Combs
6 × 2 pièces
Notice d’utilisation
1
* Composition du tampon d’élution NPE5 : 5 mM Tris/HCl, pH 8,5
** Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3.
4
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
1.2
Matériel à fournir par l’utilisateur
Produit
REF
Conditionnement
Aimant pour la séparation des billes magnétiques,
p.e. NucleoMag® SEP
NucleoMag® SEP Mini
NucleoMag® SEP Maxi
NucleoMag® SEP 24
744900
744901
744902
744903
1
1
1
1
Plaque de séparation pour séparer les billes
magnétiques,
p.e., Square-well Block (bloc 96 puits avec des puits
carrés de 2,1 mL)
Tubes de lyse pour l’incubation des échantillons et
la lyse,
p.e., Rack of Tubes Strips (1 set comprend 1 Rack, 12
barrettes de 8 tubes (puits de 1,2 mL) chacune, et 12
barrettes de bouchons)
Plaque d’élution pour la collecte des acides
nucléiques purifiés,
p.e., Elution Plate U-bottom (microplaque de 96 puits
avec des puits à fond en U de 300 μL)
Pour l’utilisation du kit sur l’instrument KingFisher®
Flex :
p.e., KingFisher® Accessory Kit A (Deep-well Blocks,
Deep-well tip combs, Elution Plates for 4 × 96
NucleoMag® Pathogen preps pour utiliser avec le
KingFisher® Flex)
Pour l’utilisation du kit sur MagnatePure 32 Plus ou
IsoPure Mini :
96 Deep-well plates pour systèmes à barreaux
magnétiques
Pour l’utilisation du kit sur MagnatePure 32 Plus ou
IsoPure Mini :
8-well Tip Combs pour systèmes à barreaux
magnétiques
740481
4
740481.24 24
740477
4 sets
740477.24 24 sets
740486.24 24
744950
1 sets
744955
25 pièces
744960
25 × 2 pièces
Réactifs :
•
80 % d’éthanol
1.3
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé aux personnes qui utilisent le kit NucleoMag® Pathogen pour
la première fois de lire les paragraphes du présent manuel d’utilisation consacrés au protocole
détaillé. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le
résumé du protocole est conçu pour servir d’outil de référence rapide pendant l’exécution de
la procédure de purification.
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
5
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
Toute la documentation technique est disponible sur le site www.mn-net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes.
6
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
2
Description du produit
2.1
Principe général
Le kit NucleoMag® Pathogen est conçu pour l’isolement de l’ARN et de l’ADN viraux et de
l’ADN bactérien à partir de liquides acellulaires tels que le sérum ou le plasma, le sang, la
salive, les suspensions d’échantillons de tissus homogénéisés, les suspensions d’échantillons
de selles et les lavages d’écouvillons. Ce kit fournit des réactifs et des billes magnétiques pour
l’extraction de 96 échantillons. La procédure est basée sur l’adsorption réversible des acides
nucléiques sur les billes paramagnétiques dans des conditions de tampons appropriées. La
lyse des échantillons est réalisée par incubation avec un tampon de lyse NPL1 contenant des
ions chaotropiques et soutenu par une digestion à la protéinase K. Pour la fixation des acides
nucléiques sur les billes paramagnétiques, le tampon de fixation NPB2 et les NucleoMag®
B-Beads sont ajoutés au lysat. Après la séparation magnétique, les billes paramagnétiques
sont lavées pour éliminer les contaminants et les sels à l’aide des tampons de lavage NPW3,
NPW4 et de l’éthanol à 80 %. L’éthanol résiduel des étapes de lavage précédentes est éliminé
par séchage à l’air. Enfin, l’ARN et l’ADN pathogènes hautement purs sont élués à l’aide d’un
tampon d’élution à faible teneur en sel ou d’eau. L’ARN et l’ADN pathogènes purifiés peuvent
être directement utilisés pour des applications en aval. Il est recommandé d’utiliser des contrôles
appropriés pour les applications en aval (p.e. contrôles internes, contrôles d’extraction,
contrôles positifs/négatifs). Le kit NucleoMag® Pathogen peut être utilisé manuellement ou
automatiquement sur des robots pipeteurs ou des séparateurs magnétiques automatisés.
Nous pouvons fournir une assistance personnalisée, des informations sur les protocoles ou
des programmes vérifiés pour de nombreuses plateformes. Pour plus d’informations, veuillez
contacter notre support technique ou visiter le site www.mn-net.com/automation.
2.2
Caractéristiques du kit
Le kit NucleoMag® Pathogen est conçu pour la préparation rapide, manuelle et automatisée
à petite échelle de l’ARN et de l’ADN viraux et de l’ADN de micro-organismes à partir de divers
types d’échantillons cliniques. Le kit est conçu pour être utilisé avec la plaque de séparation
magnétique NucleoMag® SEP (voir informations de commande, paragraphe 7.2) ou d’autres
systèmes de séparation magnétique (voir paragraphe 2.3). Le temps de préparation manuel
de 96 échantillons est d’environ 120 minutes. L’ARN et l’ADN purifiés peuvent être utilisés
directement comme matrice pour la RT-PCR, la PCR ou tout type de réaction enzymatique.
Réserver à l’usage de la recherche.
Les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen (REF 744211) sont des plaques 96 puits
profonds pré-remplies spécialement conçues pour être utilisées sur les systèmes MagnetaPure
32 Plus ou IsoPure™ Mini. Le tampon de fixation NPB2, les billes NucleoMag® B-Beads, le
tampon de lavage NPW3, NPW4, l’éthanol à 80 % ainsi que le tampon d’élution NPE5 sont
pré-remplis dans leurs puits respectifs. La préparation et la lyse des échantillons sont effectuées
conformément à la procédure standard du kit NucleoMag® Pathogen. Ensuite, les échantillons
lysés sont transférés dans les puits de réactifs contenant le tampon de fixation NPB2 et les
billes NucleoMag® B-Beads pour une procédure ultérieure sur les instruments MagnetaPure
32 Plus ou IsoPure™ Mini. L’ARN / ​ADN purifié, élué dans 100 µL de VEL, peut être utilisé
directement comme matrice pour la RT-PCR, la PCR ou tout type de réaction enzymatique.
Le kit NucleoMag® Pathogen permet une automatisation facile sur les instruments courants
de manipulation des liquides ou les séparateurs magnétiques automatisés. Le temps de
préparation réel dépend de la configuration de l’instrument et du système de séparation
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
7
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
magnétique utilisé. Typiquement, 96 échantillons peuvent être purifiés en moins de 120 minutes
en utilisant le NucleoMag® SEP sur une plateforme d’automatisation.
2.3
Systèmes de séparation magnétique
Pour l’utilisation du NucleoMag® Pathogen, il est recommandé d’utiliser le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. La séparation est effectuée dans un Square-well Block (voir
informations de commande, paragraphe 7.2). Le kit peut également être utilisé avec d’autres
séparateurs courants.
Séparateur magnétique
Plaque ou tube de séparation
NucleoMag® SEP (MN REF 744900)
Square-well Block (MN REF 740481)
NucleoMag® SEP Mini (MN REF 744901)
Tubes de réaction de 1,5 mL ou 2 mL
(Sarstedt)
NucleoMag® SEP Maxi (MN REF 744902)
Tubes de 50 mL (Falcon)
NucleoMag® SEP 24 (MN REF 744903)
24 Square-well Block à fond en U
Tecan Te-MagS™
Tubes de 1,5 mL sans couvercle (Sarstedt)
Séparateurs à aimants fixes
Les séparateurs à aimants fixes, comme le NucleoMag® SEP (utilisable manuellement ou sur
automates pipeteurs), sont recommandés en association avec un agitateur pour plaques,
permettant une resuspension optimale des billes pendant les étapes de lavages et d’élution.
Alternativement, les billes peuvent être resuspendues dans les tampons par plusieurs cycles de
pipetage. Pour automatiser totalement la procédure sur un robot pipeteur, un bras manipulateur
de plaques est nécessaire, afin de transférer la plaque du séparateur magnétique vers l’agitateur
pour la resuspension des billes.
Systèmes magnétiques mobiles
Séparateurs à aimants mobiles : les aimants / ​tiges magnétiques sont déplacés d’un côté à
l’autre du puits et vice versa. Les billes suivent ce mouvement et sont ainsi entraînées à travers
le tampon pendant les étapes de lavage et d’élution. La séparation a lieu lorsque le système
s’arrête.
Séparateurs automatisés
Les billes sont resuspendues par rétractation des aimants à l’intérieur de leur protection. Après
chaque étape de fixation, lavage ou d’élution, les billes sont collectées et transportées dans le
tube ou plaque correspondant à la solution suivante.
MagnetaPure 32 Plus et IsoPure™ Mini
Les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen (REF 744211) sont spécifiquement conçues
pour être utilisées sur les systèmes à barreaux magnétiques MagnetaPure 32 Plus et IsoPure™
Mini. Les réactifs sont pré-remplis dans les plaques colonne par colonne. La préparation et la
lyse des échantillons sont effectuées sur la paillasse et les échantillons lysés sont transférés
dans les puits de la plaque pré-remplie contenant le tampon de fixation et les billes magnétiques.
8
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
2.4
Réglage des paramètres d’agitation
Lors de l’utilisation d’un agitateur de plaques pour les étapes de lavage et d’élution, les
réglages des paramètres d’agitation doivent être soigneusement ajustés pour chaque plaque
de séparation spécifique et chaque agitateur afin d’éviter toute contamination croisée d’un puits
à l’autre. Procéder comme suit :
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour les étapes de fixation et de lavage :
Charger 600 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque
sur l’agitateur et commencer à agiter avec un set de vitesse modérée pendant 30 s. Éteindre
l’agitateur et vérifier la présence de petites gouttelettes d’eau colorée à la surface de la plaque.
Augmenter les paramètres de vitesse, agiter pendant 30 s supplémentaires et vérifier à nouveau
la présence de gouttelettes à la surface de la plaque.
Continuer à augmenter la vitesse jusqu’à ce que vous observiez des gouttelettes sur le dessus
de la plaque de séparation. Réduire ensuite progressivement la vitesse, vérifier l’absence de
projections et utiliser ce réglage pour les étapes de lavages.
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour l’étape d’élution :
Charger 100 μL d’eau teintée dans les puits de la plaque de collecte et procéder comme décrit
ci-dessus.
2.5
Manipulation des billes
Distribution des billes
Une distribution homogène des billes magnétiques dans les différents puits de la plaque
de séparation est essentielle pour assurer une grande cohérence d’un puits à l’autre. Par
conséquent, avant de distribuer les billes, s’assurer que les billes sont complètement remises
en suspension. Bien agiter le flacon de stockage ou le placer brièvement sur un vortex. Le
fait de mélanger au préalable les billes magnétiques avec le tampon de fixation permet une
distribution plus homogène des billes dans les différents puits de la plaque de séparation.
Lors de l’automatisation, il est recommandé de procéder à une étape de prémélange avant
d’aspirer le mélange billes / ​tampon de fixation du réservoir afin de maintenir les billes remises
en suspension.
Durée de séparation magnétique
L’attraction des billes magnétiques sur les aimants dépend de la force magnétique des aimants,
de la plaque de séparation choisie, de la distance entre la plaque de séparation et les aimants
et du volume à traiter. Les temps d’aimantation des billes sur les aimants doivent être vérifiés et
ajustés pour chaque système. Il est recommandé d’utiliser les plaques ou tubes de séparation
spécifiés par le fournisseur du séparateur magnétique.
Lavage des billes
Le lavage des billes peut être réalisé par agitation ou pipetage. Contrairement aux pipetages
successifs, le mélange par agitation ou magnétique permet un lavage simultané de tous
les échantillons. Cela permet de réduire le temps et la consommation du nombre de cônes
nécessaires à la préparation. La remise en suspension par pipetages successifs est cependant
plus efficace que le mélange par agitation ou magnétique.
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
9
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
Méthode
Efficacité de
la remise en
suspension
Vitesse
Nombre de cônes
nécessaires
Mélange magnétique
+
++
Faible
Agitateur
++
++
Faible
Pipetage
+++
+*
Haut
2.6
Procédures d’élution
L’ARN et l’ADN de l’agent pathogène purifiés peuvent être élués directement avec le tampon
d’élution fourni. L’élution peut être effectuée dans un volume ≥ 50 μL. Il est essentiel de recouvrir
complètement les billes NucleoMag® avec le tampon d’élution pendant l’étape d’élution. Le
volume de tampon d’élution distribué dépend du système de séparation magnétique (p.e., la
position du culot à l’intérieur de la plaque de séparation). Pour une élution efficace, le culot de
billes magnétiques doit être entièrement remis en suspension dans le tampon d’élution. Pour
certains séparateurs, des volumes d’élution élevés peuvent être nécessaires pour couvrir la
totalité du culot.
Les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen (REF 744211) contiennent 100 µL de tampon
d’élution NPE5 additionné d’azide de sodium à 0,02 % comme conservateur.
Vous cherchez une solution d’automatisation pour votre flux de travail avec le kit NucleoMag®
Pathogen ?
Veuillez contacter :
MACHEREYNAGEL ‑GmbH & Co. KG
Tél : +49 24 21 ‑969333
[email protected]
* Dispositif de pipetage à 8 canaux
10
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention :
NPL1, NPB2 et le tampon ARN Carrier contiennent du sel chaotropique ! Porter des gants et
des lunettes !
Tous les composants du kit NucleoMag® Pathogen doivent être conservés à température
ambiante (15 – 25 °C) et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette de l’emballage.
Les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen doivent être conservées en position verticale
à une température comprise entre 15 et 25 °C, sans exposition directe aux rayons UV ou à
la lumière du soleil. Ne pas conserver les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen à des
températures supérieures à 25 °C ou inférieures à 15 °C. Vérifier que les tampons précipitent
et préchauffer la plaque afin de dissoudre les précipités. Lorsqu’elles sont conservées
correctement, les plaques préremplies sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit.
Tous les tampons sont livrés prêts à l’emploi.
Avant de débuter une procédure NucleoMag® Pathogen, préparez les éléments suivants :
Protéinase K : Avant la première utilisation du kit, ajouter 3,35 mL de tampon de protéinase PB
à chaque flacon de protéinase K lyophilisée. La solution de protéinase K dissoute doit être
conservée à -20 °C. (Note : Les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen sont livrées avec
de la protéinase K liquide, prête à l’emploi).
ARN Carrier : Avant la première utilisation du kit, ajouter 500 μL de tampon pour ARN Carrier
à chaque flacon d’ARN Carrier lyophilisé. Dissoudre l’ARN Carrier et conserver la solution
d’ARN Carrier dissoute dans des aliquotes à -20 °C jusqu’à 6 mois.
Note : En raison de la procédure de production et de la faible quantité d’ARN Carrier contenue
dans le flacon, l’ARN Carrier peut difficilement être visible.
NucleoMag® Pathogen
REF
1 × 96 preps
744210.1
4 × 96 preps
744210.4
Protéinase K (lyophilisée)
1 flacon (75 mg)
3 flacons (75 mg/flacon)
Ajouter 3,35 mL de tampon
protéinase
Ajouter 3,35 mL de tampon
protéinase dans chaque
flacon.
1 flacon (400 μg)
4 flacons (400 μg/vial)
Ajouter 500 μL de tampon
ARN
Carrier
Ajouter 500 μL de
tampon ARN Carrier dans
chaque flacon.
ARN Carrier (lyophilisé)
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
11
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
NucleoMag® Pathogen Prefilled Plates
REF
ARN Carrier (lyophilisé)
1 × 96 preps
744210.1
1 flacon (400 μg)
Ajouter 500 μL de tampon ARN Carrier
12
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
NucleoMag® Pathogen
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® Pathogen ou avec les plaques pré-remplies
NucleoMag® Pathogen, portez des vêtements de protection appropriés (p.e. une blouse
de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection). Pour plus d’informations,
consulter les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne sur
www.mn-net.com/msds).
Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon NPL1 et le thiocyanate de guanidinium
dans le tampon ARN Carrier peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils sont
combinés à de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions
acides directement aux déchets de préparation d’échantillons.
Les déchets générés par le kit NucleoMag® Pathogen ou les plaques pré-remplies
NucleoMag® Pathogen n’ont pas été testés pour détecter la présence de matériel infectieux
résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est
hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement dénaturant et du traitement à
la protéinase K, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides
doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément
aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
13
NucleoMag® Pathogen
5
Protocole pour l’extraction d’ARN et d’ADN
viraux et d’ADN microbien à partir de sang, de
tissus homogénéisés, de sérum, de plasma,
d’autres fluides corporels et de lavages
5.1
Préparation des échantillons
a) Échantillons de sang / ​salive
Un volume d’échantillon de 100 à 200 μL de sang est recommandé. Ne pas utiliser de volumes
plus élevés. Lors de la procédure de traitement d’un échantillon de moins de 200 μL, ajuster
avec du tampon PBS jusqu’à un volume final de 200 μL.
b) Échantillons de tissus
Homogénéiser les échantillons de tissus. En général, 5 à 10 mg d’échantillon peuvent être
homogénéisés dans 400 μL de tampon PBS à l’aide d’un broyeur à billes. Si nécessaire, des
quantités plus importantes d’échantillon peuvent être utilisées (jusqu’à 25 mg). Il convient de
tenir compte du fait que les acides nucléiques totaux copurifiés peuvent provoquer une inhibition
dans les essais PCR ultérieurs. Centrifuger l’échantillon homogénéisé et utiliser jusqu’à 200 μL
de surnageant clarifié pour la suite de la procédure. Si l’on utilise moins de 200 μL, ajuster avec
du tampon PBS pour obtenir un volume final de 200 μL.
Pour l’extraction de l’ARN viral :
Le tissu peut également être broyé dans un tampon contenant du sel chaotropique (par exemple,
le tampon RA1, voir les informations Informations de commande) et du bêta-mercaptoéthanol
ou de l’agent réducteur TCEP (voir les informations de commande, paragraphe 7.2).
c) Ecouvillons
Incuber les écouvillons dans du PBS, du chlorure de sodium ou du milieu de culture cellulaire
pendant 30 min sous agitation. Retirer ensuite l’écouvillon en le pressant contre les parois du
tube pour faire sortir la plus grande partie du liquide ou utiliser nos NucleoSpin® Forensic Filters
(filtres à centrifuger simples). Pour la clarification des lysats en format 96 puits, utiliser la plaque
NucleoSpin® Trace Filter (voir les informations de commande, paragraphe 7.2).
d) Fèces
Mélanger 1 volume de fèces (p.e., 500 μL) avec un volume égal de tampon PBS. Mélanger
vigoureusement en vortexant pendant 1 min. Laisser les particules se déposer ou centrifuger à
faible vitesse (p.e. à 500 x g). Procéder avec le surnageant clarifié. Pour les bactéries difficiles à
lyser, un broyage mécanique ou un traitement à l’aide de billes appropriées peut être nécessaire
(p.e. tubes de billes de type A, voir les informations de commande au paragraphe 7.2).
e) Purification des échantillons extraits par TRIzol®.
Après la séparation des phases par centrifugation, procéder avec la phase aqueuse (la phase
supérieure incolore ; environ 400 µL). Pour la suite de la procédure, commencer par l’étape
2 du protocole de purification en mélangeant 400 μL de la phase aqueuse avec 600 μL de
tampon NPB2 et 20 μL de NucleoMag® B-Beads.
Dans la procédure du NucleoZOL, la phase aqueuse peut être utilisée de la même manière
que celle décrite ci-dessus.
14
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
NucleoMag® Pathogen
5.2
Résumé du protocole
Pour les exigences en matière de matériel, voir le paragraphe 2.3.
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 17.
Avant de débuter la procédure :
Vérifier si la protéinase K et l’ARN Carrier ont été préparés conformément au paragraphe 3.
1
Lyse de
l’échantillon
200 μL d’échantillon (homogénéisé)
20 μL Protéinase K
4 μL ARN Carrier
180 μL NPL1
Mélanger
TA, 15 min
ou
56 °C, 15 min
2
Fixer les acides
nucléiques aux
NucleoMag®
B-Beads
600 μL NPB2
20 μL B-Billes
Mélanger par agitation pendant 5 à
10 min à TA.
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
3
Lavage avec le
tampon NPW3
Retirer
le Square-well
Block du NucleoMag® SEP
600 μL NPW3
Remettre en suspension : Agiter 1 min à
TA
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
15
NucleoMag® Pathogen
4
Lavage avec le
tampon NPW4
Retirer
le Square-well
Block du NucleoMag® SEP
600 μL NPW4
Remettre en suspension : Agiter 1 min à
TA
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
5
Lavage avec le
tampon à 80 %
d’éthanol
Retirer
le Square-well
Block du NucleoMag® SEP
600 μL d’éthanol 80 %
Remettre en suspension : Agiter 1 min à
TA
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
6
Étape de
séchage
7
Elution de l’ARN
et de l’ADN
Sécher à l’air libre pendant 10 min
à température ambiante
Retirer le Square-well Block du
NucleoMag® SEP
50‑100 μL NPE5
Agitation 5 min à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Séparer 2 min et transférer l’ARN et l’ADN
dans la plaque / ​les tubes d’élution.
16
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
NucleoMag® Pathogen
5.3
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (p.e. NucleoMag®
SEP) et les agitateurs de plaques adaptés. Il est recommandé d’utiliser un Square-well Block
pour la séparation (voir les informations de commande, paragraphe 7.2). L’extraction de l’ARN
et de l’ADN des pathogènes peut également être réalisée dans des tubes de réaction avec des
séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert
de guide pour l’adaptation du kit aux instruments robotisés.
1
Lyse de l’échantillon
Prédispenser 20 μL de protéinase K et 200 μL d’échantillon dans un tube de réaction
approprié. Ajouter 180 μL de tampon de lyse NPL1 au tube de réaction.
Optionnel : Ajouter 4 μL de la solution mère d’ARN Carrier dans le tube de réaction.
Bien mélanger par pipetages successifs et incuber à température ambiante pendant
15 min avec agitation. L’étape de lyse peut également être réalisée dans des barrettes
de tubes (voir informations de commande, paragraphe 7.2).
Après l’incubation de la lyse, centrifuger pour collecter l’échantillon des couvercles des
tubes de lyse et transférer chaque lysat dans les puits d’un Square-well Block.
L’incubation de la lyse peut être effectuée à 56 °C pour augmenter l’efficacité de la lyse,
p.e. pour l’extraction d’ADN bactérien à partir de bactéries difficiles à lyser.
Optionnel : la lyse peut être soutenue par un prétraitement de l’échantillon avec des
billes appropriées pour le broyage mécanique des bactéries difficiles à lyser.
2
Fixer les acides nucléiques aux billes magnétiques
Ajouter 20 μL de NucleoMag® B-Beads remises en suspension et 600 μL de
tampon de fixation NPB2 à l’échantillon lysé.
Mélanger par pipetages successifs 6 fois et agiter pendant 5 min à température
ambiante.
Alternativement, lors de la procédure du kit sans agitateur, pipeter de haut en bas 10 fois
et incuber pendant 5 min à température ambiante.
Les billes NucleoMag® B-Beads et le tampon NPB2 peuvent être mélangés
préalablement.
Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les retirer du flacon
de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une suspension
homogène soit formée.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le NucleoMag® SEP
un séparateur magnétique. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
Ne pas perturber les billes attirées lors de l’aspiration du surnageant.
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
17
NucleoMag® Pathogen Prefilled Plates
3
Lavage avec le tampon NPW3
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 μL de tampon NPW3 et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à
ce que les billes soient complètement remises en suspension (1 – 3 min). Alternativement,
remettre les billes en suspension complètement par pipetages successifs.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
4
Lavage avec le tampon NPW4
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter
600 μL de tampon NPW4 et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce
que les billes soient complètement remises en suspension (1 – 3 min). Alternativement,
remettre les billes en suspension complètement par pipetages successifs.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
5
Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter
600 μL d’éthanol à 80 % et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce
que les billes soient complètement remises en suspension (1 – 3 min). Alternativement,
remettre les billes en suspension complètement par pipetages successifs.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
6
Sécher les billes magnétiques à l’air libre
Sécher à l’air le culot de billes magnétiques pendant 10 min à température ambiante.
7
Elution de l’ARN et de l’ADN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter le
volume souhaité de NPE5 (50 – 100 μL) dans chaque puits du Square-well Block et
remettre les billes en suspension par agitation pendant 5 min à température ambiante.
Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par pipetages
successifs et incuber pendant 5 min à 56 °C.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant les acides
nucléiques purifiés dans des microtubes ou des barrettes de tubes (voir informations de
commande, paragraphe 7.2).
18
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
NucleoMag® Pathogen Prefilled Plates
6
Protocole pour les plaques pré-remplies
NucleoMag® Pathogen
Les plaques pré-remplies NucleoMag® Pathogen sont spécifiquement conçues pour être
utilisées sur les instruments MagnetaPure 32 Plus ou IsoPure™ Mini uniquement. Veuillez
contacter notre support technique pour toute question concernant la compatibilité d’instruments
comparables.
Aperçu schématique de la plaque de réactifs pré-remplie.
Transférer 404 µL de
lysat clarifé
1
2
Transférer 404 µL de
lysat clarifé
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
575 µL NPB2, 20 µL B-Beads
A
600 µL NPW3
B
600 µL NPW4
C
600 µL 80% ethanol
Empty
D
100 µL Tampon d’élution
E
F
G
H
ADN / ARN purifié
ADN / ARN purifié
Note : Les fichiers de méthode nécessaires à la procédure de traitement des plaques
préremplies NucleoMag® Pathogen sur les instruments IsoPure™ Mini ou MagnetaPure 32
Plus peuvent être demandés à l’adresse suivante : [email protected].
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
19
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
6.1
Protocole détaillé pour IsoPure™ Mini et MagnetaPure 32
Plus
La préparation (voir paragraphe 5) et la lyse des échantillons doivent être effectuées en dehors
de l’instrument. Avant de débuter la procédure :
•
Porter des lunettes de protection et des vêtements de protection appropriés
•
Vérifier si l’ARN Carrier a été préparé conformément au chapitre 3.
•
Vérifier l’absence de précipités dans les tampons conformément au chapitre 3.
•
Vérifier si le bon programme est installé sur votre instrument.
• IsoPure™ Mini : NMPathogen (durée d’exécution d’environ 30 min)
• MagnetaPure 32 Plus : NMPathogen (durée d’exécution d’environ 30 min)
1
Lyse des échantillons
Prédispenser 20 μL de protéinase K et 200 μL d’échantillon dans un tube de
réaction approprié. Ajouter 180 μL de tampon NPL1 au tube de réaction. Optionnel :
ajouter 4 μL de la solution mère d’ARN Carrier au tube de réaction. Bien mélanger par
pipetages successifs ou par agitation et incuber à température ambiante pendant
15 min avec agitation. Alternativement, l’étape de lyse peut être réalisée dans des
barrettes de tubes (voir informations de commande).
Pendant ce temps, préparer la plaque 96 puits pré-remplie NucleoMag® Pathogen.
Après l’incubation de la lyse, centrifuger pour recueillir les échantillons des couvercles
des tubes de lyse.
Note : Consultez le paragraphe 5 pour la préparation de l’échantillon.
2
Préparer la/les plaque(s) de réactifs
Centrifuger brièvement (par exemple 10 à 15 s à 1 000 × g) la plaque 96 puits préremplie NucleoMag® Pathogen dans une centrifugeuse appropriée pour éliminer les
gouttelettes de la face intérieure du film.
3
Retirer le(s) joint(s)
Retirez délicatement le joint de la plaque de réactifs en tirant sur le joint d’un côté avec
une force égale.
Note : Vérifier qu’il n’y a pas de résidus de film sur la plaque et l’enlever avec une pince
à épiler si nécessaire.
4
Transférer le(s) lysat(s) clarifié(s)
Transférer jusqu’à 400 µL de l’échantillon clarifié et lysé de l’étape 1 dans les puits
respectifs des colonnes 1 et 7 des plaques utilisées.
Note : Ne pas souiller le bord supérieur de la plaque 96 Deep-well.
Note : Jusqu’à 404 µL de lysat clarifié peuvent être transférés si l’ARN Carrier est
utilisé.
20
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
5
Sélectionner le protocole et lancer l’exécution
Charger la (les) plaque(s) sur l’instrument.
Insérer les Tip combs sur les rainures de montage.
Lancer le run.
Note : Equiper tous les barreaux magnétiques avec des Tip combs même pour les
puits non utilisés.
6
Transfert de l’éluat
L’instrument s’arrête après la dernière étape d’élution. Retirer et jeter les cônes.
Décharger la/les plaque(s) de l’instrument et transférer l’éluat pour une procédure
ultérieure dans une plaque ou des tubes appropriée (és).
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
21
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
7
Annexes
7.1
Guide de résolution des problèmes
Problème
Causes possibles et suggestions
Lyse des échantillons incomplète
•
L’échantillon mélangé avec le tampon de lyse et la protéinase
K n’a pas été complètement homogénéisé et mélangé avec le
tampon de lyse, la protéinase K. Le mélange doit être agité en
permanence. Sinon, prolonger le temps d’incubation avec la
protéinase K.
Volume de tampon d’élution insuffisant
•
Faible rendement / ​
faible sensibilité
Le culot de billes doit être entièrement recouvert de tampon
d’élution et doit être entièrement remis en suspension.
Performance insuffisante du tampon d’élution pendant l’étape
d’élution
•
Retirer complètement le tampon du culot de billes après les
étapes de fixation et de lavage. Le tampon restant diminue
l’efficacité des étapes suivantes.
Aspiration d’une partie des billes présents sur l’aimant
•
Ne pas perturber les billes attirées lors de l’aspiration du
surnageant. Il faut être particulièrement prudent lors de
l’élimination du lysat des billes, car le lysat est généralement trop
opaque pour permettre un contrôle visuel du culot.
Aspiration et perte de billes
•
Durée de séparation magnétique trop courte ou vitesse
d’aspiration trop élevée.
Procédure de lavage insuffisante
Pureté insuffisante / ​
faible sensibilité
22
•
Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de séparateur
et de plaque, par exemple, Square-well Block en combinaison
avec NucleoMag® SEP.
•
S’assurer que les billes sont remises en suspension
complètement pendant la procédure de lavage. Si l’agitation
n’est pas suffisante pour remettre les billes en suspension
complètement, mélanger par pipetages des tubes appropriée
(és).
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
Problème
Causes possibles et suggestions
Elimination de l’éthanol des tampons de lavage
•
Mauvaise
performance de
l’ADN/ARN dans les
applications en aval
Veillez à éliminer toute la solution de lavage éthanolique à
80 % du lavage final, car l’éthanol résiduel interfère avec les
applications en aval.
Évaporation de l’éthanol des tampons de lavage
•
Fermer hermétiquement les flacons de tampons, éviter
l’évaporation de l’éthanol des flacons de tampons ainsi que
des tampons remplis dans les réservoirs. Ne pas réutiliser les
tampons des réservoirs de tampons.
Durée de séparation magnétique trop courte
•
Perte des billes
Augmenter la durée de séparation pour permettre aux billes
d’être complètement attirées par les aimants avant d’aspirer tout
liquide du puits.
Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution)
•
Une vitesse d’aspiration élevée pendant l’étape d’élution peut
entraîner une perte des billes. Réduire la vitesse d’aspiration
pour l’étape d’élution.
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
23
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
7.2
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoMag Pathogen
744210.1
744210.4
1 × 96 preps
4 × 96 preps
NucleoMag® Pathogen Prefilled Plates
744211
6 × 16 preps
NucleoMag® SEP Mini
744901
1
®
NucleoMag SEPMaxi
744902
1
®
NucleoMag SEP 24
744903
1
Square-well Blocks
740481
740481.24
4
24
Film PE auto-adhésif
740676
50 feuilles
Rack de Tubes Strips
(le set se compose d’un rack, de 12 Tubes Strips
de 8 tubes chacune, et 12 barrettes de
8 bouchons)
740477
740477.24
4 sets
24 sets
NucleoSpin® Forensic Filters
(mini-filtre à centrifuger semi-perméable ; sous
blister individuel)
740988.50
740988.250
50
250
NucleoSpin® Forensic Filters (Bulk)
(mini-filtre à centrifuger semi-perméable ;
conditionné en vrac)
740988.50B
740988.250B
740988.1000B
50
250
1000
NucleoSpin® Trace Filter Plate
(plaque 96 puits de filtration pour p.e. séparer les
écouvillons du lysat)
740677
20
MN Bead Tubes Type A
740786.50
50
96-well Accessory Kit A pour KingFisher
Square-well Blocks, Deep-well tip Combs,
Plaques d’élution pour 4 × 96 NucleoMag®
Pathogen preps avec la plateforme KingFisher® Flex
744950
1 set
Tampon RA1 (60 mL)
740961
60 mL
Agent réducteur TCEP
740395.107
107 mg
96 Deep-well plates pour systèmes à barreaux
magnétiques
744955
25
8-well Tip Combs pour système à barreaux
magnétiques
744960
50
Kit d’accessoires pour 8 puits systèmes à barreaux
magnétiques
744961
1 set
®
Visitez le site www.mn-net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit.
24
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
Extraction d’ARN et d’ADN d’agents pathogènes
7.3
Restrictions d’utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne
font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société.
MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez
contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur
les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour
obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la
documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour, Rev. 04
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Tel. : +49 24 21 969‑333
support@mn‑net.com
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Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées de leur propriétaire respectif - même s’il ne s’agit pas d’une dénomination spéciale. La mention de
produits et de marques n’est qu’une forme d’information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et
ne peut être considérée comme une forme de recommandation ou d’évaluation). En ce qui concerne ces produits ou
services, nous ne pouvons donner aucune garantie quant au choix, à l’efficacité ou au fonctionnement.
MACHEREY-NAGEL – 06/2024, Rev. 08
25
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Clean up
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DNA
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