Rev : 22-05-2013 Microscopie en transmission (Plein champs) et éléments d’optique François MICHEL PhD La microscopie pour débutants (ou pas) Partie 1 Quelques images de microscopie 1 mm 0.1 mm 0.5 mm F. Michel 22.05.13 Quelques images de microscopie F. Michel 22.05.13 Illumination standard Contraste de phase Contraste interférentiel différentiel Bright field Phase contrast Nomarski contrast - DIC Quelques images de microscopie Cresyl D.A.B F. Michel 22.05.13 Ce qui vous attend F. Michel 22.05.13 Généralités Illumination Détection Aberrations et détérioration de l’image Résolution et acquisition d’image Amélioration des contrastes Généralités Buts multiples de la microscopie : – rendre les détails visibles à l'œil humain ou par caméra – séparer les détails dans l'image, – Mesurer/détecter un signal lumineux, – produire une image agrandie de l'objet observé. Souvent, l’observation s’effectue en fin de chaîne après l’expérience et la préparation des échantillons : Il faut tenir compte du type d’observation prévu dés le début du protocole. F. Michel 22.05.13 Généralités F. Michel 22.05.13 • Un objet n’est observable que par la lumière qui en émane. • Cette lumière est générée : – Par transmission, elle traverse l’échantillon – Par émission (source secondaire : fluorescence) après excitation (par une source lumineuse primaire ou autres sources d’énergie). • Un microscope se décompose donc en deux parties : – L’illumination – La détection Illumination Détection Généralités F. Michel 22.05.13 Microscopes droits Caméra Détection Illumination F. Michel 22.05.13 Généralités Microscope inversé Condenseur Oculaires Illumination Diascopique = transmission Objectifs F. Michel 22.05.13 Généralités Ordres de grandeur 1 km 103 100 m 102 10 m 10 1m 1 10 cm 10-1 1 mm 10 µm 100 nm 1 nm 10 pm 1 cm 100 µm 1 µm 10 nm 1Å 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 Vision directe Loupe binoculaire Microscopie photonique Super-résolution Microscope électronique AFM Généralités F. Michel 22.05.13 Nature de la lumière et optique L’optique est la branche de la physique qui traite de la lumière, de ses relations avec la matière et avec la vision. Discipline ancienne datant de l’antiquité (Grèce, Egypte...) Dans un premier temps basée sur l’optique géométrique : propagation rectiligne des rayons lumineux, elle explique réflexions et réfractions (Al-Hazem - Kepler - Snell - Descartes). Fin XVIIème, début des hostilités sur la nature de la lumière entre : La vision corpusculaire qui aboutira à l’optique quantique au XXème siècle (Aristote - Euclide - Newton – Planck – Einstein ; couleur, énergie) L’optique ondulatoire à partir du XVIIIéme (Huygens - Young - Fresnel – Maxwell ; diffraction, interférence, polarité) . La dualité onde/corpuscule est reconnue en 1927 par N. Bohr et clos le débat donnant naissance à l’électrodynamique quantique. F. Michel 22.05.13 Généralités Nature de la lumière et optique La lumière est donc composée de photons : γ qui se propagent de façon rectiligne comme une onde électromagnétique (Maxwell,1870) . Géométrique Ondulatoire =λ Electromagnétique Quantique La longueur d’onde donnant la couleur du rayonnement. Longueur d’onde λ (en nm) X UV IR radio 400 500 600 700 Généralités F. Michel 22.05.13 Physiologie visuelle (rappels ?!?) La limite de résolution de l’œil est due à la structure de la rétine : Les images de deux points doivent se former sur deux récepteurs distincts pour ne pas être confondues. L'écartement minimal de deux récepteurs étant de 2,2 µm, la limite de résolution dépend d’un grand nombre de facteurs, en conditions normales, elle est d’environ 3.10-4 radian = 1' d’arc soit <150 µm à une distance de 25 cm. Bâtonnets Rétine +/- 300 µm Le fond de l’œil ou rétine est tapissé de deux types de cellules photosensibles. Les cônes détectent les couleurs (faibles sensibilité) et les bâtonnets à forte sensibilité (niveaux de gris). Cônes bleus Cônes verts Cônes rouges F. Michel 22.05.13 Généralités Trajet optique : lentille (convergente) f Les rayons passant par le centre ne sont pas déviés. Les rayons parallèles à l’axe optique passent par le foyer image. Conditions de Gauss : Les rayons traversent le système, sont peu inclinés sur l'axe du système (rayons paraxiaux) et proche du centre optique. F. Michel 22.05.13 Généralités Optique géométrique (rappels ?!?) B A f f’ A’ O B’ Plus l’objet est proche du foyer plus l’image est grande. Si l’objet est avant le foyer, l’image est inversée Grandissement de la lentille : Lumière F. Michel 22.05.13 Généralités Optique géométrique (rappels ?!?) Objet au foyer B f A f’ Lumière O Image inversée à l’infinie F. Michel 22.05.13 Généralités Optique géométrique (rappels ?!?) Objet entre le foyer et la lentille B’ B A’ f f’ A O Image virtuelle dans le sens AB Lumière Généralités F. Michel 22.05.13 Combinaison lentille & œil Microscope simple (loupe) : image perçue par l'œil comme si elle était à une distance de 25 centimètres 25 cm Lentille simple (loupe) Objet réel L’image apparaît du même côté de l'objectif que l’objet, et ne peut pas être projetée sur un écran : image virtuelle (droite, non inversée). La lumière transmise à travers la tranche entre dans la lentille pour être réfractée et focalisée et produire l’image perçue par la rétine. Image virtuelle f F. Michel 22.05.13 Généralités Interfaces et réfraction α2 α1 α3 α1 n1 n2 n1 > n2 n1 n3 n1 < n3 n1 sinα1 = n2 sinα2 Loi de Snell-Descartes Nature 455 p 299 : Farewell to Flatland by Ortwin Hess Généralités Interfaces et réfraction sinα1 = n2/n1 (sinα2) Exemple : α1 = 30° nair/nverre =1/1,52 α2 = 19,2° Air Verre α1 α2 nair nverre F. Michel 22.05.13 Valeurs approchées de n, l’indice optique, pour quelques substances F. Michel 22.05.13 Généralités Interfaces et réfraction n : indice optique n = c/ν donc n≥1 c : vitesse de la lumière dans le vide ν : la vitesse de propagation de l'onde dans le milieu traversé νvide = c= 299 792 458 m·s-1 ≈νAir= 299 704 764 m·s-1 Donc nvide=1 et nair=1.0002926 νEau= 224841533 m·s-1 νVerre= 197603687 m·s-1 donc neau=1.33335 donc nverre=1.51714 α2 = 22.02° α2 = 19,24° ν = f(ε, µ) = f(λ, P, T…) εµν2 = 1 ε : permittivité diélectrique μ : perméabilité magnétique Généralités F. Michel 22.05.13 Principe du microscope optique Plan image intermédiaire L'objectif (L1) donne de l'objet AB observé une image réelle A’B’ renversée et très agrandie qui joue pour l'oculaire (L2) le rôle d'objet réel. L'oculaire donne de cet objet une image virtuelle agrandie, vue par l'observateur à l’infinie car A’B’ est au foyer F2 de l’oculaire. Généralités Composants du microscope • Statif • Condenseur • Objectifs • Oculaires /caméra Concepts importants • Ouverture numérique • Résolution • Aberrations F. Michel 22.05.13 Ce qui vous attend F. Michel 22.05.13 Généralités Illumination Détection Aberrations et détérioration de l’image Résolution et acquisition d’image Amélioration des contrastes Illumination F. Michel 22.05.13 Sources de lumière La source de lumière en microscopie de transmission a longtemps été le soleil ou une bougie. Elle est maintenant constitué d’une lampe halogène à filament de tungstène 12 V. L’illumination par LED blanches devient de plus en plus courante. Illumination Condenseur La fonction du condenseur est de concentrer la lumière sur l’objet. Les microscopes d'initiation sont le plus souvent dépourvus de condenseur, auquel est substitué un miroir concave ou des LEDs blanches. Le champ éclairé par le condenseur doit être uniforme. L'ouverture numérique du condenseur joue sur la qualité de l'illumination de l'objet. Idéalement, elle devrait correspondre à celle de l'objectif (il existe des condenseurs à immersion pour les objectifs d'ON >1) F. Michel 22.05.13 F. Michel 22.05.13 Illumination Illumination critique Echantillon Source lumineuse Lentille collectrice (Miroir concave) Plan objet Image de la source Objectif F. Michel 22.05.13 Illumination Illumination critique C’est la méthode la plus simple. Elle consiste à focaliser la lumière de la source sur l’objet. L’inconvénient majeur est que la source n’est généralement pas homogène et par conséquent, l’échantillon ne sera pas éclairé uniformément ce qui induit des aberrations tels que des effets de bords (bords sombres). C’est la méthode de choix pour les faibles éclairements (flamme, soleil, lampe). Objectif Diaphragme d’ouverture Condenseur Illumination F. Michel 22.05.13 Illumination critique Mauvais réglages du diaphragme d’ouverture du condenseur : A) la pupille d’entrée de l’objectif n’est pas entièrement couverte (perte de résolution) ou B) toute la lumière n’entre pas (perte de luminosité et de contraste). A B Illumination F. Michel 22.05.13 Illumination de Köhler Diaphragme de champs Diaphragme d’ouverture Condenseur Réglage essentiel: - assure un éclairage homogène de la préparation - contribue à l’obtention de la meilleure résolution latérale - intervient sur la profondeur de champ et le contraste de l’image Objectif August Köhler (1866-1948) Illumination F. Michel 22.05.13 Disposition des diaphragmes Boîtier lumière transmise à lampe halogène Diaphragme de champ Vis de centrage du condenseur Filtres gris (densités neutres) et/ou colorés Mise au point axiale du condenseur Diaphragme d’ouverture Condenseur Microscope inversé Illumination F. Michel 22.05.13 Réglages de Köhler (à faire pour chaque objectif) 1) Mettre au point sur une préparation à faible grossissement, les deux diaphragmes grands ouverts. 2) En dehors de l’échantillon, fermer le diaphragme de champ pour visualiser une tache lumineuse polygonale, floue et non centrée. Illumination Réglages de Köhler 3) Rendre nette cette tâche en jouant sur la hauteur du condenseur (bords polygonaux) 4) Centrer ce polygone dans le champ à l’aide des vis de centrage du condenseur F. Michel 22.05.13 F. Michel 22.05.13 Illumination Réglages de Köhler 5) Ouvrir le diaphragme de champ jusqu’à la limite de perception dans l’oculaire (tangentiel) pour vérifier le centrage puis l’ouvrir un peu plus. 6) Fermer légèrement le diaphragme d’ouverture si besoin est, pour contraster. fermé médian ouvert F. Michel 22.05.13 Illumination illumination détection Trajet optique Réglage optimal de • lampe + collecteur • diaphragmes • condenseur • objectif • oculaires Ce qui vous attend F. Michel 22.05.13 Généralités Illumination Détection Aberrations et détérioration de l’image Résolution et acquisition d’image Amélioration des contrastes Détection F. Michel 22.05.13 Objectifs 60x 1.4 NA Lamelle Milieu de montage Huile Objet Lame Détection F. Michel 22.05.13 Objectifs Objet complexe, fragile et couteux (de 500 à plus de 20 000 €), central dans la chaîne optique, sa qualité (sa propreté) et ses caractéristiques influent directement sur l’image obtenue. F. Michel 22.05.13 Détection Caractéristiques techniques des objectifs Marques : incompatibles entre elles (vissage, optiques, corrections…) Grandissement : de 2.5 à 150X faîtes votre choix (code couleur, zoom…) Ouverture numérique : résolution, luminosité… Milieu(x) d’immersion : sec, eau, huile (ONmax respective : 0.95 – 1.2– 1.47) Type (corrections des aberrations) : planéité, chromaticité… Propriétés optiques spéciales : contraste de phase, DIC… Épaisseur de lamelle : normalement 170 µm (réglable quelquefois, attention aux microscopes inversés (pétri = plastique épais)) Distance de travail : de la lentille d’entrée de l’objectif au point focal (de 150 µm à plusieurs millimètres) * Profondeur de champs : épaisseur de la "coupe optique", dépend de l’ON* * Non indiqué sur l’objectif Détection F. Michel 22.05.13 Ouverture numérique • L’Ouverture Numérique : ON=n.sin(θ) où n est l’indice optique et θ le demi-angle du cône de détection (Numerical Aperture : NA). • L’ON n’est pas liée au grandissement, il y a des ON fortes à faible grandissement comme le 20X sec Zeiss de 0,8 ou des 20X immersion eau Olympus 0,95 et plus récemment Zeiss et Leica de 1,05 d’ON. • Plus l’ON est grande, meilleure est la résolution (Res(nm) = 0.61 λ/ON) • Une mauvaise illumination induit une ON dégradée. F. Michel 22.05.13 Détection Milieux d’immersions : n dans la pratique L'inhomogénéité des indices réduit le pouvoir résolutif du microscope et peu induire des aberrations chromatiques ou autres (n=f(λ..)) n = 1.52 n = 1.52 n=1.52 n=1.52 n = 1.52 Objectif Huile Air n = 1.0 n = 1.52 Lamelle Objet Eau n=1.33 F. Michel 22.05.13 Détection Profondeur de Champ Distance entre le point le plus haut et le point le plus bas de la préparation qui donne une image nette (épaisseur de la tranche optique). Dépend de l’ouverture numérique : la profondeur de champ diminue lorsque l’ouverture numérique augmente. nλ PdC = ON 2 Ex. à 488 nm : 5,4 µm pour un objectif sec x10 (ON 0,3) 0,378 µm à l’objectif x63 à immersion huile (ON 1,4) L’ON d’un microscope en transmission dépend des ON de l’objectif mais aussi du condenseur : le diaphragme d’ouverture limite le cône d’illumination et donc l’ON. Fermé (fort contraste) Ouvert (forte résolution) Ce qui vous attend F. Michel 22.05.13 Généralités Illumination Détection Aberrations et détérioration de l’image Résolution et acquisition d’image Amélioration des contrastes F. Michel 22.05.13 Aberrations et détérioration de l’image Les aberrations optiques sont des écarts aux conditions de Gauss • Aberrations monochromatiques – Sphérique – Coma – Astigmatisme – Courbure de champs – Distorsion • Aberrations chromatique – Longitudinale – Latérale L’image d’un point n’est pas un point ! On y reviendra plus tard… F. Michel 22.05.13 Aberrations et détérioration de l’image Sphériques Les rayons lumineux qui passent à la périphérie ne convergent pas au même endroit que les rayons qui passent au voisinage de l’axe. F. Michel 22.05.13 Aberrations et détérioration de l’image Coma L’image d’un point lorsque la lentille n’est pas perpendiculaire à l’axe optique (tilt) apparaît comme une comète. F. Michel 22.05.13 Aberrations et détérioration de l’image Astigmatisme L‘image d’un point hors axe apparaît comme un bâtonnet; Il y a deux foyers dus à l’asymétrie du montage. F. Michel 22.05.13 Aberrations et détérioration de l’image Géométriques / courbure de champs L’image d’un plan n’est pas un plan, mais une surface sphérique concave (lentille convergente) ou convexe (lentille divergente). F. Michel 22.05.13 Aberrations et détérioration de l’image Chromatiques (axiales et latérales) La distance focale d’une lentille dépend l’indice optique n et donc de λ. F. Michel 22.05.13 Aberrations et détérioration de l’image Correction des aberrations : • limitation des bords des lentilles (diaphragme de champs, Gauss) • lentilles non sphériques (difficiles à usiner, optique adaptative) • association de lentilles de courbures différentes (doublet, triplet…). Type d’objectifs Achromat Plan Achromat Fluorite Plan Fluorite Plan Apochromat Aberrations Sphériques 1 Couleur 1 Couleur 2-3 Couleurs 3-4 Couleurs 3-4 Couleurs Aberrations Courbure de Chromatique champs 2 Couleurs Non 2 Couleurs Oui 2-3 Couleurs Non 2-4 Couleurs Oui 4-5 Couleurs Oui Toutes ces aberrations peuvent être corrigées par associations de lentilles et/ou traitement des surfaces : Les objectifs de microscope sont compliqués, fragiles et coûteux. Ce qui vous attend F. Michel 22.05.13 Généralités Illumination Détection Aberrations et détérioration de l’image Résolution et acquisition d’image Amélioration des contrastes F. Michel 22.05.13 Résolution et acquisition d’image Interférences Géométrique Ondulatoire Electromagnétique Quantique Chaque onde est caractérisée par une phase et une amplitude. Deux ondes peuvent se superposer si elles ont la même direction de propagation et le même plan de vibration, elles vont créer des interférences. F. Michel 22.05.13 Résolution et acquisition d’image Diffraction La lumière est diffractée quand elle rencontre un obstacle à sa propagation (exemple une ouverture), cela va changer sa phase et/ou son amplitude. La diffraction de la lumière est variable en fonction de la taille de l’ouverture et de la longueur d’onde. F. Michel 22.05.13 Résolution et acquisition d’image Tout système optique dégrade l’image source à travers une Fonction de Dispersion d’un Point (PSF) PSF source Système α 2 1 0 1 2 Optique Y X Z Plan focal X Tâche d’Airy L’image d’un point n’est pas un point ! Résolution et acquisition d’image F. Michel 22.05.13 La résolution optique est la capacité d’obtenir l’image de deux points distincts en deux objets (PSF) individualisables. Les deux tâches de Airy apparaîtront comme séparées uniquement si la différence de niveau entre leurs courbes d'énergie est suffisamment grande pour être discernée par le détecteur (œil, caméra…) donc séparés d'une distance au moins égale au rayon du disque d'Airy : Critères de Rayleigh d≥ 1,22λ ON (obj ) + ON (cond ) R fluo = 1,22λ 0,61λ = 2ON ON F. Michel 22.05.13 Résolution et acquisition d’image La PSF et la résolution sont fonction de l’ON ON =0,12 ON =0,34 A 488nm Résolution XY en µm ON =0,87 5X sec 10X sec ON= 0.15 ON= 0.3 1.984 0.992 La résolution dépend de l’ON et non du grandissement 20X sec 40X huile 60X eau ON=0.8 ON=1.3 ON=1.2 0.372 0.229 0.248 60X huile ON=1.4 0.212 Résolution et acquisition d’image Construction de l’image N points 1 point 2 points 5 points Source PSF F. Michel 22.05.13 Résolution et acquisition d’image F. Michel 22.05.13 Résolution axiale (théorique) 2λ n 2λ R xz = ON sin α = ON 2 Pour 5X sec 10X sec 488 nm ON= 0.15 ON= 0.3 Résolution 43.378 10.844 XZ en µm α 8.6° 17.5° 20X sec ON=0.8 40X huile 60X eau ON=1.3 ON=1.2 60X huile ON=1.4 1.525 0.878 0.901 0.757 53.1° 58.8° 64.5° 67.1° ON Pour mémoire α = sin −1 n F. Michel 22.05.13 Résolution et acquisition d’image Détection Dans un microscope l’image que l’on observe est un agrandissement de l’image virtuelle issue de l’objectif (2 étapes). F. Michel 22.05.13 Résolution et acquisition d’image Oculaires • Essentiellement une fonction de lentille de projection avec un grossissement de 5x à 20x. • On ajuste la distance inter-pupillaire à sa morphologie, de même chaque oculaire doit être réglé à sa propre vue. • L'image est nette à +/- 1 cm de la lentille de sortie (les œilletons en caoutchoucs servent à créer cet espace et éviter de salir la lentille). • On peut ajouter dans le trajet optique des filtres ou des grilles positionnement ou de comptage. de F. Michel 22.05.13 Résolution et acquisition d’image Caméras CCD (Charged Coupled Device) Caractéristiques d’une caméra La résolution spatiale La résolution temporelle : Sensibilité, architecture du transfert, binning Le rendement quantique (q<1) : lié aux matériaux, la technique et à la λ Les bruits de fond La dynamique La linéarité : importante pour les étude quantitatives F. Michel 22.05.13 Résolution et acquisition d’image Lum Echantillonnage spatial Taille du pixel optimal (Nyquist-Shannon) = résolution/2,3 : Cela permet d’avoir un minima entre les maximas quelque soit la position des pixels (cadre de lecture). Exemple pour un 100X 1.4 d’ON à 488 nm Résolution 212 nm taille du pixel optimum ≈92 nm Taille réelle 6.45 µm /100 donc 64.5 nm F. Michel 22.05.13 Résolution et acquisition d’image Ratio S/B et Dynamique Bruits de fond : • Bruit de Photon: dû aux caractéristiques de la lumière incidente • Bruit d’obscurité : génération d’e- par effet thermique • Bruit de lecture : généré par l’électronique de la caméra La dynamique : liée au bruit de fond et à la capacité des puits de potentiels (binning) (ex : 5 105 e-/10 e- soit 5000:1 adaptée à une image 12 bits 4096 niveaux de gris) Ce qui vous attend F. Michel 22.05.13 Généralités Illumination Détection Aberrations et détérioration de l’image Résolution et acquisition d’image Amélioration des contrastes Autres mode d’Illumination F. Michel 22.05.13 • Fond noir • Contraste de phase • Contraste Interférentiel Différentiel (DIC) Autres mode d’Illumination F. Michel 22.05.13 Fond noir Photons diffusés Surfaces réfléchissantes Condenseur spécial Filtres occultants Seul les photons diffractés/diffusés par l’échantillon sont transmis et captés par l’objectif du fait de l’illumination structurée. Combinaison d’images en fond noir et d’ illumination polarisée Avec l’autorisation du Dr Steve Edgley http://www.pdn.cam.ac.uk/groups/edgleylab/index.html Autres mode d’Illumination F. Michel 22.05.13 Contraste de phase - L’œil humain est uniquement capable de voir des différences d’intensité (amplitude) ou de couleur (λ). - Les objets biologiques microscopiques sont souvent très transparents et donc peu contrastés car le flux lumineux transmis par les différentes parties des cellules est similaire. Fritz Zernicke, Prix Nobel (1953). Inventeur du contraste de phase - Par contre, l’indice optique des différents compartiments cellulaires est très variable ce qui induit des différences de vitesse des ondes donc des retards de phase des ondes. - But : transformer des différences de phase en différences d’intensité F. Michel 22.05.13 Autres mode d’Illumination Contraste de phase Longueur d’onde (λ) ∆ϕ Lumière directe + Interférences = 0-2π Lumière diffractée Echantillon Déphasage de λ/4 π/2 3π/4 π En moyenne un échantillon biologique entraine un déphasage de λ/4 (π/2 en cosinus). les interférences sont trop faibles pour induire un contraste décelable. Autres mode d’Illumination F. Michel 22.05.13 Contraste de phase Ondes en opposition de phase (λ/2) Echantillon Lame de phase Déphasage de λ/4 supplémentaire = 3π/4 0-2π π/2 π Pour obtenir un contraste maximal, il faut créer l’interférence en déphasant la lumière diffractée uniquement de λ/2. Autres mode d’Illumination Condenseur Anneau de phase F. Michel 22.05.13 Contraste de phase Objectif Lumière directe transmise Lumière diffractée Lame de phase La lumière directe transmise (annulaire - jaune) est fortement atténuée par le cercle de la lame de phase et va interférée avec la lumière diffractée (grise sur le schéma) par l’échantillon pour former un contraste en noir et blanc (interférences destructive (+λ/4) ou constructive (-λ/4) ). On obtient donc un déphasage différentiel de λ/2. F. Michel 22.05.13 Autres mode d’Illumination Contraste interférentiel différentiel :DIC (Nomarski) Les prismes de Wollaston séparent la lumière en deux faisceaux de polarisations perpendiculaires (biréfringence). Lorsqu’ils sont recombinés par le deuxième Wollaston, il y a des interférences entre les deux rayons en fonction de la différence de leurs chemins optiques. Il en résulte une lumière grise si le trajet optique a été le même, et blanche ou noire s’il a été différent, donnant l’illusion d’un éclairage rasant. Ce type de contraste donne un effet de relief sur des préparations épaisses (idéal pour le patch-clamp). Polariseur (45°) Prépare la lumière pour le premier Wollaston. Analyseur (135°) Bloque la lumières transmise directe Prismes de Wollaston Sépare la lumière incidente en deux faisceaux de polarisation croisée Condenseur Echantillon Objectif Prismes de Wollaston Recombine les deux faisceaux de polarisation croisée en un seul à polarisation unique créant des interférences et du contraste. la position latérale du prisme influx sur l’amplitude du contraste. Autres mode d’Illumination F. Michel 22.05.13 Comparaison contraste de phase /DIC Phase Compatible avec l’utilisation de boite plastique Sensible au chemin optique parcouru Halos (contraste noir/blanc) autour des objets Insensible à l’orientation des structures (contraste “isotrope”) DIC Limité au verre Sensible à des variations d’indice Pas de halos autour des objets Utilisation optimale de l’ouverture numérique donc meilleure résolution Sensible à l’orientation des structures (effet pseudo-ombrage) Plus cher Fin du premier round F. Michel 22.05.13 Merci d’avoir tenu jusque là, Prochaine étape : la microscopie de fluorescence Géométrique Ondulatoire Electromagnétique Quantique Commentaires, remarques, améliorations : [email protected] Sources et Ressources F. Michel 22.05.13 WEB divers Molecular expressions http://micro.magnet.fsu.edu/index.html Microscopy U (Nikon) : http://www.microscopyu.com Microscopy resource system (Olympus): http://www.olympusmicro.com/index.html A whole world of microscopy knowledge (Zeiss): http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html Wikipédia Plate-formes d’imagerie PICSL http://www.picsl.univ-mrs.fr/ : MICROSCOPIE OPTIQUE (PDF indisponible) BIC http://www.bic.u-bordeaux2.fr/ : Microscopie à épi-fluorescence et microscopie confocale (PDF) Membres du GDR2588 CNRS (microscopie fonctionnelle des systèmes vivants) et du RTmfm (Réseau technique de microscopie de fluorescence multidimensionnelle). Cours Arnaud Sergé (université de la Méditerranée – Marseille II) Yves Husson (Université Joseph Fourrier – Grenoble) Serge Monneret (Institut Fresnel, Marseille) Maxime Dahan (Laboratoire Kastler Brossel, ENS) François Waharte (institut Curie, UMR144) Handbooks Fondamentaux d’optique et d’imagerie numérique à l’usage des microscopistes (C Cibert, ed. Cépaduès) Handbook of biological confocal microscopy, third edition (JB. Pawley ed. Springer) Fundamentals of light microscopy and electronic imaging (DB. Murphy, ed Wiley-liss) ">
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