5.B. Rendement chez plusieurs sujets
Au cours du développement de la méthode ReliaPrep™ pour sang total, nous avons traité des échantillons provenant de plusieurs sujets. La Figure 2 présente le rendement en ADN par leucocyte.
6
Purification automatisée ReliaPrep™
Précipitation manuelle
5
4
3
2
1
0
Sujet 1 Sujet 2 Sujet 3 Sujet 4
Figure 2. Rendements normalisés en ADN chez plusieurs sujets. Les rendements en ADN sont normalisés en fonction des taux de leucocytes de chaque sujet. Le sujet 1 est celui qui a été utilisé dans la Figure 1. Chaque barre représente la moyenne de quatre réplicats et les barres d’erreur représentant un écart-type.
5.C. Contrôle de contamination croisée
Ce système intégré utilise une série d’étapes de nettoyage pour faire en sorte que les constituants entrant en contact avec les échantillons et partagés entre ceux-ci ne présentent pas de risque de contamination croisée.
Pour une description détaillée des méthodes utilisées pour vérifier l’intégrité des échantillons sur l’appareil Tecan
Freedom EVO
®
-HSM Workstation, veuillez vous reporter à la note d’application Verification of Sample Integrity
for the Tecan Freedom EVO
®
-HSM Workstation, n o
AN204, à l’adresse www.promega.com.
Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 États-Unis
Numéro vert aux États-Unis 800-356-9526 · +1-608-274-4330 · Fax +1-608-277-2516
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6. Dépannage
Pour toute question qui ne serait pas traitée ci-dessous, veuillez consulter une succursale ou un distributeur
Promega local. Les coordonnées de ceux-ci sont disponibles au site : www.promega.com.
Adresse électronique : [email protected].
Symptômes
Faible rendement en ADN
ADN dégradé
Causes possibles et commentaires
La résine ReliaPrep™ n’a pas été remise en suspension de façon adéquate avant l’emploi. Resuspendez la résine ReliaPrep™ avec soin dans le flacon de réactif avant de la transférer pour la purification des échantillons.
L’échantillon contenait trop peu de leucocytes par millilitre de sang. Le rendement en ADN dépend du nombre de leucocytes dans le matériel de départ. Les échantillons avec un faible taux en leucocytes présenteront un moindre rendement en raison de la quantité réduite au départ.
Le volume initial de l’échantillon dépasse la capacité de traitement du système. Le ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA Isolation System a été optimisé pour purifier de l’ADN à partir de 1 à 10 ml de sang total. Le traitement d’échantillons de sang en dehors de cette plage recommandée peut entraîner une réduction du rendement en ADN et de sa concentration.
Si la limite de 10 ml est dépassée, les volumes de traitement nécessaires seront en excès du volume utile maximal des tubes de 50 ml. Le ReliaPrep™
Large Volume HT gDNA Isolation System a été optimisé pour des
échantillons de sang normaux provenant d’adultes en bonne santé, qui contiennent en général entre 4,5 × 10
6
et 1 × 10
7
leucocytes/ml. Des
échantillons de sang total contenant un taux plus élevé de leucocytes peuvent provoquer une capture plus lente de la résine ReliaPrep™ au cours de la purification, ce qui réduit le rendement.
L’utilisation réussie du ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA Isolation
System dépend de l’usage des réactifs appropriés dans l’ordre voulu.
Vérifiez si tous les réactifs ont bien été placés dans la position adéquate de l’appareil et s’ils ont été dilués correctement avant l’emploi.
Des nucléases ont été introduites au cours de la purification ou du maniement. Utilisez des récipients en plastique ou en verre sans nucléases.
Utilisez des cônes à filtre pour toutes les étapes de pipetage. Portez des gants à tout moment. Les nucléases éventuellement introduites après l’élution dégradent l’ADN. Pour protéger l’ADN élué contre les nucléases, sélectionnez l’option d’ajouter du tampon TE concentré à une concentration de 1X dans l’éluat final.
L’ADN était dégradé avant la procédure de purification. Si l’ADN était dégradé avant la purification, l’ADN résultant le sera également.
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6. Dépannage (suite)
Symptômes
Résine ReliaPrep™ dans l’éluat final
Médiocre pureté de l’ADN
Message d’erreur de l’appareil
Causes possibles et commentaires
Les solutions concentrées d’ADN peuvent être visqueuses. Il peut être nécessaire de prolonger le temps de capture de la résine ReliaPrep™ pour ces solutions visqueuses. Éliminez la résine résiduelle de l’ADN
élué en effectuant la centrifugation comme indiqué.
Une médiocre pureté de l’ADN, observée par les rapports spectroscopiques ou dans les analyses en aval, est souvent le résultat d’un retrait incomplet du lysat. Tout ajustement physique du système robotique peut influencer l’efficacité du retrait du lysat.
Contactez le service technique à l’adresse [email protected] avant de tenter d’ajuster le système robotique.
Si le système signale un volume insuffisant dans un bac de réactif, vérifiez que le type de bac utilisé est adéquat et ajoutez du réactif au bac.
Si vous observez d’autres erreurs, contactez le service technique de
Promega. Notez le message d’erreur précis et l’heure. Vous aurez besoin des fichiers de rapport détaillés EVOware
®
, enregistrés sous :
C:\ProgramData\Tecan\EVOware\AuditTrail\log. Les fichiers de rapport utilisent la convention de dénomination suivante :
EVO_aaaammjj_hhmmss.log (la date et l’heure correspondent à la création du fichier).
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7. Produits associés
PRODUIT
Appareil HSM 2.0
Solution de RNase A
Solution tampon TE 20X (pH 7,5)
Tecan Freedom EVO®-HSM Workstation
Protéase alcaline (Alkaline Protease, APA)
Tampon de lyse cellulaire (Cell Lysis Buffer, CLD)
Tampon de liaison (Binding Buffer, BBA)
Résine ReliaPrep™
Tampon de lavage préparé (Prepared Wash Buffer, WBC)
Solution de protéinase K (PK)
Eau sans nucléase
Tampon de lyse tissulaire (Tissue Lysis Buffer, TLA)
Bouteille pour éthanol à 50 %
CONDITIONNEMENT RÉF.
1 pièce
5 ml
25 ml
130 ml
1 400 ml
1 600 ml
115 ml
3 500 ml
23 ml
500 ml
1 000 ml
500 ml
1 pièce
A2715
A7974
A2651
Contacter Promega
A1721
A1731
A1741
A1752
A2681
A5051
P1197
P1199
A5091
A2691
© 2012, 2013 Promega Corporation. Tous droits réservés.
Wizard est une marque déposée de Promega Corporation. QuantiFluor et ReliaPrep sont des marques de commerce de
Promega Corporation.
EVOware et Freedom EVO sont des marques déposées de Tecan AG Corporation. NanoDrop est une marque déposée de
Thermo Fisher Scientific. TouchTools est une marque déposée de Tecan AG Corporation.
Tous les prix et toutes les caractéristiques sont sujets à modification sans avis préalable.
Les déclarations relatives aux produits sont sujettes à modification. Veuillez contacter le service technique de Promega ou consulter le catalogue en ligne de Promega pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits Promega.
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