VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Guide d’interprétation pour le carcinome du poumon non à petites cellules (NSCLC) Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC i ii Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Table des matières Introduction1 Utilisation prévue Utilisation prévue du produit Objectif du guide d’interprétation 4 4 4 Évaluation clinique Déroulement du traitement des échantillons Contrôle au niveau du système Arbre décisionnel 6 8 9 11 Cas négatifs 14 Cas positifs 18 Cas difficiles et artéfacts connus de la coloration Cas difficiles : coloration de fond non spécifique Cas difficiles : coloration de fond non spécifique Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans des macrophages alvéolaires Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans des cellules lymphoréticulaires disséminées dans les infiltrats lymphocytaires Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans un épithélium glandulaire bénin Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans des cellules ganglionnaires Cas difficiles : forte coloration ALK des membranes granulaires Cas difficiles : coloration de la mucine Cas difficiles : piégeage DAB Reproductibilité du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 28 29 30 31 Conditions préanalytiques et leur répercussion sur la coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Exemples de fixateurs (Xénogreffes) Répercussion des conditions préanalytiques sur la coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Comparaison des marqueurs pulmonaires IHC fixés avec du NBF à 10 % Stabilité des lames 32 33 34 35 36 37 37 40 40 41 42 43 Références46 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC iii iv Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Introduction La protéine ALK (kinase du lymphome anaplasique) fait partie de la superfamille des récepteurs à l'insuline de type tyrosine kinase.1 L'ALK est une glycoprotéine membranaire de type I qui n’est normalement exprimée que dans le système nerveux. 2 Située sur le chromosome 2p23, elle se compose de deux grands introns et de 26 exons.1 La pathogénicité moléculaire de l'ALK débute par des réarrangements chromosomiques faisant s'associer les séquences codantes en 3’ pour le domaine de signalisation intracellulaire avec les éléments du promoteur en 5’ et les séquences codantes d'autres gènes. Une inversion au sein du chromosome 2p conduisant à la formation d’un gène de fusion comprenant des portions du gène de la protéine associée au microtubule d’échinoderne de type 4 (EML4) et du gène ALK a été découverte en 2007 dans des lignées cellulaires du carcinome du poumon non à petites cellules (NSCLC) et dans des échantillons cliniques archivés.3 Des études ont révélé que les événements de l’inversion EML4-ALK comprenaient au moins neuf variantes de fusion, chacune d’elles étant composée de la même portion du domaine kinase C terminal de l’ALK, ce qui leur confère une activité catalytique.4-8 Il est donc cohérent que l’expression de l’EML4-ALK dans les cellules épithéliales alvéolaires pulmonaires de souris transgéniques soit un facteur oncogène puissant.9 La fusion confère à l’ALK une coloration cytoplasmique. Ventana a développé le test VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC), qui peut être utilisé avec le kit de détection OptiView DAB IHC Detection Kit et le kit d’amplification OptiView Amplification Kit, comme un test d’immunohistochimie (IHC) entièrement automatisé sur les automates de coloration par immunohistochimie BenchMark Series. La sensibilité du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC offre un système d’évaluation binaire reproductible (statut positif ou négatif de l’ALK) pour évaluer les résultats de la coloration (consulter la notice du test VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit Monoclonal Primary Antibody, réf. 790-4794 / 06679072001). Pour développer le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC, Ventana a utilisé toute une gamme d’échantillons de tissu de NSCLC humains prélevés sur des tumeurs primitives et métastatiques, notamment des tissus de résection, de biopsie par aspiration, de biopsie bronchique et de blocs cellulaires fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) obtenus par aspiration à l’aiguille fine. L’ALK est désormais reconnue comme une voie de signalisation oncogène clé du NSCLC et, bien que l’EML4 soit le partenaire de fusion prédominant, d’autres gènes partenaires de fusion ont été identifiés.10,11,12,13,14 L’incidence des réarrangements du gène ALK semble être comprise entre 2 et 7 %, avec pour résultat environ 6 000 patients positifs à l’ALK/an aux États-Unis et 40 000 patients/an dans le monde.3-8 Cependant, cette estimation présente des limites, notamment un ensemble limité de données (1 500 échantillons tumoraux) et des méthodologies de recherche de la protéine ALK différentes selon les études. La grande majorité des réarrangements du gène ALK a notamment été observée dans des échantillons d’adénocarcinome pulmonaire plutôt que dans des échantillons présentant des histologies épidermoïdes et à petites cellules. 3-8 Des preuves montrent également que les réarrangements du gène ALK affectent les patients n’ayant « jamais ou peu fumé », bien que cela puisse ne pas être un cofacteur statistiquement significatif. 3,4,7,9 Il est important de noter que les réarrangements du gène ALK coïncident rarement avec des mutations d’EGFR, de HER2 ou de KRAS, ce qui démontre que la positivité à l’ALK constitue un sous-type pathologique distinct.9 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 1 2 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Utilisation prévue Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 3 Utilisation prévue Utilisation prévue du produit L’anticorps VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit Monoclonal Primary Antibody est destiné à une utilisation en laboratoire pour la détection de la protéine kinase du lymphome anaplasique (ALK) dans des tissus de carcinome du poumon non à petites cellules (NSCLC) fixés au formol et inclus en paraffine colorés sur des automates de coloration par immunohistochimie BenchMark Series. Il est indiqué pour faciliter l’identification des patients pouvant bénéficier d’un traitement par XALKORI® (crizotinib), ZYKADIA® (ceritinib), ou ALECENSA® (alectinib). L’interprétation clinique de toute coloration ou absence de coloration doit être complétée par des études histologiques et l’analyse de contrôles adéquats. L’évaluation doit être menée par un anatomopathologiste qualifié en tenant compte des antécédents cliniques du patient et d’autres tests diagnostiques. Ce produit est destiné à la réalisation de diagnostics in vitro (DIV). Objectif du guide d’interprétation Le présent guide est destiné aux fins suivantes : • Fournir aux anatomopathologistes un outil facilitant l’évaluation clinique de coupes de tissus NSCLC fixées au formol et incluses en paraffine (FFPE) colorées avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC conformément à l’étiquetage proposé du produit. • Fournir des clichés photographiques qui illustrent les profils de coloration pouvant résulter de la coloration des tissus NSCLC avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC. • Fournir des exemples d’image illustrant les cas difficiles afin de faciliter leur évaluation. • Fournir une orientation lors de l’utilisation d’un tissu de contrôle positif à l’ALK (par exemple, appendice) qui sert de tissu de contrôle quand il est coloré avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC. 4 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Évaluation clinique Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 5 Évaluation clinique Évaluation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC pour le NSCLC Pour le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC, chaque cas est coloré avec l’anticorps VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit Monoclonal Primary Antibody et un anticorps Rabbit Monoclonal Negative Control Ig associé. Les cellules néoplasiques marquées avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC sont évaluées afin de détecter la présence ou l’absence du signal DAB. La lame de contrôle négatif associée est utilisée pour évaluer la coloration de fond non spécifique et le degré de coloration de fond dus à des éléments tissulaires spécifiques (consulter les images de cas positifs et négatifs ci-dessous). Remarque : tous les cas doivent être colorés avec le kit de détection OptiView DAB IHC Detection Kit et avec le kit d’amplification OptiView Amplification Kit, car certains cas sont faiblement positifs pour l’ALK par détection DAB uniquement. L’algorithme d’évaluation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC est indiqué dans le Tableau 1 ci-après. Des cas représentatifs sont présentés dans les illustrations. Tableau 1 : Critères d’évaluation de la détermination du statut de l’ALK dans le NSCLC. Interprétation clinique Description de la coloration Positif pour ALK Présence d’une forte coloration cytoplasmique granulaire dans les cellules tumorales (tout pourcentage de cellules tumorales positives). Certains éléments de coloration doivent être exclus, notamment : • taches cytoplasmiques claires dans les macrophages alvéolaires ; • cellules d’origine neurale (nerfs et cellules ganglionnaires) ; • coloration épithéliale glandulaire et • cellules lymphoréticulaires disséminées dans les infiltrats lymphocytaires. Une certaine coloration de fond peut également être observée dans la muqueuse saine en présence d’un NSCLC (notamment mucine) ainsi que dans les zones de nécrose tumorale, qui doivent également être exclues de l’évaluation clinique. Négatif pour ALK 6 Absence d’une forte coloration cytoplasmique granulaire dans les cellules tumorales. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC DIAGNOSTIC CLINIQUE : NÉGATIF Aucune coloration Taches légères dans les cellules tumorales Coloration granulaire diffuse non spécifique DIAGNOSTIC CLINIQUE : POSITIF Quelques cellules tumorales présentant une forte coloration cytoplasmique Cellules tumorales présentant une forte coloration cytoplasmique Forte coloration cytoplasmique homogène dans les cellules tumorales La coloration nécessite trois coupes de chaque cas, une coupe de tissu en série pour H&E (hématoxyline et éosine), une deuxième coupe de tissu en série pour la coloration avec l’anticorps isotype de contrôle monoclonal négatif de lapin et une troisième coupe de tissu en série pour la coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC. Si l’évaluation H&E indique que l’échantillon de patient n’est pas adéquat, un nouvel échantillon doit alors être prélevé et coloré avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC. Les tissus de NSCLC préqualifiés positifs et négatifs pour l’ALK selon l’algorithme d’évaluation indiqué au Tableau 1 peuvent être utilisés comme des contrôles au niveau du système. Par ailleurs, les tissus d’appendice préqualifiés présentant une forte coloration ALK des cellules ganglionnaires et l’absence d’une forte coloration granulaire dans les cellules lymphoïdes, du plexus myentérique et glandulaires de l’appendice peuvent également être utilisés comme des contrôles au niveau du système. Les éléments positifs et négatifs doivent être colorés de manière appropriée, comme défini par l’algorithme d’évaluation du NSCLC (Tableau 1) ou par les critères d’acceptation pour l’appendice (Tableau 2) sur chaque série pour que la série puisse être considérée comme étant valide. Les lames d’échantillon colorées par ALK doivent être évaluées par un anatomopathologiste confirmé. Si la lame de contrôle des tissus colorés par ALK n’est pas acceptable, la coloration des échantillons de patient doit être répétée. Si une lame colorée par l’anticorps du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC n’est pas évaluable, cela indique que la réactivité n’a pas pu être déterminée en raison d’une nécrose, de l’absence de tissus ou d’artéfacts. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 7 Déroulement du traitement des échantillons Un prélèvement de tissu de NSCLC est prélevé chez le patient, fixé au formol neutre tamponné à 10 % pendant 6-72 heures conformément aux procédures de laboratoire standard et inclus en paraffine. Des coupes d'environ 4-5 μm d'épaisseur sont déposées sur des lames de verre pour microscope chargées positivement. La lame H&E est-elle acceptable ? Non Une coupe est colorée avec l’H&E. Oui Une coupe est colorée avec l’anticorps du test VENTANA antiALK (D5F3) IHC. Une autre coupe est colorée avec un anticorps de contrôle négatif au cours du même cycle de coloration. Les tissus de contrôle préqualifiés (appendice, par exemple) doivent être colorés au cours du même cycle que les lames contenant l'échantillon de patient pour servir de contrôle au niveau du système. Répéter la coloration avec un nouvel échantillon de patient. Répéter le cycle de coloration. Non La lame de contrôle au niveau du système (appendice, par exemple) est-elle acceptable ? Oui Répéter le cas de coloration. Non La lame de l’échantillon coloré avec l’anticorps de contrôle négatif est-elle acceptable ? Oui Répéter le cas de coloration. Non La lame de l’échantillon coloré avec l’anticorps du test VENTANA antiALK (D5F3) IHC est-elle acceptable ? Oui Les résultats ALK sont interprétés par un anatomopathologiste confirmé conformément à l’algorithme d’évaluation clinique pour NSCLC du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC. 8 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Contrôle au niveau du système Il est recommandé d’utiliser les tissus d’appendice comportant des éléments de coloration positifs et négatifs ou NSCLC positifs ALK et négatifs ALK comme des tissus de contrôle au niveau du système. Les cellules ganglionnaires de l’appendice présentent une forte coloration granulaire cytoplasmique pour l’ALK. En outre, une forte coloration granulaire cytoplasmique a également été observée dans les nerfs des couches musculaires de l’appendice. Absence d’une forte coloration granulaire cytoplasmique dans les tissus des cellules épithéliales glandulaires, musculaires et lymphoïdes (une coloration rare ou éparse des cellules lymphoréticulaires peut être observée dans les agrégats lymphoïdes) (voir les critères d’acceptation pour l’appendice dans le Tableau 2 ci-dessous). Les tissus de NSCLC positifs ALK et négatifs ALK destinés à être utilisés comme des contrôles au niveau du système doivent être évalués selon l’algorithme d’évaluation ALK pour NSCLC indiqué dans le Tableau 1 ci-dessus. Un tissu de contrôle positif doit consister en un échantillon récemment prélevé lors d’une autopsie/biopsie/chirurgie, qui est fixé et traité de la même manière que les échantillons de patient et qui doit être testé pour chaque groupe de conditions de test avec chaque test VENTANA antiALK (D5F3) IHC effectué. Ces tissus peuvent être utilisés pour contrôler toutes les étapes de traitement et de coloration des échantillons. Une coupe de tissu fixée ou traitée différemment de l’échantillon testé peut être utilisée comme contrôle pour les réactifs et la coloration, mais pas pour la fixation ni pour la préparation des tissus. La forte coloration cytoplasmique granulaire positive des cellules ganglionnaires et l’absence de forte coloration cytoplasmique granulaire dans les tissus lymphoïdes, musculaires et de l’épithélium glandulaire de l’échantillon de contrôle confirment que le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC a été appliqué et que l’instrument fonctionne correctement. Le tissu de contrôle positif ne doit être utilisé que pour contrôler les performances et pas pour aider à établir un diagnostic clinique à partir des échantillons de patient. Dans les zones de forte inflammation, une accentuation de la coloration spécifique des structures neurales et neuroendocriniennes et des histiocytes dans les tissus lymphoïdes peut être observée lors de la coloration avec le test VENTANA antiALK (D5F3) IHC. Cela est peut-être dû à une hyperplasie réactive des structures neurales ou à une non-reconnaissance d'autres structures normales du fait de l'inflammation. Il a été confirmé que ces structures étaient des structures neurales/neuroendocriniennes et des histiocytes avec des colorations par anticorps supplémentaires (S100, Synaptophysin et CD68). Tableau 2 : Critères d’acceptation de la coloration ALK dans les tissus de contrôle de l’appendice Acceptable Inacceptable Présence d’une forte coloration cytoplasmique granulaire dans les cellules ganglionnaires. (Voir la remarque) Absence d’une forte coloration cytoplasmique granulaire dans les cellules ganglionnaires. Absence d’une forte coloration cytoplasmique granulaire dans les tissus lymphoïdes, musculaires et des cellules épithéliales glandulaires (une coloration éparse ou rare des cellules lymphoréticulaires peut être observée dans les agrégats lymphoïdes). Coloration de fond non spécifique excessive des tissus lymphoïdes, musculaires ou des cellules épithéliales glandulaires qui interfère avec l’évaluation. Remarque : les nerfs dans les couches musculaires de l’appendice présentent une coloration positive. Appendice coloré avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC (Acceptable). Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Forte coloration granulaire cytoplasmique sur les cellules ganglionnaires de l’appendice et absence de coloration non spécifique excessive de la couche musculaire. (Acceptable). 9 ALK 4x ALK 40x Une accentuation de la coloration spécifique des structures neurales peut être observée dans l’appendice présentant une forte inflammation lors de la coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC. Cette coloration doit être exclue lors de l’évaluation d’éléments à coloration négative des tissus d’appendice (Acceptable). Absence de forte coloration granulaire cytoplasmique dans les tissus lymphoïdes et l’épithélium glandulaire (Acceptable). Les flèches indiquent l’absence de forte coloration granulaire cytoplasmique des cellules ganglionnaires de l’appendice (Inacceptable). Coloration non spécifique inadéquate des tissus lymphoïdes et de l’épithélium glandulaire (Inacceptable). Coloration non spécifique inadéquate de la couche musculaire de l’appendice. 10 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Arbre décisionnel Les lames colorées avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC doivent être évaluées à l’aide de l’approche décrite dans la figure ci-dessous. Les lames de contrôle au niveau du système et les lames de cas de contrôle négatif sont-elles acceptables ? Non Répéter la coloration ou demander un nouvel échantillon. Oui Non La lame colorée par ALK est-elle évaluable ? Oui Oui Le cas est POSITIF. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Observe-t-on une coloration spécifique dans la forte coloration cytoplasmique granulaire des cellules tumorales ? Non Le cas est NÉGATIF. 11 12 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Cas négatifs Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 13 Cas négatifs Un diagnostic clinique négatif pour le statut ALK est affecté à un cas si aucune forte coloration granulaire cytoplasmique n’est observée dans une cellule tumorale. H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Le cas négatif 1 ne présente aucune coloration ALK détectable par rapport à la lame colorée avec l’anticorps de contrôle négatif. Un diagnostic clinique négatif pour le statut ALK est affecté à ce cas. 14 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x a b Le cas négatif 2 présente une coloration ALK granulaire diffuse non spécifique dans les cellules tumorales (a) et une coloration dans les macrophages alvéolaires (b). Aucune forte coloration cytoplasmique granulaire n’est observée dans les cellules tumorales. Un diagnostic clinique négatif pour le statut ALK est affecté à ce cas. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 15 H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x b a Le cas négatif 3 présente une faible coloration ALK cytoplasmique dans les cellules tumorales (a) et une coloration de fond non spécifique granulaire des tissus nécrotiques (b). Un diagnostic clinique négatif pour le statut ALK est affecté à ce cas. 16 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Cas positifs Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 17 Cas positifs Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à un cas si une forte coloration granulaire cytoplasmique de la cellule tumorale est observée. H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Le cas positif 1 présente une forte coloration cytoplasmique granulaire homogène dans la tumeur. Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas. 18 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Le cas positif 2 présente une forte coloration cytoplasmique granulaire homogène dans la tumeur. Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 19 H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 60x Le cas positif 3 présente une coloration cytoplasmique granulaire hétérogène dans les coupes de la tumeur avec une forte coloration granulaire cytoplasmique dans certaines cellules tumorales. Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas. 20 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Le cas positif 4 présente un profil de coloration cytoplasmique granulaire hétérogène dans les coupes de la tumeur avec une forte coloration granulaire cytoplasmique dans certaines cellules tumorales. Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 21 H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Le cas positif 5 présente un profil de coloration cytoplasmique granulaire hétérogène dans les coupes de la tumeur avec une forte coloration cytoplasmique granulaire dans quelques cellules tumorales. Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas. 22 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 60x Le cas positif 6 présente une forte coloration cytoplasmique granulaire dans quelques cellules tumorales. Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 23 H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Le cas positif 7 présente une forte coloration cytoplasmique granulaire dans quelques cellules tumorales. Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas. 24 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Le cas positif 8 présente une forte coloration cytoplasmique granulaire dans quelques cellules tumorales (voir la flèche). Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 25 H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Le cas positif 9 présente une forte coloration cytoplasmique granulaire dans quelques cellules tumorales (voir la flèche). Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas. 26 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Cas difficiles Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 27 Cas difficiles et artéfacts connus de la coloration Bien que la grande majorité des cas colorés avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC donne des résultats de coloration clairement positifs ou négatifs, quelques cas dont l'interprétation est difficile ont été observés. • Fond non spécifique Un faible pourcentage de cas négatifs présente un profil cytoplasmique granulaire faible et diffus détecté au-delà de la coloration de fond observée sur la lame associée colorée avec l’anticorps Rabbit Monoclonal Negative Control Ig. Ventana a estimé que ces cas représentaient environ 1 à 2 % de tous les cas colorés à ce jour avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC et qu’ils étaient négatifs au test FISH. • Coloration cytoplasmique granulaire dans des éléments tissulaires sains Une coloration cytoplasmique granulaire dans les macrophages alvéolaires et les cellules épithéliales glandulaires bénignes peut être présente sur les lames colorées par ALK et sur les lames colorées avec le réactif de contrôle négatif. En outre, les éléments tissulaires neuronaux peuvent présenter une coloration positive pour l’ALK. Ces artéfacts de coloration doivent être exclus de l’interprétation des lames, car ils sont présents dans les éléments tissulaires sains, mais absents des cellules tumorales. • Coloration non spécifique de la mucine La coloration non spécifique de la mucine doit être exclue de l’interprétation de la lame à condition que la coloration n’interfère pas avec l’interprétation de la lame. • Artéfacts des tissus ou de la coloration Les artéfacts histologiques dus aux processus de traitement et de microtomie des échantillons peuvent également compliquer la détermination d’un diagnostic clinique ALK. Ces artéfacts peuvent notamment inclure : les gradients de fixation et les effets de contour, le piégeage DAB, l’absence de coloration dans certaines régions des tissus, le déchirement ou le pliage des tissus et la perte de la coupe tissulaire. Dans certains cas, il peut s’avérer nécessaire de répéter la coloration de nouvelles coupes ou d’obtenir un nouvel échantillon. Quelques exemples de cas difficiles sont illustrés dans les pages suivantes. 28 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Cas difficiles : coloration de fond non spécifique H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Cas difficile 1 : Négatif. Ce cas présente un profil cytoplasmique granulaire diffus non spécifique dans les tissus, détecté au-delà de la coloration de fond observée sur la lame associée colorée avec l’anticorps Rabbit Monoclonal Negative Control Ig. Un diagnostic clinique négatif pour le statut ALK est affecté à ce cas. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 29 Cas difficiles : coloration de fond non spécifique H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Cas difficile 2 : Positif. Ce cas présente un profil cytoplasmique granulaire diffus non spécifique dans le stroma, détecté au-delà de la coloration de fond observée sur la lame associée colorée avec l’anticorps Rabbit Monoclonal Negative Control Ig. Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas, et la coloration de fond est considérée comme étant acceptable car elle n’interfère pas avec l’interprétation de la coloration spécifique. 30 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans des macrophages alvéolaires H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Cas difficile 3 : Négatif. Une forte coloration granulaire cytoplasmique peut être présente dans les macrophages alvéolaires et ne doit pas être interprétée comme un diagnostic positif pour l’ALK. Lors de l’évaluation d’un NSCLC pour une coloration ALK, il est impératif d’examiner de près la coloration du type de cellule pour s’assurer qu’il s’agit d’une tumeur. Ces artéfacts de coloration doivent être exclus de l’interprétation de la lame, car ils sont présents dans les éléments tissulaires sains. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 31 Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans des cellules lymphoréticulaires disséminées dans les infiltrats lymphocytaires H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Cas difficile 4 : Négatif. Une forte coloration cytoplasmique granulaire peut être présente dans les cellules lymphoréticulaires disséminées dans les infiltrats lymphocytaires et ne doit pas être interprétée comme un diagnostic positif pour l’ALK. Lors de l’évaluation d’un NSCLC pour une coloration ALK, il est impératif d’examiner de près la coloration du type de cellule pour s’assurer qu’il s’agit d’une tumeur. Cette coloration doit être exclue de l’interprétation de la lame car elle est présente dans les éléments tissulaires sains. Un diagnostic clinique négatif pour le statut ALK est affecté à ce cas. 32 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans un épithélium glandulaire bénin H&E 10x ALK 20x Rbt nég. 20x ALK 40x Cas difficile 5 : Une coloration cytoplasmique granulaire dans un épithélium glandulaire bénin peut être présente sur les lames colorées par ALK. Ces artéfacts doivent être exclus de l’interprétation des lames car ils sont présents dans les éléments tissulaires sains, mais absents des cellules tumorales. Ces artéfacts de coloration doivent être exclus de l’interprétation des lames, car ils sont présents dans les éléments tissulaires sains, mais absents des cellules tumorales. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 33 Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans des cellules ganglionnaires H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Cas difficile 6 : Une coloration cytoplasmique granulaire dans des cellules ganglionnaires peut être présente sur les lames colorées par ALK. Ces artéfacts de coloration doivent être exclus de l’interprétation de la lame, car ils sont présents dans les éléments tissulaires sains. 34 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Cas difficiles : forte coloration ALK des membranes granulaires H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Cas difficile 7 : Négatif. La coloration membranaire ou non cytoplasmique ne doit pas être interprétée comme un diagnostic positif pour l’ALK pour ce cas. Une coloration spécifique positive pour l’ALK doit être une forte coloration cytoplasmique granulaire dans des cellules tumorales viables. Un diagnostic clinique négatif pour le statut ALK est affecté à ce cas. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 35 Cas difficiles : coloration de la mucine H&E 10x Rbt nég. 20x ALK 20x ALK 40x Cas difficile 8 : Positif. La coloration de la mucine doit être exclue de l’interprétation de la lame à condition que la coloration n’interfère pas avec l’interprétation du cas. 36 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Cas difficiles : piégeage DAB H&E 10x Rbt nég. 10x ALK 10x ALK 20x Cas difficile 9 : Positif. Il peut parfois arriver que les tissus comportent un piégeage DAB. Cet artéfact doit être exclu de l’interprétation des lames à condition que le piégeage n’interfère pas avec l’interprétation du cas. Sinon, l’échantillon doit être à nouveau coloré. Reproductibilité du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC L’avantage du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC est que l’utilisation du kit de détection OptiView DAB IHC Detection Kit et du kit d’amplification OptiView Amplification Kit permet d’interpréter facilement la grande majorité des cas de NSCLC comme « positifs » ou « négatifs ». La sensibilité accrue du test signifie que le lecteur n’a pas besoin de fournir une évaluation semi-quantitative du pourcentage de coloration des cellules tumorales ou des intensités de coloration, comme c’est le cas pour les autres biomarqueurs évalués grâce à des tests IHC. Toutefois, Ventana a conscience que le kit d’amplification OptiView Amplification Kit est une technologie nouvelle pour de nombreux anatomopathologistes. Un facteur évident associé aux systèmes de détection plus sensibles est une plus grande variabilité interlames de l’intensité de coloration totale comparativement à la DAB seule. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 37 38 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Conditions préanalytiques et leur répercussion sur la coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 39 Conditions préanalytiques et leur répercussion sur la coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Exemples de fixateurs (Xénogreffes) Ventana a mené des études en utilisant la lignée cellulaire NCI-H2228 (positive pour l’ALK) générée comme xénogreffes de tumeurs chez des souris SCID comme modèle pour déterminer la répercussion des facteurs préanalytiques sur le test. Les tumeurs ont été prélevées et fixées avec différents fixateurs pendant différentes durées, puis colorées avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC. D’après les directives ASCO/CAP pour le test HER2, les tissus doivent être fixés en utilisant du formol neutre tamponné à 10 % (NBF) pendant au moins six heures pour obtenir des résultats de coloration optimaux avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC.12-15 Le formol zinc a aussi donné des résultats de coloration acceptables à des points de mesure supérieurs à six heures et il peut donc être utilisé avec le test ALK. Toutefois, des durées de fixation inférieures à six heures (sous-fixation) dans le NBF et le formol zinc ont entraîné une diminution significative de l’intensité de coloration pour l’ALK. Des fixateurs autres que le NBF et le formol zinc, notamment AFA, B5 et PREFER, ont aussi été testés et ne doivent pas être utilisés avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC, car les résultats de la coloration ont été gravement compromis. L’intensité du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC a spectaculairement diminué à tous les points de mesure testés avec les fixateurs AFA, B5 et Prefer. De plus, une fixation dans de l’alcool à 95 % pendant seulement une heure a eu une influence négative significative sur l’intensité de la coloration ALK et ne doit pas être effectuée avec ce test. Ventana a aussi étudié l’influence d’un retardement de la fixation sur les résultats de la coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC. Des échantillons de xénogreffe ont été excisés et laissés sans fixation pendant différentes durées allant de 30 minutes à 24 heures avant d’être fixés pendant 12 heures dans du NBF à 10 %. Les résultats de la coloration ont montré que l’intensité du test ALK était compromise si le délai jusqu’à la fixation dans le NBF était retardé de plus de six heures. Enfin, il est important de souligner que la protéine ALK semble être plus sensible aux facteurs préanalytiques que d’autres marqueurs pulmonaires détectés par IHC (p. ex. TTF1 et EGFR) en utilisant les modèles de xénogreffe. Des données représentatives sont exposées ci-dessous. Ventana rappelle que les conditions de fixation des échantillons de poumon humain doivent être soigneusement surveillées et contrôlées pour assurer l’obtention de résultats de coloration optimaux avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC. 40 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Répercussion des conditions préanalytiques sur la coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Recommandations relatives aux fixateurs afin d’obtenir des résultats de coloration optimaux avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC de tissus sur fixateurs et temps de fixation Fixateur Temps de fixation (h) NBF à 10 % Formol zinc PREFER B5 AFA Éthanol à 95 % 1* Coupe d’une tumeur Aucune image 8 disponible. 12 24 72 REMARQUE : Ventana recommande d’effectuer la fixation pendant 6 à 72 heures dans du NBF à 10 %. Les résultats de la coloration ALK entourés d’un cadre bleu sont acceptables. La fixation pendant moins de six heures n’est pas recommandée. L’utilisation de fixateurs PREFER, de Bouin (non illustré) et à base d’alcool, par exemple AFA et éthanol à 95 %, n’est pas recommandée en raison de leur faible coloration. Il est important de souligner que la protéine ALK (détectée avec D5F3 mais également avec 5A4) semble être plus sensible aux facteurs préanalytiques que d’autres marqueurs pulmonaires détectés par IHC (TTF1 et EGFR) en utilisant les modèles de xénogreffe. Des images représentatives sont illustrées ci-dessous. Ventana rappelle que les conditions de fixation des échantillons de poumon humain doivent être soigneusement surveillées et contrôlées pour assurer l’obtention de résultats de coloration optimaux avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC. Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 41 Comparaison des marqueurs pulmonaires IHC fixés avec du NBF à 10 % Temps de fixation avec du NBF à 10 % (heures) Marqueurs pulmonaires IHC ALK TTF-1 EGFR 1 12 À noter que la différence de coloration est moins importante avec TTF-1 et EGFR par rapport à ALK quand on compare des temps de fixation de 1 et 12 heures. Le résultat de la coloration ALK est entouré d’une ligne en pointillés. 42 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Stabilité des lames Ventana a établi que le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC ne doit pas être pratiqué sur des lames conservées depuis plus de trois mois. L’intensité de la coloration diminue en cas de conservation à température ambiante des lames (bien qu’aucun des cas positifs à l’ALK testés à ce point de mesure n’ait présenté de changement de statut de positif pour l’ALK à négatif pour l’ALK). Des exemples sont présentés ci-dessous. Ventana n’a pas testé la répercussion de la stabilité des lames avec différents fixateurs et il se peut donc que la stabilité optimale avec des fixateurs autres que le NBF ne soit pas de trois mois. Lame du cas 1 fraîchement coupée et colorée. Lames du cas 1 conservées à température ambiante pendant quatre mois. Bien que ces deux lames soient positives pour l’ALK, il convient de noter une diminution de l’intensité de la coloration sur la lame stockée à température ambiante pendant trois mois (à droite) comparativement à la lame fraîchement coupée et colorée (à gauche). Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 43 44 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Références Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 45 Références 1. Kutok JL, Aster JC. Molecular biology of anaplastic lymphoma kinase-positive anaplastic large-cell lymphoma. J Clin Oncol. 2002;20(17):3691-3702. 2. Iwahara T, et al. 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Quality Assurance for Design Control and Implementation of Immunohistochemistry Assays: Approved Guideline-Second Edition. CLSI document I/LA28-A2 (ISBN 1-56238-745-6). CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898 USA, 2011. 46 Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC 47 Roche Diagnostics GmbH Sandhoferstrasse 116 68305 Mannheim Allemagne Tél. +49 (0)621 7590 www.ventana.com © 2012-2017 Ventana Medical Systems, Inc. et Roche Diagnostics International, Inc. Tous droits réservés. Vendu sous licence de VENTANA, BENCHMARK, OPTIVIEW et le logo VENTANA sont des marques commerciales de Roche. Toutes les autres marques commerciales appartiennent à leurs propriétaires respectifs. 1011879FR Rev H ">
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