MACHEREY-NAGEL Biologie Moléculaire Bioanalysis User manual Manuel d’utilisation ADN / ARN Viral et ADN Bactérien n NucleoSpin® VET Mai 2023 / Rev. 02 www.mn-net.com www.mn-net.com NucleoSpin® VET – Extraction d’ARN/ADN Viral et ADN Bactérien à partir d’échantillons vétérinaires Résumé du Protocole (Rev. 02) Le résumé du protocole est utilisé pour un suivi rapide des étapes de la procédure. Nous recommandons vivement la lecture de la procédure détaillée incluse dans ce manuel avant la première utilisation du kit. Note: le protocole FastTrack pour l’extraction à partir de plasma, sérum et solutions de lavages d’écouvillons, ainsi que les protocoles pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’échantillons stabilisés avec le NucleoProtect VET Blood ou Swab, ne sont décrits que dans les procédures détaillées du manuel d’utilisation. 1 Lyse des échantillons 5.1 5.2 5.3 5.4 200 μL sérum ou plasma 10 μL PK Liquide 100 µL sang animal 5–10 mg tissus Ecouvillons secs Ecouvillons humides Fèces 10 µL PK Liquide 5–10 mg de tissus dans ‘Bead Tube’ 400 µL PBS Sortir l’écouvillon du milieu 200 μL d’échantillon 100 µL de sang 400 µL PBS Insérer l’écouvillon Transférer 300–1000 µL de milieu Mélanger les fèces avec 10 volumes de PBS 200 μL SVL 100 µL PBS Agiter 30 min à TA sous agitation 1 min 2,000 x g Agiter 10 min 1,400 rpm 200 µL SVL Enlever les billes Enlever l’écouvillon Transférer 200 µL de surnageant + 2.5 μL ARN Carrier Agiter 10 min 1,400 rpm Transférer 200 µL de surnageant 1 min 2,000 x g + 10 µL PK Liquide Mélanger + 2.5 µL ARN Carrier + 10 µL PK Liquide Transférer 200 µL de surnageant + 200 µL SVL Incuber à TA 3 min Mélanger + 200 µL SVL + 10 µL PK Liquide Agiter 10 min 1,400 rpm Centrifuger rapidement Incuber à TA 3 min Agiter 10 min à 1,400 rpm + 200 µL SVL + 2.5 µL ARN Carrier Agiter 10 min à 1,400 rpm Mélanger + 2.5 µL ARN Carrier 3 min TA Mélanger 3 min TA 2 + 200 μL d’éthanol Ajuster les conditions de fixation Mélanger TA, 5 min Centrifuger rapidement 3 Déposer l’échantillon Fixation des ARN/ADN viral (~ 610 μL) 4,000 x g, 3 min 4 5 6 5.5 Lavage de la membrane Séchage de la membrane Elution ARN/ ADN er 1 Lavage 400 μL SVW1 11,000 x g, 30 s ème 2 Lavage 400 μL SVW2 11,000 x g, 30 s 3 ème Lavage 200 μL SVW2 20,000 x g, 5 min 56 °C, 5 min avec le bouchon ouvert 100 μL H2O RNase-free (70 °C) TA, 3 min 20,000 x g, 3 min MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com 5.6 1 min 2,000 x g Transférer 250 µL + 250 µL SVL Mélanger + 10 µL PK Liquide Agiter 10 min 1,400 rpm opt. : + 2.5 µL ARN Carrier Mélanger 3 min TA 3 min 15,000 x g Prélever 400 µL de surnageant pour continuer Contact MN Germany and international MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-0 Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only) E-mail: [email protected] Technical Support Bioanalysis Tel.: +49 24 21 969-333 E-mail: [email protected] USA MACHEREY-NAGEL Inc. 924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA Toll-free: 888 321 6224 (MACH) E-mail: [email protected] France MACHEREY-NAGEL SAS 1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France Tel.: +33 388 68 22 68 E-mail: [email protected] MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 € Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531 Switzerland MACHEREY-NAGEL AG Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland Tel.: +41 62 388 55 00 E-mail: [email protected] www.mn-net.com ADN / ARN Viral et ADN Bactérien Sommaire 1 Composition 4 1.2 Réactifs, consommables et équipements nécessaires 4 1.3 A propos de ce manuel d’utilisation 5 2 Description du kit 6 2.1 Principe général 6 2.2 Caractéristiques du kit 6 2.3 Remarques sur la qualité et la préparation des échantillons biologiques 7 2.4 Remarques à propos de l’élution 7 2.5 Remarques concernant le contrôle qualité des kits 7 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs 8 4 Instructions de sécurité 9 4.1 9 Elimination des déchets 5 Protocole pour la purification d’ARN / ADN viral et d’ADN bactérien 10 5.1 Protocole standard pour le sérum, le plasma ou les fluides biologiques acellulaires 10 5.2 Prétraitement des échantillons de sang animal 14 5.3 Prétraitement des échantillons de tissus 15 5.4 Prétraitement des écouvillons secs 17 5.5 Prétraitement des écouvillons humides (en milieu de transport, VTM) 18 5.6 Prétraitement des Fèces 20 5.7 Prétraitement des écouvillons stabilisés dans le NucleoProtect® VET 22 5.8 Prétraitement d'échantillons de sang stabilisés dans le NucleoProtect® VET 23 6 Protocole FastTrack pour le plasma, le sérum et les solutions de lavage d’écouvillons 25 7 Annexes 27 7.1 Optimisation des performances 27 7.2 Informations de commande 27 7.3 Restrictions d’utilisation / garantie 28 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 3 ADN / ARN Viral et ADN Bactérien 1 Composition 1.1 Composants des kits NucleoSpin® VET 10 preps 740842.10 50 preps 740842.50 250 preps 740842.250 Tampon de lyse SVL 13 mL 25 mL 125 mL Tampon de lavage SVW1 6 mL 30 mL 125 mL Tampon de lavage SVW2 (Concentré)* 6 mL 12 mL 50 mL H2O RNase-free 13 mL 13 mL 13 mL ARN Carrier (lyophilisé) 300 µg 300 μg 300 µg Protéinase K Liquide 120 µL 600 μL 2 × 1.5 mL Colonnes NucleoSpin® VET (bagues rouges, avec tubes collecteurs) 10 50 250 Tubes collecteurs (2 mL) 30 150 750 Tubes collecteurs (1.5 mL) pour la lyse et l’élution 20 100 500 REF 1.2 Réactifs, consommables et équipements nécessaires Réactifs • Ethanol 96 – 100 % (pour préparer le Tampon de lavage SVW2 et créer les conditions de fixation de l’ARN / ADN) ; il est recommandé d’utiliser de l’éthanol non-dénaturé. • PBS (Tampon phosphate salin) pour l’extraction à partir de sang, de tissus, d’écouvillons et de fèces. Consommables • Cônes de pipette jetables (les cônes à filtres sont recommandés pour éviter les contaminations croisées). * Pour la préparation des réactifs et leurs conditions de stockage, voir le chapitre 3. 4 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 ADN / ARN Viral et ADN Bactérien Equipement • Pipettes manuelles • Centrifugeuse pour microtubes • Agitateur vortex • Bloc chauffant : 56 °C pour le séchage des colonnes et 70 °C pour le tampon d’élution (inutile pour le protocole ’FastTrack’) • Equipement de protection personnelle (ex : blouse, gants, lunettes de protection) • Tubes de broyage ’MN Bead Tubes Type D’ (voir ’informations de commande’) pour l’extraction à partir de tissus. 1.3 A propos de ce manuel d’utilisation Nous recommandons vivement la lecture du protocole détaillé aux nouveaux utilisateurs du kit NucleoSpin® VET. Cependant, les utilisateurs expérimentés peuvent se référer au ’Résumé du Protocole’, conçu pour un suivi rapide des différentes étapes de la procédure de purification. Toute la littérature technique est disponible sur notre site web : www.mn‑net.com. MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 5 ADN / ARN Viral et ADN Bactérien 2 Description du kit 2.1 Principe général Le kit NucleoSpin® VET propose des protocoles pour différents échantillons vétérinaires (sérum, plasma, fluides biologiques acellulaires, sang, tissus, écouvillons, fèces). Les protocoles se différencient par les procédures de prétraitement et de lyse des échantillons contenant les virus afin de répondre aux différentes particularités des prélèvements. La lyse des échantillons et des virus est effectuée grâce au Tampon de lyse SVL, solution fortement concentrée en ions chaotropiques, combiné à la Protéinase K Liquide incluse dans le kit. Après la lyse, tous les protocoles suivent la même procédure. L’échantillon est déposé sur la colonne NucleoSpin® VET et les acides nucléiques fixés à la membrane. Les contaminants (potentiels inhibiteurs de PCR), comme les sels, les métabolites et les composants cellulaires macromoléculaires sont éliminés simplement lors d’étape de lavages avec les tampons à base d’alcool SVW1 et SVW2. Les acides nucléiques sont finalement élués dans de l’eau RNase-Free et sont directement utilisables pour les applications ultérieures. L’ARN Carrier améliore la fixation et le rendement d’extraction pour les acides nucléiques faiblement concentrés mais il n’est pas systématiquement utilisé dans tous les protocoles. 2.2 Caractéristiques du kit Le kit NucleoSpin® VET est conçu pour la préparation rapide d’acides nucléiques hautement purifiés (virus à ARN simple/double brin, virus à ADN simple/double brin et ADN bactériens) à partir d’échantillons vétérinaires comme le plasma, le sérum, les fluides biologiques acellulaires, le sang, les tissus, les écouvillons secs/humides et les fèces. • Risque de contaminations croisées réduit grâce aux colonnes individuelles fermées par un bouchon. Tous les échantillons compatibles peuvent être traités selon le même protocole standard après le prétraitement adapté. • Le kit NucleoSpin® VET permet d’extraire les acides nucléiques à partir de 200 μL de plasma / sérum, 100 µL de sang total, 5 – 10 mg de tissus, 1 écouvillon sec ou humide ou encore environ 100 mg de fèces. • Les acides nucléiques purifiés sont compatibles avec les applications de type séquençage de l’ADN par fluorescence automatisé, les RT-PCR, la PCR ou tout autre type de réactions enzymatiques. • La limite de détection pour les virus dépend de la procédure de détection utilisée, par exemple la PCR (ou RT-PCR) nichée ou la qRT-PCR. Nous recommandons fortement la mise en œuvre de contrôles internes, ainsi que des contrôles positifs et négatifs de manière à valider les procédures de purification, d’amplification et de détection. • ARN Carrier (ARN-poly(A) : sel de potassium-poly(A), préparé à partir d’ADP avec la polynucléotide phosphorylase) est inclus dans les kits pour des performances optimales. • Protéinase K Liquide est incluse dans le kit pour faciliter la lyse des protéines des échantillons. • Le procédure s’effectue par centrifugation. Uniquement pour la recherche (RUO). 6 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 ADN / ARN Viral et ADN Bactérien Tableau 1: Résumé des caractéristiques du kit Paramètre NucleoSpin® VET Technologie Technologie à membrane de silice Format Mini colonnes spin Echantillons 200 μL de sérum, plasma, liquides biologiques acellulaires, 100 µL de sang, 5 – 10 mg de tissu, écouvillon sec ou humide, ou environ 100 mg de fèces. Taille des fragments environ 100 bp – 50 kb Volume d’élution 100 μL Temps de préparation 20 – 40 min 2.3 Remarques sur la qualité et la préparation des échantillons biologiques Différents types d’échantillons vétérinaires peuvent être utilisés avec le kit NucleoSpin® VET. Pour une purification optimale, un mélange homogène, clair et non visqueux est indispensable avant de le charger sur la colonne NucleeoSpin® VET. Aussi, veillez à vérifier l’absence de précipités dans chaque échantillon (en particulier les prélèvements anciens ou congelés). Eviter de clarifier les échantillons de plasma/sérum par centrifugation ou filtration avant l’étape de lyse avec le tampon SVL, les virus associés aux particules ou agrégats pourraient être éliminés. 2.4 Remarques à propos de l’élution • Les acides nucléiques purifiés sont finalement élués en conditions de faible force ionique avec de l’H2O RNase-free. • L’élution peut être réalisée en une seule étape selon la procédure du protocole standard, induisant l’élution d’au moins 80 % des acides nucléiques fixés. Pour améliorer la sensibilité, l’éluat peut être redéposé sur la membrane, ceci permettant d’augmenter légèrement l’efficacité d’élution et la concentration des acides nucléiques récupérés. Autrement, une seconde étape d’élution peut être effectuée avec un volume supplémentaire d’eau, permettant l’élution de la quasi-totalité des acides nucléiques fixés à la membrane, mais en impactant la concentration. • Une concentration élevée en ARN/ADN est cruciale et souhaitable pour la plupart des applications avales. Ceci est particulièrement vrai si le volume total de réaction est réduit. En raison d’un volume d’élution élevé, les kits de purification ARN/ADN courants ne permettent pas d’obtenir des concentrations élevées, si l’échantillon biologique est faiblement chargé. De telles méthodes nécessitent souvent une étape de concentration supplémentaire avant les applications avales. 2.5 Remarques concernant le contrôle qualité des kits En accord avec le système de management de la qualité de MACHEREY‑NAGEL, les caractéristiques de chaque composant des kits NucleoSpin® VET sont vérifiés afin de garantir la constance des performances. MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 7 ADN / ARN Viral et ADN Bactérien 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention : les Tampons SVL et SVW1 contiennent des sels de guanidine ! Porter des gants et des lunettes de protection ! • Vérifier l’intégrité des contenants tels que les flacons ou emballages des colonnes à la réception du kit. Ne pas utiliser de composants si l’emballage est détérioré. Contacter MACHEREY‑NAGEL. • A réception, le kit NucleoSpin® VET doit être stocké à température ambiante (15 – 25 °C) et est stable jusqu’à : voir l’étiquette sur le kit. Il n’est PAS nécessaire d’ouvrir le kit à réception afin de stocker les composants séparément. • Après ouverture, il est recommandé de stocker la Protéinase K Liquide à 4 °C ou à -20 °C. • Utiliser des équipements exempts de RNases. Avant de débuter la procédure NucleoSpin® VET, préparer les réactifs suivants : • ARN Carrier (300 μg) : il est fourni sous forme lyophilisée. Dissoudre l’ARN Carrier dans de l’eau RNase-Free pour obtenir une solution de travail (100 ng/μL), voir le tableau ci-dessous. Stocker la solution obtenue à -20 °C. En raison du procédé de fabrication, l’ARN Carrier est souvent très peu visible dans le flacon. • Tampon de lavage SVW2 : ajouter le volume indiqué (sur le flacon ou dans le tableau ci-dessous) d’éthanol (96 – 100 % ; de l’éthanol non-dénaturé est recommandé) dans le flacon de Tampon de lavage SVW2 Concentré. Indiquer sur le flacon que l’éthanol a bien été ajouté. Conserver le Tampon de lavage SVW2 à température ambiante. • Protéinase K Liquide est fournie prête à l’emploi. Après ouverture, stocker le flacon de Protéinase K liquide à 4 °C ou à -20 °C. NucleoSpin® VET 10 preps 740842.10 50 preps 740842.50 250 preps 740842.250 Tampon SVW2 (Concentré) 6 mL Ajouter 24 mL d’éthanol 12 mL Ajouter 48 mL d’éthanol dans chaque bouteille 50 mL Ajouter 200 mL d’éthanol ARN Carrier 300 μg Ajouter 3 mL d’H2O RNase-free 300 μg Ajouter 3 mL d’H2O RNase-free 300 μg Ajouter 3 mL d’H2O RNase-free REF 8 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 ADN / ARN Viral et ADN Bactérien 4 Instructions de sécurité Lors de l’utilisation du kit NucleoSpin® VET, porter des vêtements de protection (ex : blouse, gants jetables, et lunettes de protection). Pour plus d’informations, consulter les Fiches de Données de Sécurité (FDS) disponibles en ligne : www.mn net.com/msds. Les tampons SVL et SVW1, les NucleoProtect® VET Blood et Swab tubes ainsi que le réactif NucleoProtect® VET contiennent un sel chaotropique (par exemple, du chlorhydrate de guanidine et/ou du thiocyanate de guanidinium) qui peut former des composés hautement réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorite de sodium) ! NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement dans les déchets de préparation des échantillons. La capacité d’inactivation du réactif NucleoProtect® VET a été démontrée pour diverses matrices et des virus connus pour avoir des structures d’enveloppe ainsi que des sensibilités aux désinfectants différentes : FMDV (petit virus non enveloppé), BTV-5 (grand virus non enveloppé), LSDV (grand virus enveloppé), PPRV et BCoV (virus enveloppé). Les échantillons doivent être incubés pendant au moins 30 minutes pour une inactivation complète. Aucune réclamation ne peut être faite concernant l’inactivation d’autres virus ou matrices de fond. L’absence de résidus de matériel infectieux dans les déchets générés lors de la procédure NucleoSpin® VET n’a pas été testée. Une contamination des déchets liquides avec du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison de la nature fortement dénaturante du tampon de lyse et du traitement à la Protéinase K, mais ne peut être totalement exclu. Aussi, traiter les déchets liquides comme potentiellement infectieux et éliminer les en accord avec les règlementations locales en vigueur. 4.1 Elimination des déchets Eliminer les substances dangereuses, infectieuses ou contaminées par du matériel biologique d’une manière sûre et en accord avec les règlementations locales en vigueur. MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 9 NucleoSpin® VET 5 Protocole pour la purification d’ARN / ADN viral et d’ADN bactérien Le protocole standard décrit la procédure pour un volume de 200 µL d’échantillon (homogénéisé). Pour la préparation à partir d’échantillons de diverses natures (ex : tissus, fèces, écouvillons), merci de consulter les chapitres 5.2 à 5.6. Après la lyse, tous les protocoles suivent les mêmes étapes (à partir de l’étape 2 : ajout de 200 µL d’éthanol pour créer les conditions de fixation des acides nucléiques). 5.1 Protocole standard pour le sérum, le plasma ou les fluides biologiques acellulaires Avant de débuter la procédure : • Pour les échantillons de plasma et de sérum congelés, nous recommandons de ne pas décongeler plus d’une fois avant utilisation. • Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a bien été préparé selon les instructions du chapitre 3. • Vérifier que l’ARN Carrier a bien été dissout dans l’eau (solution de travail). • La procédure doit être totalement réalisée à température ambiante. • Préchauffer l’H2O RNase-free (pour l’élution) à 70 °C. 1 Lyse de l’échantillon Déposer 10 µL de Protéinase K Liquide dans un tube (1.5 mL, inclus). 10 μL Protéinase K La Protéinase K peut être déposée sur les parois internes des tubes. Vérifier visuellement que la Protéinase K a bien été déposée dans le tube ! Ajouter 200 μL d’échantillon et mélanger modérément. Ajouter 200 μL de Tampon de lyse SVL dans le tube. Agiter pendant 10 min à 1,400 rpm (par exemple sur un Thermoshaker (Eppendorf)) à température ambiante. Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour collecter les gouttes présentes sur les bouchons (centrifugation courte uniquement). Ajouter 2.5 μL de solution d’ARN Carrier (100 ng/μL). Mélanger le contenu du tube en vortexant ou par pipetage. Incuber pendant 3 min à température ambiante. Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour collecter les gouttes présentes sur les bouchons (centrifugation courte uniquement). 10 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 +200 μL d’échantillon +200 μL SVL Agiter, 10 min 1,400 rpm ~ 1 s, ~ 2,000 x g +2.5 μL ARN Carrier Mélanger TA, 3 min ~ 1 s, ~ 2,000 x g NucleoSpin® VET 2 Ajuster les conditions de fixation Ajouter 200 μL d’éthanol (96 – 100 %) dans le tube et mélanger en votexant (10 – 15 s). +200 μL d’éthanol Incuber pendant 5 min à température ambiante. TA, 5 min Centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour collecter les gouttes présentes sur les bouchons (centrifugation courte uniquement). ~ 1 s, ~ 2,000 x g Ne pas centrifuger à une vitesse supérieure, à cette étape ! 3 Fixer l’ARN / l’ADN viral Déposer le lysat (610 μL) sur une colonne NucleoSpin® VET et centrifuger pendant 3 min à 4,000 x g. Si le lysat n’est pas totalement passé à travers la membrane, répéter la centrifugation à vitesse supérieure (15,000 – 20,800 x g pendant 1 min). Si le lysat n’est toujours pas passé, vérifier que l’échantillon n’a pas été utilisé en quantité excessive. Déposer l’échantillon 3 min, 4,000 x g Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un nouveau tube collecteur (2 mL, fourni) et jeter le tube collecteur contenant le filtrat issu de l’étape précédente. MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 11 NucleoSpin® VET 4 Lavage et séchage de la membrane de silice +400 μL SVW1 1er Lavage Ajouter 400 μL de Tampon de lavage SVW1 sur la colonne NucleoSpin® VET. Centrifuger 30 s à 11,000 x g. 30 s, 11,000 x g Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un nouveau tube de collection (2 mL, fourni) et jeter le filtrat issu de l’étape précédente. +400 μL SVW2 2ième lavage Ajouter 400 μL de Tampon de lavage SVW2 sur la colonne NucleoSpin® VET. 30 s, 11,000 x g Centrifuger 30 s à 11,000 x g. Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un nouveau tube de collection (2 mL, fourni) et jeter le filtrat issu de l’étape précédente. Note : veiller à éliminer les résidus de tampon de l’étape précédente avec le Tampon SVW2, en particulier si le lysat est entré en contact avec la partie supérieure de la colonne où se positionne le bouchon. Pour un lavage efficace, rincer cette partie de la colonne avec le Tampon SVW2. 3ième lavage Ajouter 200 μL de Tampon de lavage SVW2 sur la colonne NucleoSpin® VET. +200 μL SVW2 5 min, 20,000 x g Centrifuger 5 min à 20,000 x g. Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un nouveau tube de collection (2 mL, fourni) et jeter le filtrat issu de l’étape précédente. Incuber l’ensemble pendant 5 min à 56 °C avec le bouchon de la colonne ouvert. 12 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 56 °C, 5 min NucleoSpin® VET 5 Eluer l’ARN/ADN Ajouter 100 μL d’H2O RNase-free (préchauffée à 70 °C) sur la membrane de la colonne. Note : Un volume d’élution inférieur au 100 µL recommandé ou l’utilisation du tampon d’élution à température ambiante sont possible mais réduisent significativement l’efficacité de l’élution. Incuber 3 min à température ambiante. Centrifuger 3 min à 20,000 x g pour éluer les acides nucléiques de la colonne. +100 μL H2O RNasefree (70 °C) TA, 3 min 3 min, 20,000 x g Conserver l’ARN/ADN élué sur la glace ou congeler pour un stockage à long terme. MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 13 NucleoSpin® VET 5.2 Prétraitement des échantillons de sang animal Avant de débuter la procédure : Pour le sang animal, des tubes de collecte courant contenant un anticoagulant (ex : EDTA) sont recommandés. Les sangs traités à l’EDTA, au citrate ou à l’héparine sont compatibles. Les échantillons peuvent être utilisés frais ou congelés. Décongeler les sangs plus d’une fois peut impacter la qualité des extractions. Nous recommandons une prise d’essais de 100 µL pour les sangs issus d’espèces aux érythrocytes anucléés. Cependant, un nombre de cellules élevé en raison d’une réponse inflammatoire ou de pathologies néoplasiques, peut induire un contenu élevé en acides nucléiques. Dans ce cas, nous recommandons de réduire le volume d’échantillon à 50 µL. Pour les sangs contenant des érythrocytes nucléés (ex : sangs de poissons, oiseaux, reptiles), utiliser moins de 50 µL. • Vérifier la disponibilité de PBS. • Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a été préparé selon les instructions du chapitre 3. • Vérifier que l’ARN Carrier a bien été dissout dans l’eau (solution de travail). • La procédure est à effectuer à température ambiante. • Préchauffer l’H2O RNase-free (pour l’élution) à 70 °C. 1 Lyse de l’échantillon Déposer 10 µL de Protéinase K Liquide dans un tube (1.5 mL, fourni). 10 µL Protéinase K Liquide La Protéinase K peut être déposée sur les parois internes des tubes. Vérifier visuellement que la Protéinase K a bien été déposée dans le tube ! Ajouter 100 µL de sang animal et 100 µL de PBS dans le tube. Si un volume inférieur à 100 µL doit être traité, augmenter le volume de PBS pour ramener le volume de mélange sangPBS à 200 µL. Ajouter 200 μL de Tampon de lysis SVL dans le tube. Agiter le tube pendant 10 min à 1,400 rpm (par exemple sur un Thermoshaker Eppendorf) à température ambiante. Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon (centrifugation brève uniquement). Ajouter 2.5 μL de solution de travail d’ARN Carrier (100 ng/ μL) dans le tube. Mélanger le contenu du tube en vortexant ou par pipetage. Incuber pendant 3 min à température ambiante. Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon (centrifugation brève uniquement). 14 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 +100 μL de sang +100 µL PBS +200 μL SVL Agiter 10 min 1,400 rpm ~1 s ~2,000 x g +2,5 µL d’ARN Carrier Mélanger TA, 3 min ~ 1 s, ~ 2,000 x g NucleoSpin® VET Après le prétraitement de l’échantillon, continuer avec la procédure du protocole standard paragraphe 5.1 étape 2 (page 11) : Ajuster les conditions de fixation (qui correspond à l’ajout de 200 μL d’éthanol). 5.3 Prétraitement des échantillons de tissus Avant de débuter la procédure : • Note : l’importante quantité d’acides nucléiques co-purifiés (ADN/ARN des cellules hôtes) peut entraîner l’inhibition de la polymérase dans les réactions de PCR ultérieures. Dans ce cas, nous recommandons de réduire la quantité initiale de tissus à extraire. • Note : l’ajout d’ARN Carrier est déconseillé pour les échantillons de tissus, ceux-ci contenant déjà une grande quantité d’ADN. • Note : les échantillons de tissus peuvent différer grandement en terme de texture, de rigidité, de types de cellules et de contenu en acides nucléiques et en substances inhibitrices. Par ailleurs, la localisation des acides nucléiques des pathogènes peut varier selon le type de tissus, les pathogènes et de l’étape de l’infection. Ainsi, les protocoles de prétraitement proposés ci-dessous devront être validés pour chaque couple tissus / cibles pathogènes. Par exemple, pour les échantillons de rate, contenant une forte quantité d’acides nucléiques de l’hôte, l’utilisation de 5 – 10 mg de tissus est recommandée. • Vérifier la disponibilité de tampon PBS. • Vérifier la disponibilité des tubes de broyage ’MN Bead Tubes Type D’. • Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a bien été préparé selon les instructions du chapitre 3. • La procédure est effectuée à température ambiante. • Préchauffer l’H2O RNase-Free (pour l’élution) à 70 °C. 1 Lyse des tissus et des virus Transférer 5 – 10 mg de tissus (ex. : foie de volailles) dans un tube de broyage MN Bead Tube Type D (voir ’Informations de commande’). Ajouter 400 μL de PBS dans le tube et refermer. Agiter le tube dans le broyeur pour homogénéiser l’échantillon. Pour un broyeur Retsch ’mixer-mill’ une durée d’homogénéisation d’environ 30 secondes à une fréquence de 30 Hertz est recommandée. D’autre appareils de broyage sont également compatibles, mais peuvent nécessiter des réglages différents. Enlever les billes du tube (par ex., au moyen d’un aimant pour attirer les billes dans le bouchon du tube). Centrifuger le tube pendant 1 min à 2,000 x g afin d’éliminer les débris de tissus. Transférer 5 – 10 mg de tissus dans un Bead Tube +400 µL PBS Broyer Enlever les billes 1 min, 2,000 x g Note : ne pas centrifuger plus longtemps ou plus vite afin d’éviter la sédimentation des particules virales. MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 15 NucleoSpin® VET Transférer 200 μL de surnageant clarifié dans un nouveau tube. Ajouter 10 µL de Protéinase K Liquide dans le tube et mélanger modérément Transférer 200 µL de surnageant +10 μL Protéinase K La protéinase K peut être déposée sur la paroi interne du tube. Vérifier visuellement que la Protéinase K a bien été déposée dans le tube ! Ajouter 200 μL de Tampon de lyse SVL dans le tube. Agiter le tube pendant 10 min à 1,400 rpm (par ex., avec un Thermoshaker Eppendorf) à température ambiante. Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon (centrifugation brève uniquement). +200 μL SVL Agiter 10 min 1,400 rpm ~ 1 s, ~ 2,000 x g Note : l’utilisation d’ARN Carrier n’est pas recommandée, l’échantillon de tissus contenant déjà une grande quantité d’acides nucléiques. Continuer avec la procédure décrite à l’étape 2 du paragraphe 5.1 (page 11) : Ajuster les conditions de fixation (qui correspond à l’ajout de 200 μL d’éthanol). 16 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 NucleoSpin® VET 5.4 Prétraitement des écouvillons secs Avant de débuter la procédure : • Différents types d’écouvillons utilisés pour la collecte des échantillons vétérinaires sont compatibles (ex : écouvillons cloacaux). • Vérifier la disponibilité de tampon PBS. • Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a bien été préparé selon les recommandations du chapitre 3. • Vérifier que l’ARN Carrier a bien été dissout dans l’eau (solution de travail). • La procédure est effectuée à température ambiante. • Préchauffer l’H2O RNase-free (pour l’élution) à 70 °C. 1 Lyse de l’échantillon Ajouter 400 μL de PBS (Tampon phosphate salin) dans un tube 2 mL (non fourni) 400 µL PBS Note : pour les écouvillons absorbant plus qu’environ 200 µL de solution, il est recommandé d’augmenter le volume de PBS afin de récupérer un volume final de 200 µL après incubation de l’écouvillon sec et son retrait de la solution de PBS. Après prélèvement de l’échantillon sur un écouvillon sec (ex : prélèvement cloacal), insérer l’écouvillon dans le tube contenant le PBS. Incuber à température ambiante sous agitation pendant 30 minutes. Retirer l’écouvillon du tube. Centrifuger le tube pendant 1 min à 2,000 x g afin d’éliminer les débris solides. Note : ne pas centrifuger plus longtemps ou plus fort afin d’éviter la sédimentation des particules virales. Insérer l’écouvillon Incuber à TA pendant 30 min Enlever l’écouvillon 1 min 2,000 xg Transférer 200 μL de surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 10 µL de Protéinase K Liquide dans un tube et mélanger modérément. La Protéinase K peut être déposée sur la paroi interne du tube. Vérifier visuellement que la Protéinase K a bien été déposée dans le tube ! Transférer 200 µL de surnageant +10 μL Protéinase K Ajouter 200 μL de Tampon de lyse SVL dans le tube. Agiter le tube pendant 10 min à 1,400 rpm (par ex., sur un Thermoshaker Eppendorf) à température ambiante. +200 μL SVL Agiter, 10 min 1,400 rpm Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon (centrifugation brève uniquement). MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 17 NucleoSpin® VET Ajouter 2.5 μL de solution de travail d’ARN Carrier (100 ng/ μL) dans le tube. Mélanger le contenu du tube en vortexant ou par pipetage. Incuber pendant 3 min à température ambiante. Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon (centrifugation brève uniquement). ~ 1 s, ~ 2,000 x g +2.5 μL ARN Carrier Mélanger TA, 3 min ~ 1 s, ~ 2,000 x g Continuer avec l’étape 2 du paragraphe 5.1 (page 11) : Ajuster les conditions de fixation (qui correspond à l’ajout de 200 μL d’éthanol). 5.5 Prétraitement des écouvillons humides (en milieu de transport, VTM) Avant de débuter la procédure : • Note : le milieu de transport ou de stabilisation peut être de composition chimique variable selon le fabricant. La compatibilité avec le kit NucleoSpin® VET doit être vérifiée préalablement. • Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a bien été préparé selon les recommandations du chapitre 3. • Vérifier que l’ARN Carrier a bien été dissout dans l’eau (solution de travail). • La procédure est effectuée à température ambiante. • Préchauffer l’H2O RNase-free (pour l’élution) à 70 °C. 18 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 NucleoSpin® VET 1 Lyse de l’échantillon Enlever l’écouvillon du tube contenant le milieu de transport (ex. : Sigma-Virocult®). Transférer approximativement 300 – 1000 μL de milieu de transport dans un nouveau tube (non fourni). Centrifuger le tube pendant 1 min à 2,000 x g afin d’éliminer les débris solides. Enlever l’écouvillon du milieu Transférer 300 – 1000 µL de milieu 1 min 2,000 x g Note : ne pas centrifuger plus longtemps ou plus fort afin d’éviter la sédimentation des particules virales. Transférer 200 μL de surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 10 µL de Protéinase K Liquide dans un tube et mélanger modérément. Transférer 200 µL +10 μL Protéinase K La Protéinase K peut être déposée sur la paroi interne du tube. Vérifier visuellement que la Protéinase K a bien été déposée dans le tube ! Ajouter 200 μL Tampon de lyse SVL dans le tube. Agiter le tube pendant 10 min à 1,400 rpm (par exemple. sur un Thermoshaker Eppendorf) à température ambiante. Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon (centrifugation brève uniquement). Ajouter 2.5 μL de solution de travail d’ARN Carrier (100 ng/ μL) dans le tube. Mélanger le contenu du tube en vortexant ou par pipetage. Incuber pendant 3 min à température ambiante. Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon (centrifugation brève uniquement). +200 μL SVL Agiter, 10 min 1,400 rpm ~ 1 s, ~ 2,000 x g +2.5 μL ARN Carrier Mélanger TA, 3 min ~ 1 s, ~ 2,000 x g Continuer avec l’étape 2 du paragraphe 5.1 (page 11) : Ajuster les conditions de fixation (qui correspond à l’ajout de 200 μL d’éthanol). MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 19 NucleoSpin® VET 5.6 Prétraitement des Fèces Avant de débuter la procédure : • Note : les échantillons fécaux sont très variables quant à leur texture, rigidité, contenu en eau, en acides nucléiques issus des pathogènes et en substances inhibitrices. Ainsi, les performances des protocoles de prétraitement proposés ci-dessous doivent être évaluées pour chaque combinaison échantillon fécal et pathogène ciblé. Les fèces dures et/ou séchées peuvent nécessiter un broyage mécanique et/ou un volume supérieur de PBS de manière à obtenir une masse assez liquide. • Note : les fèces varient grandement en terme de contenu en inhibiteurs. Pour certains échantillons très riches en inhibiteurs, il peut s’avérer nécessaire de réduire la quantité de matériel initial. Pour les échantillons difficiles, il est recommandé de ne pas utiliser plus de 100 mg de fèces dans 1 mL de PBS. • Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a bien été préparé selon les recommandations du chapitre 3. • Vérifier que l’ARN Carrier a bien été dissout dans l’eau (solution de travail). • La procédure est effectuée à température ambiante. • Préchauffer l’H2O RNase-free (pour l’élution) à 70 °C. 20 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 NucleoSpin® VET 1 Lyse de l’échantillon Mélanger l’échantillon de fèces avec 10 volumes de PBS (10 x le volume ou 10 x la masse de fèces), par ex., mélanger 100 mg ou 100 μL de fèces avec 1 mL de PBS et mélanger vigoureusement pour resuspendre les particules et obtenir une suspension de matières fécales. Centrifuger le tube pendant 1 min à 2,000 x g afin d’éliminer les débris solides. Mélanger les fèces avec 10 vol. de PBS 1 min 2,000xg Note : ne pas centrifuger plus longtemps ou plus fort afin d’éviter la sédimentation des particules virales. Transférer 250 μL de surnageant dans un tube neuf. Note : les particules flottantes ne doivent pas être prélevées mais éliminées avec le reste des sédiments. Ajouter 250 μL de Tampon de lyse SVL dans le tube contenant le surnageant. Mélanger vortexant. vigoureusement pendant 30 secondes en Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon (centrifugation brève uniquement). Ajouter 10 μL de Protéinase K liquide. Agiter le tube pendant 10 min à 1,400 rpm (par exemple, sur un Thermoshaker Eppendorf) à température ambiante. Optionnel : Ajouter 2.5 μL de solution de travail d’ARN Carrier (100 ng/μL) dans le tube et mélanger le contenu du tube en vortexant ou par pipetage. Incuber pendant 3 min à température ambiante. Centrifuger le tube pendant 3 min à environ 15,000 x g afin d’éliminer les débris non lysés. Récupérer 400 μL de surnageant et transférer dans un nouveau tube. Note : cette étape élimine les résidus d’échantillon non lysé ; utiliser uniquement le surnageant et jeter les sédiments ! Transférer 250 µL +250 μL SVL Mélanger ~ 1 s, ~ 2,000 x g +10 µL Protéinase K Mélanger, 10 min 1,400 rpm opt. : +2.5 μL ARN Carrier Mélanger TA, 3 min ~ 3 min, ~ 15,000 x g Récupérer et continuer avec 400 µL de surnageant Continuer avec l’étape 2 du paragraphe 5.1 (page 11) : Ajuster les conditions de fixation (qui correspond à l’ajout de 200 μL d’éthanol). MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 21 NucleoSpin® VET 5.7 Prétraitement des écouvillons stabilisés dans le NucleoProtect® VET Note : L’extraction d’acides nucléiques à partir d’écouvillons non stabilisés et stabilisés avec du NucleoProtect® VET peut être réalisée en parallèle. La modification du protocole pour les écouvillons stabilisés est limitée au prétraitement de l’échantillon uniquement. Avant de débuter la procédure : • Pour le traitement des échantillons d’écouvillons stabilisés avec le NucleoProtect® VET, un tampon supplémentaire PFN est nécessaire (REF 740121.5, voir les Informations de commande). • Vérifier que le tampon de lavage SVW2 a été préparé conformément au chapitre 3. • Vérifier que l’ARN Carrier est dissous dans l’eau (solution de travail). • La procédure complète doit être effectuée à température ambiante (18 – 25 °C). • Préchauffer l’H₂O sans RNase (pour l’élution) à 70 °C. 1 Lyse de l’échantillon Vortexer le NucleoProtect® VET Swab Tube ou le tube contenant un écouvillon stabilisé dans le réactif NucleoProtect® VET pendant 30 secondes. Centrifuger brièvement le tube pendant 10 secondes à 200 x g pour éliminer les gouttes qui se retrouve dans le couvercle. Prélever 200 μL de la solution et transférer dans un tube propre (par ex. 1,5 mL). Ajouter 100 μL de tampon de lyse SVL, 100 μL d’eau, 2 μL de tampon PFN et agiter au vortex pendant 10 à 15 s. Note : le tampon SVL, l’eau et le PFN peuvent être mélangés pour obtenir un prémix. Pour 10 echantillons, mélanger 1000 µL de SVL, 1000 µL d’eau et 20 µL de PFN. Ajouter 10 μL de Protéinase K Liquide dans le tube et mélanger modérément. Mélanger le tube pendant 10 min à 1 400 rpm (p.e. en utilisant un Thermomixer Eppendorf) à température ambiante. 22 transférer 200 µL de solution dans un tube propre +100 μL SVL +100 µL eau +2 µL PFN Ajouter 2,5 μL de solution de travail d’ARN Carrier (100 ng/μL) dans le tube. +10 µL Protéinase K Liquide Mélanger le contenu du tube par vortex ou en pipettant à plusieurs reprises. opt. : +2.5 μL ARN Carrier Incuber pendant 3 minutes à température ambiante. Mélanger Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2.000 x g) pour enlever les gouttes du couvercle (centrifugation courte seulement). TA, 3 min MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 ~ 1 s, ~ 2,000 x g NucleoSpin® VET Après le prétraitement de l’échantillon, continuer avec la procédure du protocole standard au chapitre 5.1 et l’étape 2 (page 11) : Ajuster les conditions de fixation (qui consiste à ajouter de 200 μL d’éthanol). 2 5.8 Prétraitement d'échantillons de sang stabilisés dans le NucleoProtect® VET Note : L’extraction d’acides nucléiques à partir de sang non stabilisés et stabilisés avec du NucleoProtect® VET peut être réalisée en parallèle. La modification du protocole pour les échantillons de sang stabilisés est limitée au prétraitement de l’échantillon uniquement. Avant de débuter la procédure : • Pour le traitement des échantillons de sang stabilisé avec le NucleoProtect® VET, un tampon supplémentaire PFN est nécessaire (REF 740121.5, voir les Informations de commande). • Vérifier que le tampon de lavage SVW2 a été préparé conformément au chapitre 3. • Vérifier que l’ARN Carrier est dissous dans l’eau (solution de travail). • La procédure complète doit être effectuée à température ambiante (18 – 25 °C). • Préchauffer l’H2O sans RNase (pour l’élution) à 70 °C. MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 23 ADN / ARN Viral et ADN Bactérien 1 Lyse de l’échantillon Vortexer le NucleoProtect® VET Blood Tube ou le tube contenant du sang stabilisé dans le réactif NucleoProtect® VET pendant 30 secondes. Centrifuger brièvement le tube pendant 10 secondes à 200 x g pour éliminer les gouttes qui se retrouve dans le couvercle. Prélever 200 μL de la solution (contenant approximativement 57 µL de sang) et transférer dans un tube propre (p. e. 1,5 mL). Ajouter 100 μL de tampon de lyse SVL, 100 μL d’eau, 2 μL de tampon PFN et agiter au vortex pendant 10 à 15 s. transférer 200 µL de solution dans un tube propre +100 μL SVL +100 µL eau +2 µL PFN Note : le tampon SVL, l’eau et le PFN peuvent être mélangés pour obtenir un prémix. Pour 10 echantillons, mélanger 1000 µL de SVL, 1000 µL d’eau et 20 µL de PFN. Ajouter 10 μL de Protéinase K Liquide dans le tube et mélanger modérément. Mélanger le tube pendant 10 min à 1 400 rpm (p.e. en utilisant un Thermomixer Eppendorf) à température ambiante. +10 µL Protéinase K Liquide Ajouter 2,5 μL de solution de travail d’ARN Carrier (100 ng/μL) dans le tube. Mélanger le contenu du tube par vortex ou en pipettant à plusieurs reprises. opt. : +2,5 μL ARN Carrier Incuber pendant 3 minutes à température ambiante. Mélanger Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2.000 x g) pour enlever les gouttes du couvercle (centrifugation courte seulement). TA, 3 min 2 Après le prétraitement de l'échantillon, continuer avec la procédure du protocole standard au chapitre 5.1 et l'étape 2 (page 11) : Ajuster les conditions de fixation (qui consiste à ajouter de 200 μL d'éthanol). 24 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 ~ 1 s, ~ 2,000 x g ADN / ARN Viral et ADN Bactérien 6 Protocole FastTrack pour le plasma, le sérum et les solutions de lavage d’écouvillons Certains échantillons, comme le plasma, le sérum, les solutions de lavage d’écouvillons et d’autres fluides biologiques peuvent être traités selon une procédure optimisant la rapidité et la simplicité du protocole. Cette procédure est dénommée ’FastTrack’. Le rendement en acides nucléiques pourra cependant être impacté par rapport à la procédure standard. Pour des échantillons plus complexes ou riches en inhibiteurs, comme le sang, les fèces et les tissus, nous recommandons de suivre les procédures du chapitre 5. Avant de débuter la procédure : • Pour les échantillons de plasma et de sérum congelés, effectuer, si possible, un seul cycle de congélation / décongélation. • Vérifier que le Tampon de lavage SVW2 a bien été préparé selon les recommandations du chapitre 3. • Vérifier que l’ARN Carrier a bien été dissout dans l’eau (solution de travail). • La procédure est effectuée à température ambiante. • Il n’est pas nécessaire de disposer d’un bloc chauffant. Préparer le mélange de Protéinase K – ARN Carrier En fonction du nombre d’échantillons de la série à extraire, préparer un mélange de Protéinase K Liquide et de solution d’ARN Carrier selon le tableau suivant. Après préparation du mélange, conserver sur la glace et utiliser dans l’heure. Nombre de preps Volume de Protéinase K Volume d’ARN Carrier 1 10 µL 2,5 µL 2 22 µL 5,5 µL 3 33 µL 8,25 µL 4 44 µL 11 µL 5 55 µL 13,75 µL 6 66 µL 16,5 µL 7 77 µL 19,25 µL 8 88 µL 22 µL 9 99 µL 24,75 10 110 µL 27,5 µL 11 121 µL 30,25 µL 12 132 µL 33 µL MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 25 ADN / ARN Viral et ADN Bactérien 1 Lyse de l’échantillon Déposer 12.5 μL de mélange Protéinase K Liquide – ARN Carrier dans un tube (1.5 mL, fourni). Ajouter 200 μL d’échantillon dans le tube et mélanger modérément. Ajouter 200 μL de Tampon de lyse SVL dans le tube. Agiter le tube pendant 10 min à 1,400 rpm (par ex. sur un Thermoshaker Eppendorf) à température ambiante. Si nécessaire, centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon (centrifugation brève uniquement). 2 Ajuster les conditions de fixation des acides nucléiques Ajouter 200 μL d’éthanol (96 – 100 %) dans le tube et mélanger en vortexant (10 – 15 s). Incuber pendant 2 min à température ambiante. Centrifuger brièvement le tube (~ 1 s à ~ 2,000 x g) pour éliminer les gouttes du bouchon (centrifugation brève uniquement). 3 Fixation des ARN/ADN viraux Déposer le lysat (environ 610 µL) sur une colonne NucleoSpin® VET. Centrifuger 1 min à 11,000 x g. Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un nouveau tube collecteur (2 mL, fourni) et jeter le tube contenant le filtrat issu de l’étape précédente. 4 Lavage et séchage de la membrane de silice Ajouter 400 μL de Tampon de lavage SVW1 à la colonne NucleoSpin® VET. Centrifuger 1 min à 11,000 x g. Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un nouveau tube collecteur (2 mL, fourni) et jeter le tube contenant le filtrat issu de l’étape précédente. Ajouter 200 μL de Tampon de lavage SVW2 à la colonne NucleoSpin® VET. Centrifuger 1 min à 11,000 x g. Placer la colonne NucleoSpin® VET dans un tube d’élution (1.5 mL, fourni) et jeter le tube collecteur contenant le filtrat issu de l’étape précédente. 5 Elution de l’ARN/ADN Ajouter 100 μL d’H2O RNase-free sur la membrane de silice. Incuber 1 min à TA. Centrifuger 1 min à 11,000 x g. Conserver l’ARN / ADN élué sur la glace ou congeler pour le stockage. 26 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 ADN / ARN Viral et ADN Bactérien 7 Annexes 7.1 Optimisation des performances Problème Causes possibles et suggestions Problèmes avec l’ARN Carrier Rendement en acides nucléiques viraux faible ou nul • Omission de l’ARN Carrier. Acides nucléiques viraux dégradés • Les échantillons doivent être traités immédiatement. Veiller à bien conserver les échantillons avant de les traiter. • Vérifier que les tampons ont été préparés et conservés correctement. En cas de doute, utiliser un nouvel aliquot de Tampon SVL, d’ARN Carrier et d’H2O RNase-free. Sensibilité réduite • Changer le volume d’éluat ajouter dans les réactions PCR / RT-PCR. Contamination par de l’éthanol Problèmes de détection • • Problèmes généraux 7.2 Prolonger la centrifugation pour éliminer le Tampon SVW2 totalement Interférence de l’ARN Carrier avec la méthode de détection Vérifier que l’ARN Carrier est compatible avec la méthode de détection. Certaines méthodes peuvent ne tolérer qu’une quantité limitée d’ARN Carrier. Colmatage de la membrane • Centrifuger les lysats de plasma avant l’ajout d’éthanol et le dépôt sur les colonnes NucleoSpin® VET. Informations de commande Produit REF Conditionnement NucleoSpin® VET 740842.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoMag® VET 744200.1 / .4 1 × 96 / 4 × 96 Collection Tubes (2 mL) 740600 1000 MN Bead Tubes Type D 740814.50 pack of 50 Buffer PFN 740121.5 5 mL NucleoProtect® Vet stabilization and inactivation reagent 740750.50 740750.500 50 mL 500 mL NucleoProtect® VET Blood Tubes 740755 50 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 27 ADN / ARN Viral et ADN Bactérien Produit REF Conditionnement Bouchons d’étanchéité complémentaires pour NucleoProtect® VET Blood Tubes 740756 100 NucleoProtect® VET Swab Tubes 740760 50 Bouchons d’étanchéité complémentaires pour NucleoProtect® VET Swab Tubes 740761 100 Visitez notre site web www.mn‑net.com pour des informations détaillées. 7.3 Restrictions d’utilisation / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04 Veuillez contacter : MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tel. : +49 24 21 969‑333 [email protected] 28 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 02 www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 52355 Düren · Germany DE CH FR US Tel.: +49 24 21 969-0 Tel.: +41 62 388 55 00 Tel.: +33 388 68 22 68 Tel.: +1 888 321 62 24 [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] A0xxxx ">
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