4.C. Étapes de purification
1. Facultatif : transfert des échantillons à partir de tubes.
2. Vérification automatique du volume des échantillons et calcul du volume des réactifs.
3. Le HSM agite les échantillons à 500 tours/min lorsque chaque réactif est ajouté.
4. De la protéinase K (60 µl) est ajoutée à chaque tube.
5. Facultatif : de la RNase A (60 µl) est ajoutée à chaque échantillon.
6. De la Protéase alcaline (375 µl) est ajoutée à chaque échantillon.
7. Du Tampon de liaison (3 ml) est ajouté à chaque échantillon.
8. Après l’ajout de Tampon de lyse, les échantillons sont incubés à 65 °C pendant 30 minutes sous agitation à
500 tours/min, suivi par une période de 10 minutes d’agitation à 500 tours/min sans chaleur. Pendant ce temps, la résine ReliaPrep™ est maintenue en suspension par mélange intermittent avec un cône.
9. Du Tampon de liaison (3,6 ml) est ajouté à chaque échantillon.
10. La résine ReliaPrep™ est complètement remise en suspension, et un volume de 300 µl de résine est ajouté
à chaque échantillon. La liaison des acides nucléiques à la résine s’effectue en incubant les échantillons pendant 20 minutes sous agitation à 550 tours/min, puis la résine est recueillie à l’aide d’un aimant pendant
20 minutes.
11. Les déchets provenant de la lyse et de la liaison sont retirés de chaque tube. Après élimination des déchets,
1 ml de Tampon de lavage préparé est ajouté aux tubes. Cette étape est répétée jusqu’à ce que tous les déchets aient été éliminés de tous les tubes et le tampon de lavage ajouté.
12. Les échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 2 minutes.
13. Après agitation, les échantillons sont mélangés en pipetant pour disperser complètement la résine. Ensuite, l’appareil ajoute, sous agitation, un volume supplémentaire (4,3 ml) de Tampon de lavage préparé. Les
échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 2 minutes, puis à 700 tours/min pendant 2 minutes de plus.
Après cette étape, la résine est capturée pendant 3 minutes.
14. Les déchets du premier lavage sont éliminés de chaque tube, puis 1 ml de Tampon de lavage préparé est ajouté aux échantillons. Ensuite, l’appareil ajoute, sous agitation, un volume supplémentaire (4,3 ml) de Tampon de lavage préparé. Les échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 2 minutes, puis à 700 tours/min pendant
2 minutes de plus. Les échantillons sont ensuite soumis à une capture magnétique pendant 3 minutes.
15. Les déchets du deuxième lavage sont éliminés de chaque tube, puis un volume de 4,3 ml d’éthanol à 50 % est ajouté aux échantillons. Les échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 4 minutes. Les échantillons sont ensuite soumis à une capture magnétique pendant 3 minutes.
16. Tous les déchets sont éliminés colonne par colonne, et le volume calculé d’eau sans nucléases est ajouté à chaque tube. Les échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 3 minutes, puis à 400 tours/min pendant
15 minutes à 70 °C. Une capture magnétique est effectuée pendant 5 minutes, puis les éluats sont transférés
à la plaque intermédiaire.
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EP049 · Révisé 8/13
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