4.B. Procédure de purification de l’ADN (suite)
Une fois toutes les informations saisies, le système commencera la procédure de purification. Il n’y aura plus d’autres informations à saisir jusqu’à la fin de la méthode, sauf en cas de problème au cours du transfert, de la détection des échantillons ou de l’aspiration sous vide. En cas de problème, reportez-vous à la section Traitement des erreurs du Manuel technique de l’appareil Tecan Freedom EVO
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-HSM Workstation, n o
TM402. Après l’élution, il vous sera demandé de centrifuger la plaque intermédiaire. Cette étape est nécessaire afin d’éliminer les particules de résines résiduelles présentes dans les éluats. Si vous avez choisi de laisser vos échantillons dans la plaque intermédiaire, ce message ne s’affichera pas, et la méthode sera alors terminée. À l’issue de la purification, le système vous demandera de retirer vos échantillons, d’éteindre la pompe à vide et de stocker les réactifs restants de la plateforme.
4.C. Étapes de purification
1.
Facultatif : transfert des échantillons à partir de tubes primaires.
2. Détection automatique du volume des échantillons et calcul du volume des réactifs. Le volume des réactifs utilisé pour les échantillons de moins de 3 ml est identique à celui utilisé pour 3 ml de sang.
3. Le HSM agite les échantillons à 500 tours/min lorsque chaque réactif est ajouté.
4. De la protéinase K (0,02 volume) est ajoutée à chaque tube.
5.
Facultatif : de la RNase A (0,02 volume) est ajoutée à chaque échantillon.
6. De la Protéase alcaline (0,125 volume) est ajoutée à chaque échantillon.
7. Un volume de Tampon de lyse est ajouté à chaque échantillon.
8. Après l’ajout de Tampon de lyse, les échantillons sont incubés à 65 °C pendant 30 minutes sous agitation à
500 tours/min, suivi par une période de 10 minutes d’agitation à 500 tours/min sans chaleur. Pendant ce temps, la résine ReliaPrep™ est maintenue en suspension par mélange intermittent avec un cône.
9. Du Tampon de liaison (1,2 volume) est ajouté à chaque échantillon.
10. La résine ReliaPrep™ est complètement remise en suspension, et 0,1 volume de résine est ajouté à chaque
échantillon. La liaison des acides nucléiques à la résine s’effectue en incubant les échantillons pendant
20 minutes sous agitation à 550 tours/min, puis la résine est recueillie à l’aide d’un aimant pendant
20 minutes.
11. Les déchets provenant de la lyse et de la liaison sont retirés de chaque tube. Ensuite, un volume de Tampon de lavage préparé compris entre 1 et 3 ml, en fonction du volume initial de l’échantillon, est ajouté à chaque tube. Cette étape est répétée jusqu’à ce que tous les déchets aient été éliminés de tous les tubes et le tampon de lavage ajouté.
12. Les échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 2 minutes.
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EP048 · Révisé 6/13
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4.C. Étapes de purification (suite)
13. Après agitation, les échantillons sont mélangés en pipetant pour disperser complètement la résine.
Ensuite, l’appareil ajoute, sous agitation, un volume supplémentaire de Tampon de lavage préparé compris entre 4,4 et 9 ml, en fonction du volume initial de l’échantillon. Les échantillons sont agités à
500 tours/min pendant 2 minutes, puis à 700 tours/min pendant 2 minutes de plus. Après cette étape, la résine est capturée pendant 3 minutes.
14. Les déchets du premier lavage sont éliminés de chaque tube, puis 1 ml de Tampon de lavage préparé est ajouté aux échantillons. Ensuite, l’appareil ajoute, sous agitation, un volume supplémentaire de Tampon de lavage préparé compris entre 4,4 et 9 ml, en fonction du volume initial de l’échantillon. Les échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 2 minutes, puis à 700 tours/min pendant 2 minutes de plus. Les
échantillons sont ensuite soumis à une capture magnétique pendant 3 minutes.
15. Les déchets du second lavage sont éliminés de chaque tube, puis un volume d’éthanol à 50 % compris entre 4,4 et 9 ml est ajouté aux échantillons, en fonction de leur volume initial. Les échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 4 minutes. Ils sont ensuite soumis à une capture magnétique pendant
3 minutes.
16. Tous les déchets sont éliminés colonne par colonne, et le volume calculé d’eau sans nucléases est ajouté à chaque tube. Les échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 3 minutes, puis à 400 tours/min pendant
15 minutes à 70 °C. Une capture magnétique est effectuée pendant 5 minutes, puis les éluats sont transférés
à la plaque intermédiaire.
17. Si l’option de transférer les échantillons dans une plaque ou des tubes finaux a été sélectionnée, un message s’affiche pour demander à l’utilisateur de centrifuger la plaque intermédiaire à 2 500 × g pendant
20 minutes afin d’éliminer les particules résiduelles.
18. La plaque intermédiaire est replacée dans l’appareil, puis les éluats sont transférés aux tubes finaux ou à la plaque finale.
19. La méthode est terminée.
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