Roche ALK (D5F3) Manuel utilisateur

VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit
Monoclonal Primary Antibody
Guide d’interprétation pour le carcinome du
poumon non à petites cellules (NSCLC)
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
i
ii
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Table des matières
Introduction1
Utilisation prévue
Utilisation prévue du produit
Objectif du guide d’interprétation
4
4
4
Évaluation clinique
Déroulement du traitement des échantillons
Contrôle au niveau du système
Arbre décisionnel
6
8
9
11
Cas négatifs
14
Cas positifs
18
Cas difficiles et artéfacts connus de la coloration
Cas difficiles : coloration de fond non spécifique
Cas difficiles : coloration de fond non spécifique
Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans des macrophages alvéolaires
Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans des cellules lymphoréticulaires
disséminées dans les infiltrats lymphocytaires
Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans un épithélium glandulaire bénin
Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans des cellules ganglionnaires
Cas difficiles : forte coloration ALK des membranes granulaires
Cas difficiles : coloration de la mucine
Cas difficiles : piégeage DAB
Reproductibilité du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
28
29
30
31
Conditions préanalytiques et leur répercussion sur la coloration avec le test
VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC Exemples de fixateurs (Xénogreffes)
Répercussion des conditions préanalytiques sur la coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Comparaison des marqueurs pulmonaires IHC fixés avec du NBF à 10 %
Stabilité des lames
32
33
34
35
36
37
37
40
40
41
42
43
Références46
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
iii
iv
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Introduction
La protéine ALK (kinase du lymphome anaplasique) fait partie de
la superfamille des récepteurs à l'insuline de type tyrosine kinase.1
L'ALK est une glycoprotéine membranaire de type I qui n’est
normalement exprimée que dans le système nerveux. 2 Située sur le
chromosome 2p23, elle se compose de deux grands introns et de
26 exons.1 La pathogénicité moléculaire de l'ALK débute par des
réarrangements chromosomiques faisant s'associer les séquences
codantes en 3’ pour le domaine de signalisation intracellulaire avec
les éléments du promoteur en 5’ et les séquences codantes d'autres
gènes.
Une inversion au sein du chromosome 2p conduisant à la formation
d’un gène de fusion comprenant des portions du gène de la protéine
associée au microtubule d’échinoderne de type 4 (EML4) et du
gène ALK a été découverte en 2007 dans des lignées cellulaires
du carcinome du poumon non à petites cellules (NSCLC) et dans
des échantillons cliniques archivés.3 Des études ont révélé que les
événements de l’inversion EML4-ALK comprenaient au moins neuf
variantes de fusion, chacune d’elles étant composée de la même
portion du domaine kinase C terminal de l’ALK, ce qui leur confère
une activité catalytique.4-8 Il est donc cohérent que l’expression de
l’EML4-ALK dans les cellules épithéliales alvéolaires pulmonaires de
souris transgéniques soit un facteur oncogène puissant.9 La fusion
confère à l’ALK une coloration cytoplasmique.
Ventana a développé le test VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit
Monoclonal Primary Antibody (test VENTANA anti-ALK (D5F3)
IHC), qui peut être utilisé avec le kit de détection OptiView DAB IHC
Detection Kit et le kit d’amplification OptiView Amplification Kit,
comme un test d’immunohistochimie (IHC) entièrement automatisé
sur les automates de coloration par immunohistochimie BenchMark
Series. La sensibilité du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC offre un
système d’évaluation binaire reproductible (statut positif ou négatif
de l’ALK) pour évaluer les résultats de la coloration (consulter la
notice du test VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit Monoclonal Primary
Antibody, réf. 790-4794 / 06679072001). Pour développer le test
VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC, Ventana a utilisé toute une gamme
d’échantillons de tissu de NSCLC humains prélevés sur des tumeurs
primitives et métastatiques, notamment des tissus de résection, de
biopsie par aspiration, de biopsie bronchique et de blocs cellulaires
fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) obtenus par aspiration à
l’aiguille fine.
L’ALK est désormais reconnue comme une voie de signalisation
oncogène clé du NSCLC et, bien que l’EML4 soit le partenaire de
fusion prédominant, d’autres gènes partenaires de fusion ont été
identifiés.10,11,12,13,14 L’incidence des réarrangements du gène ALK
semble être comprise entre 2 et 7 %, avec pour résultat environ
6 000 patients positifs à l’ALK/an aux États-Unis et 40 000 patients/an
dans le monde.3-8 Cependant, cette estimation présente des limites,
notamment un ensemble limité de données (1 500 échantillons
tumoraux) et des méthodologies de recherche de la protéine ALK
différentes selon les études. La grande majorité des réarrangements
du gène ALK a notamment été observée dans des échantillons
d’adénocarcinome pulmonaire plutôt que dans des échantillons
présentant des histologies épidermoïdes et à petites cellules. 3-8 Des
preuves montrent également que les réarrangements du gène ALK
affectent les patients n’ayant « jamais ou peu fumé », bien que cela
puisse ne pas être un cofacteur statistiquement significatif. 3,4,7,9 Il est
important de noter que les réarrangements du gène ALK coïncident
rarement avec des mutations d’EGFR, de HER2 ou de KRAS, ce
qui démontre que la positivité à l’ALK constitue un sous-type
pathologique distinct.9
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
1
2
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Utilisation prévue
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
3
Utilisation prévue
Utilisation prévue du produit
L’anticorps VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit Monoclonal Primary
Antibody est destiné à une utilisation en laboratoire pour la détection
de la protéine kinase du lymphome anaplasique (ALK) dans des tissus
de carcinome du poumon non à petites cellules (NSCLC) fixés au
formol et inclus en paraffine colorés sur des automates de coloration
par immunohistochimie BenchMark Series. Il est indiqué pour faciliter
l’identification des patients pouvant bénéficier d’un traitement par
XALKORI® (crizotinib), ZYKADIA® (ceritinib), ou ALECENSA® (alectinib).
L’interprétation clinique de toute coloration ou absence de
coloration doit être complétée par des études histologiques et
l’analyse de contrôles adéquats. L’évaluation doit être menée par un
anatomopathologiste qualifié en tenant compte des antécédents
cliniques du patient et d’autres tests diagnostiques.
Ce produit est destiné à la réalisation de diagnostics in vitro (DIV).
Objectif du guide d’interprétation
Le présent guide est destiné aux fins suivantes :
• Fournir aux anatomopathologistes un outil facilitant l’évaluation
clinique de coupes de tissus NSCLC fixées au formol et incluses en
paraffine (FFPE) colorées avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3)
IHC conformément à l’étiquetage proposé du produit.
• Fournir des clichés photographiques qui illustrent les profils de
coloration pouvant résulter de la coloration des tissus NSCLC avec le
test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC.
• Fournir des exemples d’image illustrant les cas difficiles afin de
faciliter leur évaluation.
• Fournir une orientation lors de l’utilisation d’un tissu de contrôle
positif à l’ALK (par exemple, appendice) qui sert de tissu de contrôle
quand il est coloré avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC.
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Évaluation clinique
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
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Évaluation clinique
Évaluation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC pour le
NSCLC
Pour le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC, chaque cas est coloré
avec l’anticorps VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit Monoclonal
Primary Antibody et un anticorps Rabbit Monoclonal Negative
Control Ig associé. Les cellules néoplasiques marquées avec le
test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC sont évaluées afin de détecter
la présence ou l’absence du signal DAB. La lame de contrôle
négatif associée est utilisée pour évaluer la coloration de fond non
spécifique et le degré de coloration de fond dus à des éléments
tissulaires spécifiques (consulter les images de cas positifs et
négatifs ci-dessous). Remarque : tous les cas doivent être colorés
avec le kit de détection OptiView DAB IHC Detection Kit et avec le
kit d’amplification OptiView Amplification Kit, car certains cas sont
faiblement positifs pour l’ALK par détection DAB uniquement.
L’algorithme d’évaluation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
est indiqué dans le Tableau 1 ci-après. Des cas représentatifs sont
présentés dans les illustrations.
Tableau 1 : Critères d’évaluation de la détermination du statut de l’ALK dans le NSCLC.
Interprétation clinique
Description de la coloration
Positif pour ALK
Présence d’une forte coloration cytoplasmique granulaire dans les cellules tumorales (tout pourcentage
de cellules tumorales positives). Certains éléments de coloration doivent être exclus, notamment :
• taches cytoplasmiques claires dans les macrophages alvéolaires ;
• cellules d’origine neurale (nerfs et cellules ganglionnaires) ;
• coloration épithéliale glandulaire et
• cellules lymphoréticulaires disséminées dans les infiltrats lymphocytaires.
Une certaine coloration de fond peut également être observée dans la muqueuse saine en présence d’un
NSCLC (notamment mucine) ainsi que dans les zones de nécrose tumorale, qui doivent également être
exclues de l’évaluation clinique.
Négatif pour ALK
6
Absence d’une forte coloration cytoplasmique granulaire dans les cellules tumorales.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
DIAGNOSTIC CLINIQUE : NÉGATIF
Aucune coloration
Taches légères dans les cellules tumorales
Coloration granulaire diffuse non spécifique
DIAGNOSTIC CLINIQUE : POSITIF
Quelques cellules tumorales présentant
une forte coloration cytoplasmique
Cellules tumorales présentant une
forte coloration cytoplasmique
Forte coloration cytoplasmique homogène
dans les cellules tumorales
La coloration nécessite trois coupes de chaque cas, une coupe de tissu en série pour H&E (hématoxyline et éosine), une deuxième coupe de
tissu en série pour la coloration avec l’anticorps isotype de contrôle monoclonal négatif de lapin et une troisième coupe de tissu en série pour
la coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC. Si l’évaluation H&E indique que l’échantillon de patient n’est pas adéquat, un nouvel
échantillon doit alors être prélevé et coloré avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC.
Les tissus de NSCLC préqualifiés positifs et négatifs pour l’ALK selon l’algorithme d’évaluation indiqué au Tableau 1 peuvent être utilisés
comme des contrôles au niveau du système. Par ailleurs, les tissus d’appendice préqualifiés présentant une forte coloration ALK des cellules
ganglionnaires et l’absence d’une forte coloration granulaire dans les cellules lymphoïdes, du plexus myentérique et glandulaires de l’appendice
peuvent également être utilisés comme des contrôles au niveau du système. Les éléments positifs et négatifs doivent être colorés de manière
appropriée, comme défini par l’algorithme d’évaluation du NSCLC (Tableau 1) ou par les critères d’acceptation pour l’appendice (Tableau 2)
sur chaque série pour que la série puisse être considérée comme étant valide. Les lames d’échantillon colorées par ALK doivent être évaluées
par un anatomopathologiste confirmé. Si la lame de contrôle des tissus colorés par ALK n’est pas acceptable, la coloration des échantillons
de patient doit être répétée. Si une lame colorée par l’anticorps du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC n’est pas évaluable, cela indique que la
réactivité n’a pas pu être déterminée en raison d’une nécrose, de l’absence de tissus ou d’artéfacts.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
7
Déroulement du traitement des échantillons
Un prélèvement de tissu de
NSCLC est prélevé chez le
patient, fixé au formol neutre
tamponné à 10 % pendant
6-72 heures conformément
aux procédures de laboratoire
standard et inclus en paraffine.
Des coupes d'environ 4-5 μm
d'épaisseur sont déposées sur
des lames de verre pour
microscope chargées
positivement.
La lame H&E
est-elle
acceptable ?
Non
Une coupe est colorée
avec l’H&E.
Oui
Une coupe est colorée avec l’anticorps du test VENTANA antiALK (D5F3) IHC. Une autre coupe est colorée avec un anticorps
de contrôle négatif au cours du même cycle de coloration. Les
tissus de contrôle préqualifiés (appendice, par exemple) doivent
être colorés au cours du même cycle que les lames contenant
l'échantillon de patient pour servir de contrôle au niveau du système.
Répéter la coloration
avec un nouvel
échantillon de patient.
Répéter le cycle de
coloration.
Non
La lame de
contrôle au
niveau du
système
(appendice, par
exemple) est-elle
acceptable ?
Oui
Répéter le cas de
coloration.
Non
La lame de
l’échantillon
coloré avec
l’anticorps
de contrôle
négatif est-elle
acceptable ?
Oui
Répéter le cas de
coloration.
Non
La lame de
l’échantillon
coloré avec
l’anticorps du test
VENTANA antiALK (D5F3) IHC
est-elle
acceptable ?
Oui
Les résultats ALK sont interprétés par un
anatomopathologiste confirmé conformément à
l’algorithme d’évaluation clinique pour NSCLC
du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC.
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Contrôle au niveau du système
Il est recommandé d’utiliser les tissus d’appendice comportant des
éléments de coloration positifs et négatifs ou NSCLC positifs ALK et
négatifs ALK comme des tissus de contrôle au niveau du système. Les
cellules ganglionnaires de l’appendice présentent une forte coloration
granulaire cytoplasmique pour l’ALK. En outre, une forte coloration
granulaire cytoplasmique a également été observée dans les nerfs des
couches musculaires de l’appendice. Absence d’une forte coloration
granulaire cytoplasmique dans les tissus des cellules épithéliales
glandulaires, musculaires et lymphoïdes (une coloration rare ou éparse
des cellules lymphoréticulaires peut être observée dans les agrégats
lymphoïdes) (voir les critères d’acceptation pour l’appendice dans le
Tableau 2 ci-dessous). Les tissus de NSCLC positifs ALK et négatifs
ALK destinés à être utilisés comme des contrôles au niveau du système
doivent être évalués selon l’algorithme d’évaluation ALK pour NSCLC
indiqué dans le Tableau 1 ci-dessus.
Un tissu de contrôle positif doit consister en un échantillon récemment
prélevé lors d’une autopsie/biopsie/chirurgie, qui est fixé et traité de la
même manière que les échantillons de patient et qui doit être testé pour
chaque groupe de conditions de test avec chaque test VENTANA antiALK (D5F3) IHC effectué. Ces tissus peuvent être utilisés pour contrôler
toutes les étapes de traitement et de coloration des échantillons. Une
coupe de tissu fixée ou traitée différemment de l’échantillon testé peut
être utilisée comme contrôle pour les réactifs et la coloration, mais pas
pour la fixation ni pour la préparation des tissus. La forte coloration
cytoplasmique granulaire positive des cellules ganglionnaires et
l’absence de forte coloration cytoplasmique granulaire dans les
tissus lymphoïdes, musculaires et de l’épithélium glandulaire de
l’échantillon de contrôle confirment que le test VENTANA anti-ALK
(D5F3) IHC a été appliqué et que l’instrument fonctionne correctement.
Le tissu de contrôle positif ne doit être utilisé que pour contrôler les
performances et pas pour aider à établir un diagnostic clinique à partir
des échantillons de patient. Dans les zones de forte inflammation, une
accentuation de la coloration spécifique des structures neurales et
neuroendocriniennes et des histiocytes dans les tissus lymphoïdes
peut être observée lors de la coloration avec le test VENTANA antiALK (D5F3) IHC. Cela est peut-être dû à une hyperplasie réactive
des structures neurales ou à une non-reconnaissance d'autres
structures normales du fait de l'inflammation. Il a été confirmé que ces
structures étaient des structures neurales/neuroendocriniennes et des
histiocytes avec des colorations par anticorps supplémentaires (S100,
Synaptophysin et CD68).
Tableau 2 : Critères d’acceptation de la coloration ALK dans les tissus de contrôle de l’appendice
Acceptable
Inacceptable
Présence d’une forte coloration cytoplasmique granulaire dans les
cellules ganglionnaires. (Voir la remarque)
Absence d’une forte coloration cytoplasmique granulaire dans les
cellules ganglionnaires.
Absence d’une forte coloration cytoplasmique granulaire dans les
tissus lymphoïdes, musculaires et des cellules épithéliales glandulaires
(une coloration éparse ou rare des cellules lymphoréticulaires peut
être observée dans les agrégats lymphoïdes).
Coloration de fond non spécifique excessive des tissus lymphoïdes,
musculaires ou des cellules épithéliales glandulaires qui interfère
avec l’évaluation.
Remarque : les nerfs dans les couches musculaires de l’appendice présentent une coloration positive.
Appendice coloré avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC (Acceptable).
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Forte coloration granulaire cytoplasmique sur les cellules ganglionnaires de l’appendice et
absence de coloration non spécifique excessive de la couche musculaire. (Acceptable).
9
ALK 4x
ALK 40x
Une accentuation de la coloration spécifique des structures neurales peut être observée dans l’appendice présentant une forte inflammation lors de la coloration avec le test VENTANA
anti-ALK (D5F3) IHC. Cette coloration doit être exclue lors de l’évaluation d’éléments à coloration négative des tissus d’appendice (Acceptable).
Absence de forte coloration granulaire cytoplasmique dans les tissus lymphoïdes et
l’épithélium glandulaire (Acceptable).
Les flèches indiquent l’absence de forte coloration granulaire cytoplasmique des cellules
ganglionnaires de l’appendice (Inacceptable).
Coloration non spécifique inadéquate des tissus lymphoïdes et de l’épithélium glandulaire
(Inacceptable).
Coloration non spécifique inadéquate de la couche musculaire de l’appendice.
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Arbre décisionnel
Les lames colorées avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC doivent être évaluées à l’aide de l’approche décrite dans la figure ci-dessous.
Les lames de
contrôle au niveau
du système et
les lames de
cas de contrôle
négatif sont-elles
acceptables ?
Non
Répéter la coloration
ou demander un nouvel
échantillon.
Oui
Non
La lame colorée
par ALK est-elle
évaluable ?
Oui
Oui
Le cas est POSITIF.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Observe-t-on
une coloration
spécifique dans la
forte coloration
cytoplasmique
granulaire
des cellules
tumorales ?
Non
Le cas est NÉGATIF.
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Cas négatifs
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
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Cas négatifs
Un diagnostic clinique négatif pour le statut ALK est affecté à un cas si aucune forte coloration granulaire cytoplasmique n’est observée dans
une cellule tumorale.
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Le cas négatif 1 ne présente aucune coloration ALK détectable par rapport à la lame colorée avec l’anticorps de contrôle négatif. Un
diagnostic clinique négatif pour le statut ALK est affecté à ce cas.
14
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
a
b
Le cas négatif 2 présente une coloration ALK granulaire diffuse non spécifique dans les cellules tumorales (a) et une coloration dans les
macrophages alvéolaires (b). Aucune forte coloration cytoplasmique granulaire n’est observée dans les cellules tumorales. Un diagnostic
clinique négatif pour le statut ALK est affecté à ce cas.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
15
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
b
a
Le cas négatif 3 présente une faible coloration ALK cytoplasmique dans les cellules tumorales (a) et une coloration de fond non spécifique
granulaire des tissus nécrotiques (b). Un diagnostic clinique négatif pour le statut ALK est affecté à ce cas.
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Cas positifs
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
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Cas positifs
Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à un cas si une forte coloration granulaire cytoplasmique de la cellule tumorale est
observée.
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Le cas positif 1 présente une forte coloration cytoplasmique granulaire homogène dans la tumeur. Un diagnostic clinique positif pour le statut
ALK est affecté à ce cas.
18
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Le cas positif 2 présente une forte coloration cytoplasmique granulaire homogène dans la tumeur. Un diagnostic clinique positif pour le statut
ALK est affecté à ce cas.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
19
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 60x
Le cas positif 3 présente une coloration cytoplasmique granulaire hétérogène dans les coupes de la tumeur avec une forte coloration
granulaire cytoplasmique dans certaines cellules tumorales. Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas.
20
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Le cas positif 4 présente un profil de coloration cytoplasmique granulaire hétérogène dans les coupes de la tumeur avec une forte coloration
granulaire cytoplasmique dans certaines cellules tumorales. Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
21
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Le cas positif 5 présente un profil de coloration cytoplasmique granulaire hétérogène dans les coupes de la tumeur avec une forte coloration
cytoplasmique granulaire dans quelques cellules tumorales. Un diagnostic clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas.
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 60x
Le cas positif 6 présente une forte coloration cytoplasmique granulaire dans quelques cellules tumorales. Un diagnostic clinique positif pour le
statut ALK est affecté à ce cas.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
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H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Le cas positif 7 présente une forte coloration cytoplasmique granulaire dans quelques cellules tumorales. Un diagnostic clinique positif pour le
statut ALK est affecté à ce cas.
24
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Le cas positif 8 présente une forte coloration cytoplasmique granulaire dans quelques cellules tumorales (voir la flèche). Un diagnostic
clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
25
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Le cas positif 9 présente une forte coloration cytoplasmique granulaire dans quelques cellules tumorales (voir la flèche). Un diagnostic
clinique positif pour le statut ALK est affecté à ce cas.
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Cas difficiles
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
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Cas difficiles et artéfacts connus de la coloration
Bien que la grande majorité des cas colorés avec le test VENTANA
anti-ALK (D5F3) IHC donne des résultats de coloration clairement
positifs ou négatifs, quelques cas dont l'interprétation est difficile ont
été observés.
• Fond non spécifique
Un faible pourcentage de cas négatifs présente un profil
cytoplasmique granulaire faible et diffus détecté au-delà de la
coloration de fond observée sur la lame associée colorée avec
l’anticorps Rabbit Monoclonal Negative Control Ig. Ventana a estimé
que ces cas représentaient environ 1 à 2 % de tous les cas colorés à
ce jour avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC et qu’ils étaient
négatifs au test FISH.
• Coloration cytoplasmique granulaire dans des éléments
tissulaires sains
Une coloration cytoplasmique granulaire dans les macrophages
alvéolaires et les cellules épithéliales glandulaires bénignes peut être
présente sur les lames colorées par ALK et sur les lames colorées
avec le réactif de contrôle négatif. En outre, les éléments tissulaires
neuronaux peuvent présenter une coloration positive pour l’ALK.
Ces artéfacts de coloration doivent être exclus de l’interprétation des
lames, car ils sont présents dans les éléments tissulaires sains, mais
absents des cellules tumorales.
• Coloration non spécifique de la mucine
La coloration non spécifique de la mucine doit être exclue de
l’interprétation de la lame à condition que la coloration n’interfère
pas avec l’interprétation de la lame.
• Artéfacts des tissus ou de la coloration
Les artéfacts histologiques dus aux processus de traitement et
de microtomie des échantillons peuvent également compliquer la
détermination d’un diagnostic clinique ALK. Ces artéfacts peuvent
notamment inclure : les gradients de fixation et les effets de contour,
le piégeage DAB, l’absence de coloration dans certaines régions des
tissus, le déchirement ou le pliage des tissus et la perte de la coupe
tissulaire. Dans certains cas, il peut s’avérer nécessaire de répéter la
coloration de nouvelles coupes ou d’obtenir un nouvel échantillon.
Quelques exemples de cas difficiles sont illustrés dans les
pages suivantes.
28
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Cas difficiles : coloration de fond non spécifique
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Cas difficile 1 : Négatif. Ce cas présente un profil cytoplasmique granulaire diffus non spécifique dans les tissus, détecté au-delà de la
coloration de fond observée sur la lame associée colorée avec l’anticorps Rabbit Monoclonal Negative Control Ig. Un diagnostic clinique négatif
pour le statut ALK est affecté à ce cas.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
29
Cas difficiles : coloration de fond non spécifique
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Cas difficile 2 : Positif. Ce cas présente un profil cytoplasmique granulaire diffus non spécifique dans le stroma, détecté au-delà de la
coloration de fond observée sur la lame associée colorée avec l’anticorps Rabbit Monoclonal Negative Control Ig. Un diagnostic clinique
positif pour le statut ALK est affecté à ce cas, et la coloration de fond est considérée comme étant acceptable car elle n’interfère pas avec
l’interprétation de la coloration spécifique.
30
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans des macrophages alvéolaires
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Cas difficile 3 : Négatif. Une forte coloration granulaire cytoplasmique peut être présente dans les macrophages alvéolaires et ne doit pas
être interprétée comme un diagnostic positif pour l’ALK. Lors de l’évaluation d’un NSCLC pour une coloration ALK, il est impératif d’examiner de
près la coloration du type de cellule pour s’assurer qu’il s’agit d’une tumeur. Ces artéfacts de coloration doivent être exclus de l’interprétation de
la lame, car ils sont présents dans les éléments tissulaires sains.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
31
Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans des cellules lymphoréticulaires
disséminées dans les infiltrats lymphocytaires
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Cas difficile 4 : Négatif. Une forte coloration cytoplasmique granulaire peut être présente dans les cellules lymphoréticulaires disséminées
dans les infiltrats lymphocytaires et ne doit pas être interprétée comme un diagnostic positif pour l’ALK. Lors de l’évaluation d’un NSCLC pour
une coloration ALK, il est impératif d’examiner de près la coloration du type de cellule pour s’assurer qu’il s’agit d’une tumeur. Cette coloration
doit être exclue de l’interprétation de la lame car elle est présente dans les éléments tissulaires sains. Un diagnostic clinique négatif pour le
statut ALK est affecté à ce cas.
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans un épithélium glandulaire bénin
H&E 10x
ALK 20x
Rbt nég. 20x
ALK 40x
Cas difficile 5 : Une coloration cytoplasmique granulaire dans un épithélium glandulaire bénin peut être présente sur les lames colorées
par ALK. Ces artéfacts doivent être exclus de l’interprétation des lames car ils sont présents dans les éléments tissulaires sains, mais absents
des cellules tumorales. Ces artéfacts de coloration doivent être exclus de l’interprétation des lames, car ils sont présents dans les éléments
tissulaires sains, mais absents des cellules tumorales.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
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Cas difficiles : coloration cytoplasmique granulaire dans des cellules ganglionnaires
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Cas difficile 6 : Une coloration cytoplasmique granulaire dans des cellules ganglionnaires peut être présente sur les lames colorées par ALK.
Ces artéfacts de coloration doivent être exclus de l’interprétation de la lame, car ils sont présents dans les éléments tissulaires sains.
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Cas difficiles : forte coloration ALK des membranes granulaires
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Cas difficile 7 : Négatif. La coloration membranaire ou non cytoplasmique ne doit pas être interprétée comme un diagnostic positif pour l’ALK
pour ce cas. Une coloration spécifique positive pour l’ALK doit être une forte coloration cytoplasmique granulaire dans des cellules tumorales
viables. Un diagnostic clinique négatif pour le statut ALK est affecté à ce cas.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
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Cas difficiles : coloration de la mucine
H&E 10x
Rbt nég. 20x
ALK 20x
ALK 40x
Cas difficile 8 : Positif. La coloration de la mucine doit être exclue de l’interprétation de la lame à condition que la coloration n’interfère pas
avec l’interprétation du cas.
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Cas difficiles : piégeage DAB
H&E 10x
Rbt nég. 10x
ALK 10x
ALK 20x
Cas difficile 9 : Positif. Il peut parfois arriver que les tissus comportent un piégeage DAB. Cet artéfact doit être exclu de l’interprétation des
lames à condition que le piégeage n’interfère pas avec l’interprétation du cas. Sinon, l’échantillon doit être à nouveau coloré.
Reproductibilité du test VENTANA anti-ALK
(D5F3) IHC
L’avantage du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC est que l’utilisation
du kit de détection OptiView DAB IHC Detection Kit et du kit
d’amplification OptiView Amplification Kit permet d’interpréter
facilement la grande majorité des cas de NSCLC comme « positifs » ou
« négatifs ». La sensibilité accrue du test signifie que le lecteur n’a pas
besoin de fournir une évaluation semi-quantitative du pourcentage
de coloration des cellules tumorales ou des intensités de coloration,
comme c’est le cas pour les autres biomarqueurs évalués grâce à des
tests IHC. Toutefois, Ventana a conscience que le kit d’amplification
OptiView Amplification Kit est une technologie nouvelle pour de
nombreux anatomopathologistes. Un facteur évident associé aux
systèmes de détection plus sensibles est une plus grande variabilité
interlames de l’intensité de coloration totale comparativement à la
DAB seule.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Conditions préanalytiques et leur répercussion sur la coloration
avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
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Conditions préanalytiques et leur répercussion sur la coloration avec le test
VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Exemples de fixateurs (Xénogreffes)
Ventana a mené des études en utilisant la lignée cellulaire NCI-H2228
(positive pour l’ALK) générée comme xénogreffes de tumeurs chez
des souris SCID comme modèle pour déterminer la répercussion des
facteurs préanalytiques sur le test. Les tumeurs ont été prélevées
et fixées avec différents fixateurs pendant différentes durées, puis
colorées avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC.
D’après les directives ASCO/CAP pour le test HER2, les tissus
doivent être fixés en utilisant du formol neutre tamponné à 10 %
(NBF) pendant au moins six heures pour obtenir des résultats de
coloration optimaux avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC.12-15
Le formol zinc a aussi donné des résultats de coloration acceptables
à des points de mesure supérieurs à six heures et il peut donc être
utilisé avec le test ALK. Toutefois, des durées de fixation inférieures
à six heures (sous-fixation) dans le NBF et le formol zinc ont entraîné
une diminution significative de l’intensité de coloration pour l’ALK.
Des fixateurs autres que le NBF et le formol zinc, notamment AFA, B5
et PREFER, ont aussi été testés et ne doivent pas être utilisés avec le
test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC, car les résultats de la coloration
ont été gravement compromis. L’intensité du test VENTANA anti-ALK
(D5F3) IHC a spectaculairement diminué à tous les points de mesure
testés avec les fixateurs AFA, B5 et Prefer. De plus, une fixation dans
de l’alcool à 95 % pendant seulement une heure a eu une influence
négative significative sur l’intensité de la coloration ALK et ne doit pas
être effectuée avec ce test.
Ventana a aussi étudié l’influence d’un retardement de la fixation sur
les résultats de la coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3)
IHC. Des échantillons de xénogreffe ont été excisés et laissés sans
fixation pendant différentes durées allant de 30 minutes à 24 heures
avant d’être fixés pendant 12 heures dans du NBF à 10 %. Les
résultats de la coloration ont montré que l’intensité du test ALK était
compromise si le délai jusqu’à la fixation dans le NBF était retardé de
plus de six heures.
Enfin, il est important de souligner que la protéine ALK semble être
plus sensible aux facteurs préanalytiques que d’autres marqueurs
pulmonaires détectés par IHC (p. ex. TTF1 et EGFR) en utilisant
les modèles de xénogreffe. Des données représentatives sont
exposées ci-dessous. Ventana rappelle que les conditions de fixation
des échantillons de poumon humain doivent être soigneusement
surveillées et contrôlées pour assurer l’obtention de résultats de
coloration optimaux avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC.
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Répercussion des conditions préanalytiques sur la coloration avec le test
VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Recommandations relatives aux fixateurs afin d’obtenir des résultats de coloration optimaux avec le test
VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Coloration avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC de tissus sur fixateurs et temps de fixation
Fixateur
Temps de
fixation
(h)
NBF à 10 %
Formol zinc
PREFER
B5
AFA
Éthanol à 95 %
1*
Coupe d’une tumeur
Aucune image
8
disponible.
12
24
72
REMARQUE :
Ventana recommande d’effectuer la fixation pendant 6 à 72 heures dans du NBF à 10 %. Les résultats de la coloration ALK entourés d’un cadre
bleu sont acceptables.
La fixation pendant moins de six heures n’est pas recommandée.
L’utilisation de fixateurs PREFER, de Bouin (non illustré) et à base d’alcool, par exemple AFA et éthanol à 95 %, n’est pas recommandée en raison
de leur faible coloration.
Il est important de souligner que la protéine ALK (détectée avec D5F3 mais également avec 5A4) semble être plus sensible aux facteurs
préanalytiques que d’autres marqueurs pulmonaires détectés par IHC (TTF1 et EGFR) en utilisant les modèles de xénogreffe. Des images
représentatives sont illustrées ci-dessous. Ventana rappelle que les conditions de fixation des échantillons de poumon humain doivent être
soigneusement surveillées et contrôlées pour assurer l’obtention de résultats de coloration optimaux avec le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC.
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
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Comparaison des marqueurs pulmonaires IHC fixés avec du NBF à 10 %
Temps de fixation avec
du NBF à 10 % (heures)
Marqueurs pulmonaires IHC
ALK
TTF-1
EGFR
1
12
À noter que la différence de coloration est moins importante avec TTF-1 et EGFR par rapport à ALK quand on compare des temps de fixation de
1 et 12 heures. Le résultat de la coloration ALK est entouré d’une ligne en pointillés.
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Stabilité des lames
Ventana a établi que le test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC ne doit pas être pratiqué sur des lames conservées depuis plus de trois mois.
L’intensité de la coloration diminue en cas de conservation à température ambiante des lames (bien qu’aucun des cas positifs à l’ALK testés à
ce point de mesure n’ait présenté de changement de statut de positif pour l’ALK à négatif pour l’ALK). Des exemples sont présentés ci-dessous.
Ventana n’a pas testé la répercussion de la stabilité des lames avec différents fixateurs et il se peut donc que la stabilité optimale avec des
fixateurs autres que le NBF ne soit pas de trois mois.
Lame du cas 1 fraîchement coupée et colorée.
Lames du cas 1 conservées à température ambiante pendant quatre mois.
Bien que ces deux lames soient positives pour l’ALK, il convient de noter une diminution de l’intensité de la coloration sur la lame stockée à
température ambiante pendant trois mois (à droite) comparativement à la lame fraîchement coupée et colorée (à gauche).
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Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
Références
Guide d’interprétation du test VENTANA anti-ALK (D5F3) IHC
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