MACHEREY-NAGEL Biologie Moléculaire Bioanalysis User manual Manuel d'utilisation Purification ARN/ADN Viral n NucleoMag® VET Février 2024 / Rev. 11 www.mn-net.com www.mn-net.com Contact MN Germany and international MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-0 Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only) E-mail: [email protected] Technical Support Bioanalysis Tel.: +49 24 21 969-333 E-mail: [email protected] USA MACHEREY-NAGEL Inc. 924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA Toll-free: 888 321 6224 (MACH) E-mail: [email protected] France MACHEREY-NAGEL SAS 1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France Tel.: +33 388 68 22 68 E-mail: [email protected] MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 € Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531 Switzerland MACHEREY-NAGEL AG Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland Tel.: +41 62 388 55 00 E-mail: [email protected] www.mn-net.com Purification ARN/ADN Viral Sommaire 1 Composition 4 1.1 Composants du kit 4 1.2 Matériels à fournir par l’utilisateur 5 1.3 A propos de ce manuel d’utilisation 5 2 Description 6 2.1 Principe général 6 2.2 Caractéristiques du kit 6 2.3 Systèmes de séparation magnétique 7 2.4 Réglage des paramètres d’agitation 8 2.5 Manipulation des billes 9 2.6 Procédures d’élution 9 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs 4 Instructions de sécurité 4.1 Élimination des déchets 10 11 11 5 Préparation des échantillons biologiques 12 6 Protocoles pour une utilisation manuelle ou sur un robot pipeteur 14 6.1 Purification d’ARN/ADN viral et d’ADN bactérien à partir de sang, de tissus homogénéisés, de sérum, de plasma, d’autres liquides corporels, d’écouvillons et d’écouvillons stabilisés (NucleoProtect® VET-). 14 6.2 Purification de l’ARN/ADN viral à partir d’échantillons de sang stabilisés grâce au NucleoProtect® VET 19 7 Protocoles pour les systèmes avec des barreaux magnétiques 7.1 Configuration générale des systèmes avec barreaux magnétiques 20 20 7.2 Configuration pour la purification des ARN/ADN viraux à partir d’échantillons de sang stabilisés grâce au NucleoProtect® VET 22 7.3 Protocole détaillée pour KingFisher™ Flex 8 Protocoles complémentaires 8.1 Purification du virus à ARN (PRRSV) d’échantillon de sperme porcin 9 Annexes 23 25 25 26 9.1 Guide de résolution de problèmes 26 9.2 Informations de commande 28 9.3 Restrictions d’utilisation / garantie 29 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 3 Purification ARN/ADN Viral 1 Composition 1.1 Composants du kit NucleoMag® VET 1 × 96 preps 744200.1 4 × 96 preps 744200.4 100 × 96 preps 744200.100 Billes NucleoMag® B-Beads 2 × 1.25 mL 10 mL 22 × 10 mL Tampon de Lyse VL1 30 mL 100 mL 4 × 500 mL Tampon de Fixation VEB 110 mL 3 × 110 mL 7 × 1000 mL Tampon de Lavage VEW1 75 mL 300 mL 7 × 1000 mL Tampon de Lavage VEW2 75 mL 300 mL 7 × 1000 mL Tampon d’Elution VEL 30 mL 125 mL 3 × 500 mL ARN Carrier* 400 μg 4 × 400 μg 85 × 400 μg Tampon ARN Carrier 500 μL 4 × 500 μL 3 × 15 mL Protéinase K (lyophilisée)* 75 mg 3 × 75 mg 65 × 75 mg Tampon Protéinase PB 8 mL 15 mL 18 × 15 mL Résumé du protocole 1 1 1 REF * Pour la préparation des réactifs et des conditions de stockage, voir le chapitre 3. 4 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 Purification ARN/ADN Viral 1.2 Matériels à fournir par l’utilisateur Produit REF Conditionnement Blocs pour la séparation magnétique des billes, 740481 740481.24 4 24 Ex : Blocs 96 puits carré (’Square-well Block’, 2.1 mL) Tubes de lyse pour la lyse et l’incubation des 740477 740477.24 échantillons, 4 sets 24 sets Ex : Rack de barrettes de tubes ’Tube Strips’ (1 set comprend 1 support, 12 barrettes de 8 tubes chacun (1.2 mL par puits) et 12 barrettes de bouchons) Plaque d’élution pour la collecte des acides 740486.24 nucléiques, 24 Ex : Plaque d’élution ’fond en U’ (microplaques 96 puits de 300 μL à fond rond) Ex : Plaque d’élution ’fond plat’ (microplaques 96 puits de 300 μL à fond plat) 740673 Consommables pour automate KingFisher™ 744950 Flex : 20 1 set Ex : Set d’accessoires ’96-well Accessory Kit A’ pour automate KingFisher™ (Square-well Blocks, Deep-well Tip Combs, plaques d’élution pour 4 × 96 preps NucleoMag® VET) Réactifs: • Ethanol 80 % 1.3 A propos de ce manuel d’utilisation Il est recommandé de lire attentivement les instructions de ce manuel avant d’utiliser le kit. Toute la documentation technique est également disponible sur Internet à l’adresse suivante : www.mn net.com. Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes ou mises à jour. MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 5 Purification ARN/ADN Viral 2 Description 2.1 Principe général Le kit NucleoMag® VET est conçu pour la purification d’ADN ou d’ARN viral et d’ADN bactérien à partir de fluides corporels exempts de cellules, tels que le sérum ou le plasma, d’écouvillon, de sang ou d’échantillons provenant de suspensions de tissus homogénéisés. Ce kit fournit des réactifs et des billes magnétiques pour la purification de 96 échantillons de 100 à 200 μL. La procédure est basée sur l’adsorption réversible des acides nucléiques sur les billes paramagnétiques dans des conditions tampons appropriées. La lyse des échantillons est réalisée par incubation avec un tampon de lyse VL1 contenant des ions chaotropiques, soutenu par une digestion à la Protéinase K. Pour la fixation des acides nucléiques sur les billes paramagnétiques, le tampon de fixation VEB et les billes NucleoMag® B Beads sont ajoutés au lysat. Après la séparation magnétique, les billes paramagnétiques sont lavées pour éliminer les contaminants et les sels à l’aide des tampons de lavage VEW1 et VEW2 et d’éthanol à 80 %. L’éthanol résiduel des étapes de lavage précédentes est éliminé par séchage à l’air. Enfin, l’ARN/ADN viral ultrapur est élué avec le tampon d’élution VEL à faible teneur en sel ou avec de l’eau. L’ARN / ADN viral purifié peut être directement utilisé pour des applications en aval. Le kit NucleoMag® VET peut être utilisé manuellement ou automatiquement sur des instruments de manipulation de liquide standard ou des séparateurs magnétiques automatisés. 2.2 Caractéristiques du kit Le kit NucleoMag® VET est conçu pour la préparation rapide, manuelle et automatisée à petite échelle d’ARN / ADN viral à partir de fluides corporels acellulaires comme le sérum ou le plasma, de sang, de suspensions de tissus homogénéisés ou d’échantillons tels que décrits dans le chapitre 5. Le kit est conçu pour être utilisé avec un bloc pour la séparation magnétique des billes NucleoMag® SEP (voir les informations de commande) ou d’autres systèmes de séparation magnétique (voir le paragraphe 2.3). Le temps pour la préparation manuelle de 96 échantillons est d’environ 120 minutes. L’ARN / ADN purifié peut être utilisé directement comme matrice pour la RT-PCR, la PCR ou tout autre type de réaction enzymatique. Le kit NucleoMag® VET permet une automatisation facile sur des robots pipeteurs courants ou sur des séparateurs magnétiques automatisés. Le temps de traitement réel dépend de la configuration de l’instrument et du système de séparation magnétique utilisé. Typiquement, 96 échantillons peuvent être purifiés en moins de 120 minutes en utilisant le NucleoMag® SEP installé sur un robot pipeteur. Le kit NucleoMag® VET est destiné à des professionnels tels que les techniciens et les médecins expérimentés qui sont formés aux techniques de biologie moléculaire ainsi qu’à l’utilisation d’écouvillons et d’autres échantillons vétérinaires potentiellement infectieux. Le produit est destiné uniquement à la recherche. 6 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 Purification ARN/ADN Viral 2.3 Systèmes de séparation magnétique Pour le kit NucleoMag® VET, nous recommandons l’utilisation du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Les étapes de séparation sont effectuées dans un bloc 96 puits carrés (voir ’Informations de commandes’ paragraphe 6.2). Le kit est aussi utilisable sur d’autres séparateurs magnétiques combinés aux consommables adéquats. Séparateur magnétique ® Plaque ou tubes de séparation NucleoMag SEP (MN REF 744900) Blocs à puits carré ’Square-well Block’ (MN REF 740481) Tecan Te-MagS™ Tubes de 1.5 mL sans bouchons (Sarstedt) Séparateurs à aimants fixes Les séparateurs à aimants fixes, comme le NucleoMag® SEP (utilisable manuellement ou sur automates pipeteurs), sont recommandés en association avec un agitateur pour plaques permettant une resuspension optimale des billes pendant les étapes de lavages et d’élution. Alternativement, les billes peuvent être resuspendues dans les tampons par plusieurs cycles de pipetage. Pour automatiser totalement la procédure sur un robot pipeteur, un bras manipulateur de plaques est nécessaire, afin de transférer la plaque du séparateur magnétique vers l’agitateur pour la resuspension des billes. Système à aimants mobiles Ces séparateurs disposent d’aimants se déplaçant d’un côté à l’autre des puits, entraînant les billes à travers les tampons. La séparation magnétique a lieu lors de l’arrêt du système. Séparateurs magnétiques automatisés Ces séparateurs possèdent des aimants mobiles, permettant de resuspendre les billes. Après chaque étape de fixation, de lavage ou d’élution, les billes sont collectées et transférées automatiquement dans le réactif correspondant à l’étape suivante. MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 7 Purification ARN/ADN Viral 2.4 Réglage des paramètres d’agitation Lors de l’utilisation d’un agitateur pour plaques pour les étapes de lavages et d’élution, la vitesse d’agitation doit être rigoureusement ajustée afin de permettre la resuspension optimale des billes sans risque de contaminations croisées. Procéder ainsi : Réglage de l’agitation pour les étapes de lavages : • Déposer 600 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque sur l’agitateur et démarrer l’agitation à vitesse modérée pendant 30 secondes. Stopper l’agitateur et vérifier l’absence de projections. • Augmenter la vitesse, agiter pendant 30 secondes et vérifier à nouveau l’absence de projections. • Continuer ainsi en augmentant la vitesse jusqu’à voir apparaitre des projections en haut de la plaque de séparation. Réduire la vitesse, vérifier à nouveau l’absence de projections et déterminer la vitesse idéale pour les étapes de lavage. Réglage de l’agitation pour l’étape d’élution • Déposer 100 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque d’élution et procéder comme mentionné ci-dessus. 8 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 Purification ARN/ADN Viral 2.5 Manipulation des billes Distribution des billes Une distribution homogène des billes magnétiques dans les puits de la plaque de séparation est essentielle afin de garantir la reproductibilité d’un puits à l’autre. Ainsi, avant de pipeter les billes, veiller à leur total resuspension. Secouer ou vortexer le flacon de stockage des billes. Mélanger au préalable les billes avec le tampon de fixation permet aussi une distribution plus aisée des billes dans les puits de la plaque de séparation. Lors de la procédure automatisée, une étape de mélange avant l’aspiration / distribution des billes est recommandée afin de remettre en suspension les billes. Temps de séparation magnétique L’attraction des billes magnétiques par les aimants dépend de la force de ceux-ci, de la plaque de séparation utilisée, de la distance entre la plaque et les aimants et du volume contenu dans les puits. La durée nécessaire à une séparation complète des billes par les aimants doit être vérifiée pour chaque système. Il est recommandé d’utiliser les plaques ou tubes de séparation recommandés par le fournisseur du séparateur magnétique. Lavage des billes Le lavage des billes peut s’effectuer par agitation ou pipetage des billes. Contrairement au pipetage, l’agitation permet de resuspendre les billes dans la totalité des puits simultanément. Ceci réduit le temps de la procédure et la consommation de cônes. La resuspension des billes par pipetage est cependant plus efficace que l’agitation de la plaque de séparation ou le mélange par mise en mouvement des aimants. Efficacité de resuspension Rapidité Consommation de cônes Mélange magnétique + ++ Faible Agitateur ++ ++ Faible Pipetage +++ +* Elevée Méthode 2.6 Procédures d’élution L’ARN/ADN viral purifié peut être élué directement avec le tampon d’élution VEL fourni. L’élution peut être effectuée dans un volume ≥ 50 μL. Il est essentiel de recouvrir complètement les billes NucleoMag® Beads avec le tampon d’élution pendant l’étape d’élution. Le volume de tampon d’élution distribué dépend du système de séparation magnétique (par exemple, la position du culot à l’intérieur de la plaque de séparation). Pour une élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être entièrement remis en suspension dans le tampon d’élution. Pour certains séparateurs, des volumes d’élution élevés peuvent être nécessaires pour recouvrir la totalité du culot. + : acceptable, ++ : bon, +++ : excellent, *pipette 8-canaux MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 9 Purification ARN/ADN Viral 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention: VL1, VEB, VEW1, VEW2, le tampon ARN Carrier, les tubes NucleoProtect® VET Blood / Swab ainsi que le réactif NucleoProtect® VET contiennent des sels chaotropiques (par ex. chlorhydrate de guanidine, thiocyanate de guanidine et/ou perchlorate de sodium) qui peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de Javel (hypochlorite de sodium) ! NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation d’échantillons. Porter des équipements de protection appropriés, des gants et des lunettes de protection ! • Tous les composants du kit NucleoMag® VET doivent être conservés à une température comprise entre 15 et 25 °C et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. • Tous les tampons sont livrés prêts à l’emploi. Le tampon VIA, nécessaire au traitement des échantillons de sang stabilisés par du NucleoProtect® VET, peut former des précipités pendant le stockage. Vérifier l’absence de précipités dans le tampon VIA et incuber à 25 – 30 °C pendant environ 30 minutes pour redissoudre tout précipité. Agiter doucement le flacon jusqu’à l’obtention d’une solution homogène. Avant de commencer un protocole NucleoMag® VET, préparer les réactifs suivants : • Protéinase K : Avant la première utilisation du kit, ajouter 3,35 mL de tampon protéinase PB à chaque flacon de protéinase K lyophilisée. La solution de protéinase K dissoute doit être conservée en aliquotes à -20 °C. • ARN Carrier : Avant la première utilisation du kit, ajouter 500 μL de tampon d’ARN Carrier à chaque flacon d’ARN Carrier lyophilisé. Conserver la solution d’ARN Carrier dissoute dans des aliquotes à -20 °C. Remarque : en raison de la procédure de production et de la faible quantité d’ARN Carrier contenue dans le flacon, l’ARN Carrier est difficilement visible. NucleoMag®VET REF 1 × 96 preps 744200.1 4 × 96 preps 744200.4 100 × 96 preps 744200.100 Protéinase K (lyophilisée) 1 tube (75 mg) 3 tubes (75 mg / tube) Ajouter 3.35 mL de Ajouter 3.35 mL de tampon tampon Protéinase PB Protéinase PB dans chaque tube 65 tubes (75 mg / tube) Ajouter 3.35 mL de tampon Protéinase PB dans chaque tube ARN Carrier (lyophilisée) 1 tube (400 μg) Ajouter 500 μL de tampon ARN Carrier 85 tubes (400 μg / vial) Ajouter 500 μL de tampon ARN Carrier dans chaque tube 10 4 tubes (400 μg / vial) Ajouter 500 μL de tampon ARN Carrier dans chaque tube MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 Purification ARN/ADN Viral 4 Instructions de sécurité Lors de l’utilisation du kit NucleoMag® VET, porter des équipements de protection individuelle (ex : blouse, gants jetables et lunettes de protection). Pour plus d’informations, consulter les Fiche de Données de Sécurités correspondantes (FDS disponibles en ligne : www.mn-net.com/msds). Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon de lyse VL1, le perchlorate de sodium dans les tampons VEB, VEW1, VEW2 et le thiocyanate de guanidine dans le tampon ARN Carrier, les tubes NucleoProtect® VET Blood / Swab ainsi que le réactif NucleoProtect® VET peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, il ne faut pas ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation d’échantillons. La capacité d’inactivation du réactif NucleoProtect® VET a été démontrée pour diverses matrices et virus connus pour avoir des structures d’enveloppe ainsi que des sensibilités différentes aux désinfectants : FMDV (petit virus non enveloppé), BTV-5 (grand virus non enveloppé), LSDV (grand virus enveloppé), PPRV et BCoV (virus enveloppé). Aucune revendication d’inactivation d’autres virus ou matrices ne peut être faite. Les échantillons doivent être incubés pendant au moins 30 minutes pour une inactivation complète. Les déchets générés par le kit NucleoMag® VET n’ont pas été testés pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison de la forte dénaturation du tampon de lyse et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales. 4.1 Élimination des déchets Eliminer le matériel dangereux, infectieux ou contaminé biologiquement de manière sûre et en accord avec les règlementations locales. MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 11 Purification ARN/ADN Viral 5 Préparation des échantillons biologiques a) Echantillons de sang et de sérum / plasma Un volume d’échantillon de 100 – 200 μL de sang peut être utilisé. Ne pas utiliser des volumes plus importants. Pour des échantillons avec des volumes inférieurs à 200 µL, ajuster à 200 µL avec du tampon PBS. b) Echantillons de sang stabilisés avec le réactif NucleoProtect® VET Vortexer le tube NucleoProtect® VET Blood Tube ou le tube contenant un échantillon de sang stabilisé dans le réactif NucleoProtect® VET Reagent pendant 30 secondes. Centrifuger brièvement le tube pendant 10 secondes à 200 x g pour éliminer les gouttes qui se forment à l’intérieur du bouchon. Transférer 200 µL d’échantillon de sang stabilisé. Optionnel : refermer le tube NucleoProtect® VET Blood Tube avec un bouchon de fermeture complémentaire (voir les informations de commande). c) Echantillons de tissues Homogénéiser les échantillons de tissus. Typiquement, 5 à 10 mg d’échantillon peuvent être homogénéisés dans 400 μL de tampon PBS à l’aide d’un broyeur à billes. Si nécessaire, des quantités plus importantes d’échantillons peuvent être utilisées (jusqu’à 25 mg). Il faut tenir compte du fait que l’acide nucléique total copurifié peut provoquer une inhibition dans les essais PCR ultérieurs. Après homogénéisation du tissu, centrifuger et utiliser jusqu’à 200 μL de surnageant clarifié pour le protocole de purification. Si vous utilisez moins de 200 μL, ajuster avec du tampon PBS pour obtenir un volume final de 200 μL. Pour la purification de l’ARN viral : Les échantillons de tissus peuvent également être broyés dans un tampon contenant du sel chaotropique (par exemple, le tampon RA1, voir les informations de commande) et du bêta-mercaptoéthanol ou de l’agent réducteur TCEP (voir les informations de commande). d) Écouvillons / écouvillons stabilisés avec du NucleoProtect® VET Incuber les écouvillons avec du PBS, du chlorure de sodium ou du milieu de culture cellulaire pendant 30 minutes en agitant. Retirer et presser l’écouvillon. Poursuivre la procédure de purification avec 200 μL de tampon sans particules ou du milieu. Vortexer soigneusement le tube NucleoProtect® VET Swab Tube ou le tube contenant un échantillon d’écouvillon stabilisé dans le réactif NucleoProtect® VET Reagent pendant 30 secondes. Centrifuger brièvement le tube pendant 10 secondes à 200 x g pour éliminer les gouttes qui se forment à l’intérieur du bouchon. Poursuivre la procédure avec 200 µL d’échantillon provenant de l’écouvillon stabilisé. 12 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 NucleoMag® VET e) Fèces Mélanger 1 volume de fèces (par exemple, 500 μL) avec un volume égal de tampon PBS. Mélanger vigoureusement au vortex pendant 1 minute. Laisser les particules se déposer ou centrifuger à faible vitesse (par exemple, à 500 x g). Pour les bactéries difficiles à lyser, il peut être nécessaire de procéder à un broyage mécanique (par exemple, traitement à l’aide de billes de verre appropriées). Prélever le surnageant et utiliser 200 μL pour le protocole de purification. f) Lyse au TRIzol® Pour les échantillons tels que le sperme, une lyse TRIzol® peut être nécessaire. Homogénéiser 10 – 30 mg de tissu ou jusqu’à 250 μL de sang avec 1 mL de réactif TRIzol® selon les instructions du fabricant. Après séparation des phases par centrifugation, prélever la phase (supérieure) aqueuse et incolore soit environ 400 μL. Pour la suite du traitement, commencer par l’étape 2 du protocole de purification en mélangeant 400 μL de la phase aqueuse avec 600 μL de tampon VEB et 20 μL de billes NucleoMag® B. g) Echantillons de lait Un volume d’échantillon supérieur à 200 µL est généralement utilisé. Typiquement, 1 mL d’un échantillon de lait normal est centrifugé (par exemple, 11 000 x g pendant 3 minutes). Jeter le surnageant et remettre le culot en suspension dans 400 µL de PBS. Procéder avec 200 µL d’échantillon pour le protocole de purification. Les échantillons de lait fermenté (acidulé) nécessitent une étape de prétraitement supplémentaire. Par conséquent, incuber les particules / les morceaux de lait acidulé dans une quantité appropriée de tampon de lyse pendant 1 à 3 heures à 56 °C (idéalement en agitant). Culoter les particules résiduelles et procéder avec 400 µL du lysat à l’étape 2 du protocole de purification. MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 13 NucleoMag® VET 6 Protocoles pour une utilisation manuelle ou sur un robot pipeteur 6.1 Purification d’ARN/ADN viral et d’ADN bactérien à partir de sang, de tissus homogénéisés, de sérum, de plasma, d’autres liquides corporels, d’écouvillons et d’écouvillons stabilisés (NucleoProtect® VET-). Préparation des échantillons Le protocole standard se rapporte à un volume de 200 μL d’échantillon (homogénéisé). Pour la préparation de différents échantillons (par exemple, tissus, écouvillons, fèces), consulter les indications du Chapitre 5. Résumé du protocole • Pour les exigences en matière de matériel, voir le paragraphe 2.3. • Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir la page 16. • Avant de commencer la préparation : • Vérifier que la protéinase K et l’ARN Carrier ont été préparés conformément au Chapitre 3. 1 Lyse de l’échantillon 200 μL échantillon (homogénéisé) 20 μL Protéinase K 4 μL ARN Carrier 180 μL VL1 Mélanger TA, 15 min 2 Fixation des acides nucléiques aux billes NucleoMag® B-Beads 20 μL de B-Beads 600 μL VEB Mélanger par agitation pendant 5 – 10 min à TA (Optionnel: Mélanger par pipetage répété) Eliminer le surnageant après 2 min de séparation 14 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 NucleoMag® VET 3 Lavage avec VEW1 Enlever le bloc 96 puits carrés du NucleoMag® SEP 600 μL VEW1 Resuspendre : Agiter 1 min à TA Eliminer le surnageant après 2 min de séparation 4 Lavage avec VEW2 Enlever le bloc 96 puits carrés du NucleoMag® SEP 600 μL VEW2 Resuspendre : Agiter 1 min à TA Eliminer le surnageant après 2 min de séparation 5 Lavage avec de l’éthanol 80 % Enlever le bloc 96 puits carrés du NucleoMag® SEP 600 μL d’éthanol 80 % Resuspendre : Agiter 1 min à TA Eliminer le surnageant après 2 min de séparation 6 Séchage à l’air des billes magnétiques 7 Elution des ADN / ARN Sécher à l’air 10 min à TA Enlever le bloc 96 puits carrés du NucleoMag® SEP 50‑100 μL VEL Mélanger par agitation pendant 5 min à TA (Optionnel: Mélanger par pipetage) Séparer 2 min et transférer l’ARN / ADN dans la plaque d’élution / les tubes MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 15 NucleoMag® VET Protocole détaillé Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants fixes (par exemple, NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques appropriés. Il est recommandé d’utiliser un bloc 96 puits carrés pour la séparation (voir les informations de commande, chapitre 6.2). La purification de l’ARN / ADN peut également être effectué dans des microtubes avec des séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de guide pour l’adaptation du kit sur des systèmes automatisés. 1 Lyse de l’échantillon Distribuer au préalable 20 μL de protéinase K et 200 μL d’échantillon dans un microtube approprié. Ajouter 180 μL de tampon VL1 au microtube. Optionnel : ajouter 4 μL de la solution mère d’ARN Carrier au microtube. Bien mélanger par pipetage répété et incuber à température ambiante pendant 15 min en agitant. Alternativement, l’étape de lyse peut être réalisée dans des barrettes de tubes (voir les informations de commande). Après l’incubation de la lyse, centrifuger pour collecter tout échantillon des couvercles des tubes de lyse et transférer chaque lysat dans les puits d’un bloc 96 puits carrés. 2 Fixation de l’acide nucléique sur les billes magnétiques Ajouter 20 μL de billes B-Beads remises en suspension et 600 μL de tampon VEB à l’échantillon lysé. Mélanger par pipetage répété 6 fois et agiter pendant 5 min à température ambiante. Alternativement, lors du traitement du kit sans agitateur, mélanger par pipetage répété 10 fois et incuber pendant 5 min à température ambiante. Les billes NucleoMag® B-Beads et le tampon VEB peuvent être mélangés au préalable. Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les retirer du flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une suspension homogène soit formée. Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le bloc 96 puits carrés sur le séparateur magnétique, NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 minutes jusqu’à ce que toutes les billes soient attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Ne pas perturber les billes sur les aimants lors de l’aspiration du surnageant. 16 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 NucleoMag® VET 3 Lavage avec le tampon VEW1 Enlever le bloc 96 puits carrés du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 600 μL de tampon VEW1 et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (1 – 3 min). Alternativement, remettre complètement en suspension les billes par pipetage répété. Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc 96 puits carrés sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 minutes jusqu’à ce que toutes les billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 4 Lavage avec le tampon VEW2 Enlever le bloc 96 puits carrés du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 600 μL de tampon VEW2 et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (1 – 3 min). Alternativement, remettre complètement en suspension les billes par pipetage répété. Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc 96 puits carrés sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 minutes jusqu’à ce que toutes les billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 5 Lavage avec l’éthanol 80 % Enlever le bloc 96 puits carrés du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 600 μL d’éthanol à 80 % et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (1 – 3 min). Alternativement, remettre en suspension les billes complètement par pipetage répété. Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc 96 puits carrés sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 minutes jusqu’à ce que toutes les billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 6 Séchage à l’air des billes magnétiques Sécher à l’air le culot de billes magnétiques pendant 10 minutes à température ambiante. MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 17 NucleoMag® VET 7 Élution de l’ARN/ADN Retirer le bloc 96 puits carrés du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter le volume souhaité de tampon VEL (50 – 100 μL) dans chaque puits du bloc 96 puits carrés et remettre les billes en suspension en agitant pendant 5 min à température ambiante. Alternativement, remettre les billes complètement en suspension par pipetage répété et incuber pendant 5 min à 56 °C. Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc 96 puits carrés sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes soient attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant les acides nucléiques purifiés dans des plaques d’élution ou des barrettes de tubes (voir les informations de commande). 18 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 NucleoMag® VET 6.2 Purification de l’ARN/ADN viral à partir d’échantillons de sang stabilisés grâce au NucleoProtect® VET Protocole pour la purification de l’ARN et de l’ADN viral à partir de tubes NucleoProtect® VET Blood Tube ou d’échantillons de sang stabilisés dans le réactif NucleoProtect® VET Reagent. Pour la préparation des échantillons de sang stabilisés, voir le chapitre 5. Note : Les purifications d’acide nucléique à partir d’échantillons de sang stabilisés et non stabilisés par du NucleoProtect® VET peuvent être effectuées en parallèle. La modification du protocole pour les échantillons de sang stabilisé se limite à la lyse de l’échantillon et à l’ajustement des conditions de fixation. Résumé du protocole Pour les exigences en terme de matériel, voir le chapitre 2.3. Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 16. Avant de commencer la préparation : Pour le traitement des échantillons de sang stabilisés par NucleoProtect® VET, un tampon VIA supplémentaire est nécessaire (REF 744206, voir les informations de commande). Vérifier l’absence de précipités dans le tampon VIA, voir chapitre 3. 1 Lyse de l’échantillon 200 μL de sang stabilisé 350 µL VIA 20 μL Protéinase K Mélanger TA, 15 min 2 Fixation des acides nucléiques aux billes NucleoMag® B-Beads 20 μL B-Beads 450 μL VEB Mélanger par agitation pendant 5 – 10 min à TA ( optionnel : Mélanger par pipetage répété) Eliminer le surnageant après 2 min de séparation 3 Lavage avec VEW1 Procéder à l’étape 3 du protocole standard du chapitre 6.1 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 19 Purification ARN/ADN Viral 7 Protocoles pour les systèmes avec des barreaux magnétiques Ces protocoles sont conçus pour l’utilisation du kit NucleoMag® VET sur des systèmes de barreaux magnétiques (par exemple, les systèmes KingFisher™, MagnetaPure 32 / 32 Plus ou d’autres instruments avec des barreaux magnétiques). Pour des informations détaillées concernant chaque étape, voir la page 16. Contacter notre support technique Bioanalyse (tech-bio@mn net.com) pour obtenir des fichiers de méthodes ou des informations plus détaillées sur des plateformes d’automatisation spécifiques. 7.1 Configuration générale des systèmes avec barreaux magnétiques Cette synthèse sert de guide pour la configuration générale des plaques, des colonnes ou des réservoirs de réactifs de l’instrument respectif pour le kit NucleoMag® VET. Selon l’instrument, la lyse de l’échantillon peut être effectuée sur l’instrument ou à l’extérieur. Les positions peuvent représenter différents formats définis par le protocole et l’instrument (par exemple, des plaques complètes (dispositifs au format 96 puits), des rangées individuelles (format de 12 puits), des colonnes individuelles (format de 8 puits), des puits individuels ou systèmes basés sur des cartouches). Lyse externe - la lyse n’est pas effectuée sur l’instrument lui-même (pour les échantillons qui nécessitent une manipulation avancée ou une clarification par centrifugation) Position Etape Tampon Volume 1 Lyse / Fixation Lysat* 404 µL B-Beads 20 µL VEB 575 µL 2 Lavage 1 VEW1 600 µL 3 Lavage 2 VEW2 600 µL 4 Lavage 3 Ethanol 80 % 600 µL 5 Elution VEL 100 µL * Comprend 200 µL d’échantillon, 180 µL de tampon VL1, 20 µL de protéinase K et 4 µL d’ARN Carrier. 20 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 Purification ARN/ADN Viral Lyse On-deck (sur le robot) - la lyse est effectuée sur l’instrument ; pour les échantillons liquides ou entièrement homogénéisés. Position Etape Tampon Volume 1 Lyse Echantillon 200 µL Protéinase K 20 µL VL1 180 µL ARN Carrier 4 µL Fixation B-Beads 20 µL [à ajouter après la lyse] VEB 575 µL 2 Lavage 1 VEW1 600 µL 3 Lavage 2 VEW2 600 µL 4 Lavage 3 Ethanol 80 % 600 µL 5 Elution VEL 100 µL MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 21 Purification ARN/ADN Viral 7.2 Configuration pour la purification des ARN/ADN viraux à partir d’échantillons de sang stabilisés grâce au NucleoProtect® VET Purification des ARN/ADN viraux à partir de tubes de sang NucleoProtect® VET Blood Tubes ou de sang stabilisé avec le NucleoProtect® VET Reagent. Note : la purification d’acide nucléique à partir d’échantillons de sang stabilisés et d’autres échantillons peut être effectuée au cours du même cycle d’extraction. La modification du protocole pour les échantillons de sang stabilisé se limite à la lyse de l’échantillon et à l’ajustement des conditions de fixation. Avant de commencer la préparation : • Vérifier que la protéinase K a été préparée conformément au chapitre 3. Pour le traitement des échantillons de sang stabilisé avec le NucleoProtect® VET, un tampon VIA supplémentaire est nécessaire (REF 744206, voir les informations de commande au chapitre 9.2). Vérifier l’absence de précipités dans le tampon VIA, voir chapitre 3. Lyse On-deck (sur le robot) - la lyse est effectuée sur l’instrument ; pour les échantillons liquides ou entièrement homogénéisés. Position Etape Tampon Volume 1 Lyse Echantillon 200 µL VIA 330 µL Protéinase K 20 µL Fixation B-Beads 20 µL [Ajout après la lyse] VEB 425 µL 2 Lavage 1 VEW1 600 µL 3 Lavage 2 VEW2 600 µL 4 Lavage 3 Ethanol 80 % 600 µL 5 Elution VEL 100 µL 22 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 Purification ARN/ADN Viral 7.3 Protocole détaillée pour KingFisher™ Flex Note : Le fichier de méthode requis ’NucleoMag®_VET_lyse_Flex’ ou d’autres fichiers de méthode pour l’instrument sont disponibles auprès du support technique Bioanalysis (tech-bio@mn net.com). Important : Toujours préparer le bloc 96 puits profonds avec les échantillons en premier et ajouter les réactifs exactement dans l’ordre indiqué ci-dessous. • Avant de commencer la préparation : • Vérifier que la protéinase K et l’ARN Carrier ont été préparés conformément au chapitre 3. • Kit d’accessoires A Blocs 96 puits pour KingFisher™ (voir les informations de commande) 1 Préparation de l’échantillon / plaque de lyse (partie I) Distribuer 20 μL de solution de protéinase K dans chaque puits du bloc 96 puits profonds. Ajouter 200 μL d’échantillon de sang / échantillon de tissu homogénéisé à chaque puits du bloc 96 puits profonds, mélanger par pipetage répété. Ajouter 180 μL de tampon VL1 et mélanger par pipetage répété 3 fois. Optionnel : Agiter à 1 000 rpm pendant 15 min à température ambiante. Poursuivre par la préparation des plaques de lavage et d’élution avant d’ajouter les billes magnétiques et le tampon de fixation à la plaque d’échantillons. 2 Préparation des plaques de lavage et d’élution Plaques de lavage : Remplir 600 μL de tampon VEW1 dans chaque puits d’une plaque 96 Deep well Thermo vide. Remplir 600 μL de tampon VEW2 dans chaque puits d’une plaque 96 Deep well Thermo vide. Remplir 600 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits d’une plaque 96 Deep well Thermo vide. Plaque d’élution : Remplir 100 μL de tampon VEL dans chaque puits d’une plaque 96 200 µL-well Thermo vide. 3 Préparation de l’échantillon / de la plaque de lyse (partie II) Ajouter 20 μL de B-Beads et 575 µL de tampon VEB dans chaque puits de la plaque d’échantillon / de lyse. MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 23 Purification ARN/ADN Viral 4 Exécuter le protocole de purification sur l’instrument Démarrer la purification des acides nucléiques sur l’instrument KingFisher™ Flex. Démarrer le fichier de méthode ’NucleoMag® VET’. Insérer les plaques comme indiqué sur l’écran de l’instrument KingFisher™. La méthode commence par une étape de mélange (étape combinée de lyse et de fixation) après la mise en place de la dernière plaque sur l’instrument. 5 Retirer les acides nucléiques élués L’instrument s’arrête après l’étape d’élution finale. Suivre les instructions sur l’écran de l’instrument et sortir les plaques de l’instrument. L’ARN / ADN purifié peut être utilisé pour d’autres analyses comme la PCR. 24 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 Purification ARN/ADN Viral 8 Protocoles complémentaires 8.1 Purification du virus à ARN (PRRSV) d’échantillon de sperme porcin Avant de commencer la préparation : • 1 Le tampon de lyse RA1 additionnel est nécessaire (voir information de commande 9.2). Précipitation Centrifuger 1 mL d’échantillon de sperme pendant 4 min à 12.000 x g. Jeter le surnageant après centrifugation. 2 Lyse de l’échantillon Ajouter 400 µL de tampon de Lyse RA1 et mélanger en pipetant. Incuber pendant 10 min à 70° C. 3 Clarifier le lysat Centrifuger l’échantillon lysé pendant 1 min. à 15.000 x g Utiliser 400 μL du lysat clarifié et passer à l’étape 2 du protocole standard, voir chapitre 6.2. MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 25 Purification ARN/ADN Viral 9 Annexes 9.1 Guide de résolution de problèmes Problèmes Causes possible et suggestions Volume de tampon d’élution insuffisant • Les billes doivent être recouvertes totalement par le tampon. Performance insuffisante du tampon d’élution • Faible rendement Eliminer complètement les tampons résiduels à chaque étape de séparation. Les tampons résiduels restant diminuent l’efficacité des lavages et de l’élution. Billes séchées excessivement • Ne pas trop sécher les billes, l’élution en serait impactée. Aspiration des billes sur l’aimant • Ne pas perturber les billes sur l’aimant en aspirant les surnageants, en particulier lorsque les billes magnétiques sur l’aimant ne sont pas visibles dans le lysat. • Temps de séparation magnétique trop court ou vitesse d’aspiration trop élevée. Procédure de lavage insuffisante Pureté insuffisante • Utiliser des plaques prévues pour le séparateur magnétique, par exemple les blocs 96 puits carrés ’Square-well Block’ avec le NucleoMag® SEP. • Resuspendre totalement les billes pendant les lavages. Pipeter plusieurs fois si l’agitation est insuffisante. Contamination par de l’éthanol des tampons de lavage • Mauvaise performance de l’ADN lors des applications avales 26 Veiller à éliminer l’éthanol 80 % provenant des étapes de lavage, l’éthanol résiduel impactant négativement les applications avales. Évaporation de l’éthanol des tampons de lavage • Fermer hermétiquement les flacons de tampons, éviter l’évaporation de l’éthanol des flacons de tampons ainsi que des tampons remplis dans les réservoirs. Ne pas réutiliser les tampons des réservoirs de tampons. MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 Purification ARN/ADN Viral Problèmes Causes possible et suggestions Temps de séparation magnétique trop court • Perte de billes Augmenter la durée de la séparation magnétique pour permettre aux billes d’être attirées par les aimants avant d’aspirer les liquides. Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution) • Une vitesse d’aspiration trop élevée au cours de l’étape d’élution peut entraîner l’aspiration de billes. Réduire la vitesse d’aspiration. MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 27 Purification ARN/ADN Viral 9.2 Informations de commande Produit REF Conditionnement NucleoMag VET 744200.1 744200.4 744200.100 1 × 96 preps 4 × 96 preps 100 × 96 preps NucleoProtect® VET stabilization and inactivation reagent 740750.50 740750.500 50 mL 500 mL NucleoProtect® VET Blood Tubes 740755 50 Bouchons complémentaires pour les NucleoProtect® VET Blood Tubes 740756 100 Tampon VIA 744206 150 mL ® NucleoMag SEP 744900 1 Bloc 96 puits carrés ’Square-well Blocks’ 740481 740481.24 4 24 Films adhésifs en PE 740676 50 sheets Rack de barrettes de tubes ’Tube Strips’ (set comprenant 1 support, 12 barrettes de 8 tubes chacun et 12 barrettes de bouchons) 740477 740477.24 4 sets 24 sets Plaque d’élution fond en ’U’ 740486.24 24 Kit accessoires A 96 puits pour KingFisher™ (le set comprend 16 blocs 96 puits carrés ’Square-well Blocks’, 4 Tip Combs pour Deepwell et 4 plaques d’élution pour 96 preps NucleoMag® VET pour utilisation avec la plateforme KingFisher™ Flex) 744950 1 set Tampon RA1 (60 mL) 740961 60 mL Agent réducteur TCEP 740395.107 107 mg NucleoSpin® VET 740842.10 740842.50 740842.250 1 × 10 preps 1 × 50 preps 1 × 250 preps ® Visitez notre site web www.mn‑net.com pour des informations détaillées. 28 MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 11 9.3 Restrictions d’utilisation / garantie Tous les produits MACHEREY NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit. Ce produit MACHEREY NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY NAGEL. Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un représentant dûment habilité de MACHEREY NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de MACHEREY NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société. MACHEREY NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la documentation MACHEREY NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04 Veuillez contacter : MACHEREY NAGEL GmbH & Co. KG Tel. : +49 24 21 969 333 [email protected] Marques déposées KingFisher est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific. NucleoMag®, NucleoSpin® et NucleoProtect® sont des marques déposées de MACHEREY NAGEL GmbH & Co KG. Te-MagS est une marque déposée de Tecan Group Ltd, Suisse TRIzol est une marque déposée de Molecular Research Center, Inc. Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur fonctionnement. Plasmid DNA Clean up RNA DNA Viral RNA and DNA Protein High throughput Accessories Auxiliary tools www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 [email protected] CH +41 62 388 55 00 [email protected] FR +33 388 68 22 68 [email protected] US +1 888 321 62 24 [email protected] ">
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