Analyse de HAP dans le saumon avec élimination améliorée de la matrice Note d’application Analyse alimentaire et agriculture, environnement Auteurs Extrait Derick Lucas and Limian Zhao Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont composés de cycles benzéniques fusionnés résistants à la dégradation. Ils peuvent se retrouver dans les espèces aquatiques en raison de l'accumulation dans l’environnement et par les méthodes de cuisson utilisant de la fumée. L’analyse des HAP dans des matrices complexes, à forte teneur en lipides, constitue un défi à cause des interférences provenant de la matrice qui sont co-extraites et qui nuisent à la quantification, mais également à cause des effets-matrices et de l’encrassement du système analytique. Agilent Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid (Élimination améliorée de la matrice lipidique) est un produit de préparation d’échantillons nouvelle génération, qui simplifie l’extraction en phase solide dispersive (dSPE) permettant d’éliminer la matrice de manière ultra-sélective sans affecter le rendement des analytes. L'étude présentée ci-après démontre l’efficacité de cette méthodologie de préparation d’échantillons pour l’analyse des HAP dans le saumon. La méthode est d’une grande exactitude (84 à 115 %) et d’une grande précision (RSD = 0,5 à 4,4 %) pour les 15 composés HAP à toutes les concentrations, et permet ainsi l’analyse rapide, rigoureuse et efficace d’échantillons à haute teneur en lipides. Agilent Technologies, Inc. Introduction Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des contaminants omniprésents dans l’environnement et sont généralement d'origine pétrogénique ou pyrogénique. Ils sont composés d’hydrogène et de carbone disposés en deux ou plus de cycles benzéniques fusionnés, et peuvent avoir des groupes substitués sur un ou plusieurs cycles [1]. Les préoccupations associées aux HAP viennent de leur persistance dans l’environnement et des effets toxiques, mutagènes et cancérigènes connus de certains d’entre eux sur les mammifères [2]. La contamination des produits de la mer peut survenir à la suite de l'accumulation de constituants du pétrole dans les eaux ou provenir de méthodes de cuisson introduisant des HAP en tant que sous-produits de combustion présents dans la fumée. [3,4]. C’est pourquoi il est essentiel que les analystes aient à leur disposition des méthodes rigoureuses et efficaces pour détecter la contamination par des HAP aux concentrations qui posent problème. La détection de HAP à faible concentration peut s’effectuer par GC/MS associée à une méthode de préparation d’échantillons rigoureuse et efficace. Les protocoles de préparation courants comprennent l’extraction Soxhlet [5], l’extraction assistée par ultrasons [6] et l’extraction par un solvant pressurisé [7]. La préparation peut être couplée à des traitements de l'échantillon tels que l’extraction en phase solide [8] ou la chromatographie par perméation sur gel [9]. Afin de s'affranchir de ces techniques qui exigent beaucoup de temps et de travail, des protocoles de type QuEChERS (Quick, Easy, Effective, Rugged and Safe) [10,11] ont également été mis en œuvre avec succès [12,13,14]. La préparation d’échantillons est de plus en plus importante pour les échantillons alimentaires complexes, et notamment ceux à haute teneur en lipides car la matrice co-extraite a des effets néfastes sur l’analyse en introduisant des interférences, et en provoquant des effetsmatrice et une pollution du système analytique. Tableau 1 : Conditions appliquées au système Agilent GC/MS utilisé pour l’analyse des HAP. GC : Passeur automatique d’échantillons : Volume d’injection : Gaz vecteur : Filtre à gaz : Injecteur : Débit de purge vers la fuite : Débit : Programme du four : Agilent 7890B Passeur automatique d’échantillons liquides Agilent 7693, seringue de 10,0 µl (G4513-80220) 0,5 µL Hélium, débit constant Filtre Gas Clean pour GC/MS, 1/8 pouce (réf. CP17974) MMI, mode d’injection à chaud sans division, 320 °C 50 mL/min à 0,75 min 2,0 mL/min 70 °C pendant 1 min, puis 25 °C/min jusqu’à 195 °C avec un palier de 1,5 min, puis 7 °C/min jusqu’à 315 °C Colonne : Agilent J&W DB-5ms UI, 20 m × 0,18 mm, 0,18 µm (réf. 121-5522UI) Restriction : Tube en silice désactivée, 0,65 m × 0,15 mm (réf. 160-7625-5) Backflush après analyse : 5 min à 315 °C, 70 psi pendant le backflush Pression aux. : 2 psi pendant l’analyse, 70 psi pendant le backflush MSD : MSD Agilent 5977 Mode : SIM Température de la ligne de transfert : 340 °C Température de la source : 325 °C Température du quad : 150 °C Délai du solvant : 3,5 min Agilent Bond Elut QuEChERS EMR — Lipid est un nouvel adsorbant qui élimine sélectivement les principales classes de lipides des échantillons sans perte des composés d'intérêt. L’élimination de différentes espèces de lipides est particulièrement importante pour les techniques comme QuEChERS, qui co-extraient de grandes quantités de matrice avec les analytes cibles. Traditionnellement, des adsorbants à base de C18 et PSA sont utilisés pour la purification des échantillons à haute teneur en lipides lors la phase d'extraction en phase solide dispersive (dSPE). Souvent cependant, ces adsorbants ne permettent pas d’obtenir une purification des échantillons adéquate et peuvent présenter des interactions non-sélectives avec les analytes. Le présent travail constitue une investigation de la préparation d’échantillons et de l’analyse de 15 HAP dans le saumon à l'aide d'une suite d'étapes simples et efficaces, permettant d’obtenir un niveau de propreté adéquat grâce à EMR — Lipid ainsi qu’une exactitude et une reproductibilité excellentes en GC/MS. Tableau 2 : Autres consommables et équipements Flacons : En verre ambré, à visser (réf. 5190-7041) Capsules pour flacons : Capsule à visser avec septum PTFE/silicone, 9 mm (réf. 5182-0717) Inserts de flacons : Verre, 150 µL, avec pieds en polymère (réf. 5183-2088) Septum : Longue vie, non-collant, 11 mm, 50/pk (réf. 5183-4761) Ferrules : Vespel:graphite, 85:15, 0,4 mm id (réf. 5181-3323), ferrules en métal souple UltiMetal Plus (réf. G3188-27501) Données expérimentales Insert d’injection : Simple rétreint, sans diviseur, Ultra Inert (réf. 5190-7041) L’analyse est effectuée sur des instruments Agilent 7890 GC et Agilent 5977 MSD équipés d’injecteurs multimodes (MMI), avec injecteur automatique d’échantillons liquides Agilent 7693, et une technologie de flux capillaire pour le backflush de la colonne. Le tableau 1 montre les paramètres de l’instrument et le tableau 2 montre les consommables et les autres pièces d’équipement utilisées pour ce travail. Technologie de flux capillaire (CFT) Union Ultimate Ultimetal Plus (réf. G3186-60580), raccord capillaire CFT (réf. G2855-20530) dSPE Bond Elut EMR — Lipid : 1 g dans un tube de 15 mL (réf. 5982-1010) Bond Elut Final Polish pour la solution : 2 g dans un tube de 15 mL (réf. 5982-0101) Broyeur Geno/Grinder, Metuchen, NJ, USA Centrifugeuse Centra CL3R, Thermo IEC, MA, USA Microcentrifugeuse Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY, USA Agitateur vortex et agitateurs vortex multitubes, VWR, Radnor, PA, USA Distributeur pour flacon, VWR, So. Plainfield, NJ, USA Pipettes Eppendorf 2 Préparation d’échantillons Réactifs et composés chimiques Le saumon homogénéisé et pesé (5 g) est introduit dans des tubes à centrifugeuse de 50 mL puis dopé selon les besoins avec des étalons et des étalons internes deutérés. Après ajout d’acétonitrile (ACN) (10 mL), l’échantillon est mélangé sur vortex pendant deux minutes. Les tubes sont centrifugés à 5 000 rpm pendant cinq minutes. Le surnageant (8 mL) est transféré dans un tube à centrifugeuse de 15 mL contenant 1 g d’adsorbant EMR — Lipid, agité au vortex immédiatement pour disperser la phase solide, puis pendant 60 secondes supplémentaires sur un plateau d’agitation. La suspension est ensuite centrifugée à 5 000 rpm pendant trois minutes. Tout le surnageant est transféré dans un tube de finition de 15 mL contenant 2,0 g de sels (1:4 NaCl:MgSO4), agité immédiatement sur vortex pour disperser la phase solide, puis centrifugé à 5 000 rpm pendant trois minutes. La couche supérieure d’ACN est transférée dans des flacons d’échantillons pour l’analyse GC/MS (Figure 1). Tous les réactifs et les solvants sont de grade HPLC ou supérieur. L’ACN provient de Honeywell (Muskegon, MI, USA) et l’eau est purifiée à l’aide d’un système intégral EMD Millipore Milli-Q (Darmstadt, Allemagne). Les étalons de HAP et les étalons internes sont achetés auprès d’Ultra-Scientific sous forme de solutions (North Kingstown, RI, USA). Des solutions mères de 100 µg/mL sont préparées dans de l’acétone, puis diluées dans des flacons ambrés pour obtenir les solutions de travail. Courbes d’étalonnage et quantification Des courbes d'étalonnage dans la matrice sont obtenues pour une plage d'étalonnage correspondant à 1, 10, 25, 50, 100, 250, 500 et 1 000 ng/g. Des blancs de préparation d'échantillon sont préparés en suivant le protocole d'extraction complet, à partir de saumon exempt des composés d'intérêt. Ensuite, 950 µL de blanc, 25 µLde solution de travail d'étalons et 25 µL de solution mère d'étalons internes sont mélangés pour constituer les standards de calibration dans la matrice. Les étalons internes sont ajoutés aux échantillons de saumon à tester avant la préparation d'échantillon et aux solutions de calibration après la préparation, à hauteur de 100ng/g. Toutes les courbes d'étalonnage présentent une linéarité exceptionnelle, avec R2 > 0,999 pour tous les composés. Les échantillons de saumon à tester sont dopés à des concentrations de 25, 100 et 500 ng/g avant l'extraction en six réplicats. Le logiciel Agilent MassHunter est utilisé pour quantifier les analytes cibles. Les valeurs d'exactitude sont mesurées en calculant la réponse des échantillons dopés par rapport aux étalons internes. Les valeurs de rendement absolu sont obtenues en mesurant la réponse des analytes pré-dopés par rapport à la courbe d'étalonnage sans correction par rapport étalons internes. Peser exactement 5 g d’un échantillon broyé dans un tube à centrifugeuse de 50 mL. Doper les échantillons de contrôle qualité uniquement avec l’étalon interne et les étalons marqués ; agiter au vortex pendant 1 min pour mélanger. Ajouter 10 mL d’acétonitrile. Refermer et agiter vigoureusement sur un agitateur mécanique pendant 2 minutes. Agiter au vortex et centrifuger. Transférer 8 mL de surnageant dans un tube dSPE EMR — Lipides. Agiter au vortex et centrifuger. Transférer le surnageant dans un tube de de finition EMR — Lipides. Agiter au vortex et centrifuger. Post-doper le blanc de matrice avec les étalons et l’étalon interne pour préparer les solutions d’étalonnage dans la matrice. Les échantillons sont prêts pour une analyse par GC/MSD. Figure 1 : Déroulement de la préparation d’échantillons pour l’analyse de HAP dans le saumon par Agilent Bond Elut EMR — Lipid avant l’analyse par GC/MS. 3 Une exactitude et une précision excellentes sont obtenues à des concentrations de dopage de 25, 100 et 500 ng/g en utilisant la procédure optimisée avec EMR-Lipide. La figure 3 montre que l’exactitude se situe entre 84 et 115 % pour tous les analytes à toutes les concentrations en utilisant la correction avec les étalons internes deutérés, ce qui donne une RSD de 0,5 à 4,4 % (Figure 4). Les données d’exactitude sont groupées par plage dans la figure 5 et montrent que la plupart des composés donnent des valeurs entre 90 et 120 %, avec deux composés légèrement en dessous de 90 % (indo[1,2,3-cd]pyrène et benzo[g,h,i]pérylène). Résultats et discussion Les instruments 7890 GC et 5977 GC/MSD montrent une excellente performance pour les 15 HAP et cinq étalons internes, en donnant des résultats homogènes et une très bonne sensibilité. La figure 2 montre la séparation obtenue pour les 15 HAP sur une colonne Agilent DB-5ms UI avec un pré-dopage de 25 ng/g dans un échantillon de saumon. Le chromatogramme montre une séparation avec un retour à la ligne de base pour les 15 HAP, ce qui est essentiel pour l’intégration exacte des paires d'isomères de HAP telles que phénanthrène/anthracène, benz[a]anthracène/chrysène, benzo[b]fluoranthène/benzo[k]fluroanthène. Les interférences mineures dans le chromatogramme sont facilement séparées des pics étudiés. ×105 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Signal Identification des pics 1. Naphtalène 2. Acénaphthylène 3. Fluorène 4. Phénanthrène 5. Anthracène 6. Pyrène 7. Benz[a]anthracène 8. Chrysène 9. Benzo[b]fluoranthène 10. Benzo[k]fluoranthène 11. Benzo[a]pyrène 12. Pérylène 13. Indo[1,2,3-cd]pyrène 14. Dibenz[a,h]anthracène 15. Benzo[g,h,i]pérylène 2 3 6 45 10 12 9 11 7 1 8 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Temps d’acquisition (min) 17 18 14 13 15 19 20 21 22 23 24 Figure 2 : Chromatogramme de GC/MS SIM de 15 HAP après pré-dopage de 25 ng/g dans du saumon. 25 ng/g 100 ng/g 25 ng/g 500 ng/g 100 ng/g 500 ng/g 5,0 140 4,5 120 4,0 100 3,5 3,0 80 2,5 60 2,0 40 1,5 1,0 20 0,5 0 Na Ac Ph én ph t ap alèn ht e hy lè F l ne P h uo én r èn an e t A n hr è n th ra e cè Be ne nz [a P y ]a n t r ène hr Be ac nz o[ C h ène Be b]f ry n z luo s è n o[ k] r a n e f lu t h or èn B e an e nz t h In o [ èn do a] py e [1 ,2 rè ,3 P ne Di be cd] ér y n z an lèn th [ e Be a,h] rac èn n z an o[ th r e g, h , ac è i] p ne ér y lè ne F l ne u én or èn an e t A n hr è t h ne ra cè Be ne nz [a P y ]a r n t ène hr Be ac nz o[ C h ène Be b]f ry n z luo s è n o[ k] r a n e f lu t h or èn B e an e nz t h In o [ èn do a] py e [1 ,2 rè , Di 3 - c Pé ne be d] r y n z an lèn th [ e Be a,h] rac èn n z an t o[ e g , hr a c h, i] p ène ér y lè ne hy ht ap én Ac Na ph ta lè lè ne 0 Figure 3 : Résultats d’exactitude pour 15 HAP dans du saumon à des concentrations de 25 ng/g, 100 ng/g et 500 ng/g. Figure 4 : Résultats de précision pour 15 HAP dans du saumon à des concentrations de 25 ng/g, 100 ng/g et 500 ng/g. 4 25 ng/g 100 ng/g dSPE EMR — Lipid 500 ng/g 12 Le saumon est choisi comme échantillon représentatif en raison de sa haute teneur en lipides par rapport aux autres produits de la mer. La procédure optimisée s’écarte d’un protocole QuEChERS type en plusieurs points, ce qui rationalise le déroulement des opérations et tire parti de l’étape de purification par dSPE EMR — Lipid. Tout d’abord, le saumon est extrait directement avec de l’ACN sans addition d’eau ou de sels d’extraction QuEChERS. Après centrifugation, le surnageant comporte de l’ACN et une petite quantité d’eau provenant de l’échantillon. Le surnageant est transféré dans le tube d’EMR — Lipid pour l’élimination de la matrice par dSPE. Enfin, le surnageant de dSPE est transféré dans un tube de finition contenant 2,0 g de NaCl/MgSO4 (1:4) pour obtenir la séparation des phases. La couche supérieure d’ACN est alors transférée dans des flacons pour analyse. Nombre d’analytes 10 8 6 4 2 0 <50 50-70 70-90 90-100 100-120 % d’exactitude par groupe >120 Figure 5 : Résultats d’exactitude groupés pour les HAP dans du saumon à des concentrations de 25 ng/g, 100 ng/g et 500 ng/g. Le rendement absolu est de 62 à 98 % sans utilisation d’étalons internes (Tableau 3). Deux composés, l'indo[1,2,3-cd]pyrène et le benzo[g,h,i]pérylène, donnent des rendements légèrement inférieurs à 70 %. Les rendements absolus pour les HAP diminuent avec l'augmentation de la masse moléculaire en raison de la baisse de solubilité dans l’ACN. Cependant, la plupart des rendements sont élevés et facilement corrigés à l’aide des étalons internes. Les rendements absolus des étalons internes sont également élevés, comme le montre le tableau 4. Malgré la limitation de solubilité dans l’ACN, cette méthode donne d’excellents rendements et des résultats extrêmement reproductibles pour les échantillons de saumon à haute teneur en lipides. Tableau 4 : Recouvrement absolu et précision (% RSD) pour les étalons internes dans du saumon (n = 6). Dopage de 100 ng/g Composé Rec. % RSD Naphtalène-d8 87,8 1,0 Acénaphtylène-d10 93,3 0,8 Phénanthrène-d10 94,9 0,8 Chrysène-d12 87,1 1,0 Perylène-d12 86,4 3,1 Moyenne 89,9 1,3 Tableau 3 : Liste des HAP utilisés dans cette étude avec l’exactitude, le rendement absolu et la déviation standard relative (RSD) dans du saumon (n = 6). Dopage de 25 ng/g Dopage de 100 ng/g Dopage de 500 ng/g Composé Exact. Rdt. % RSD Exact. Rdt. % RSD Exact. Rdt. % RSD Naphtalène 112,2 86,7 2,2 104,8 89,7 1,7 99,7 85,8 1,5 Acénaphtylène 107,1 90,1 1,8 97,6 89,9 1,8 97,3 90,6 0,9 Fluorène 105,3 94,6 1,2 105,0 94,2 1,2 104,6 96,2 0,9 Phénanthrène 112,3 95,3 1,2 101,0 94,1 1,4 99,4 94,5 1,1 Anthracène 103,1 91,6 0,8 98,9 90,7 1,3 98,3 92,6 1,0 Pyrène 105,8 97,6 2,9 97,1 88,9 1,8 95,4 89,7 1,0 Benz[a]anthracène 115,8 91,2 1,2 100,1 84,7 1,7 95,8 85,7 0,8 Chrysène 107,2 83,6 1,0 98,2 83,2 1,9 95,4 85,4 0,9 Benzo[b]fluoranthène 104,8 78,3 1,1 104,3 76,1 2,0 102,2 79,2 0,7 Benzo[k]fluoranthène 104,1 78,8 1,8 106,6 77,5 1,8 104,0 80,3 0,9 Benzo[a]pyrène 101,0 74,2 1,7 97,4 71,8 1,8 96,4 74,8 1,0 Pérylène 99,1 74,4 4,4 114,7 76,4 3,0 103,6 80,3 1,2 Indo[1,2,3-cd]pyrène 86,7 66,1 3,0 90,0 66,2 1,9 89,1 69,1 0,6 Dibenz[a,h]anthracène 94,7 73,9 1,3 99,7 72,2 2,2 99,0 76,2 0,5 Benzo[g,h,i]pérylène 86,4 64,7 1,8 84,7 62,3 2,0 85,6 66,3 0,7 Moyenne 103,0 82,7 1,8 100,0 81,2 1,8 97,7 83,1 0,9 5 Comme on retrouve typiquement avec les protocoles d’élimination améliorée de la matrice, cette approche tire profit d'une meilleure purification permettant ainsi d’utiliser un échantillon de plus grande taille, ce qui augmente la sensibilité globale de la méthode. Dans les protocoles conventionnels d’EMR — Lipid, de l'eau est ajoutée au tube de dSPE afin d'activer l'adsorbant. Pour le présent protocole optimisé, il s'avère que l’addition d’eau diminue la solubilité des HAP et affecte négativement certains rendements absolus. Par conséquent, le surnageant d’extraction est transféré directement vers un tube EMR-Lipides sans ajouter d’eau, ce qui permet une purification adéquate pour l’analyse par GC/MS SIM. Le mélange immédiat après ajout du surnageant aux tubes de dSPE et de finition met les solides en suspension pour assurer une interaction maximale avec l’adsorbant et éviter la formation d’agrégats. Pour une élimination optimale de la matrice, on peut ajouter de l’eau à la dSPE, et les rendements peuvent être efficacement corrigés avec les étalons internes afin d’avoir une exactitude et une précision excellentes. Conclusions Ce travail présente une méthode rapide et facile permettant de mesurer efficacement des concentrations faibles ou élevées de HAP dans des échantillons de saumon à haute teneur en lipides. Le protocole est aussi facile qu’avec QuEChERS mais met en œuvre le nouvel adsorbant dSPE EMR — Lipid pour minimiser l'extraction des lipides, optimiser le rendement et offrir un haut degré de précision. Bien que la teneur en lipides dans des matrices telles que le saumon varie de manière importante, Agilent Bond Elut EMR — Lipid est un adsorbant polyvalent pour l’élimination des lipides, qui n’interagit pas avec les analytes étudiés. L’élimination des lipides est optimisée en ajoutant de l’eau au tube EMR — Lipid à l’étape de dSPE. Cependant, dans le cas présent, l’eau ajoutée diminue la solubilité des HAP et par conséquent n'est pas souhaitable dans ce cas. Les études à venir continueront à optimiser EMR — Lipid pour les types d’échantillons et les applications difficiles afin d’élargir son utilité sur les systèmes de chromatographie et de détection actuels et de futures générations. Tableau 5 : Analytes cibles, temps de rétention, ion ciblé et désignations des étalons internes pour la méthode GC/MS SIM. GC/MS (SIM) Composé TR Ion ciblé Dwell (ms) Étalon interne Naphtalène 3,89 128,0 20 Naphtalène-d8 Acénaphtylène 5,37 152,0 20 Acénaphtylène-d10 Fluorène 6,05 166,0 20 Acénaphtylène-d10 Phénanthrène 7,25 178,0 20 Phénanthrène-d10 Anthracène 7,34 178,0 20 Phénanthrène-d10 Pyrène 10,31 202,0 20 Phénanthrène-d10 Benz[a]anthracène 13,83 228,0 20 Chrysène-d12 Chrysène 13,93 228,0 20 Chrysène-d12 Benzo[b]fluoranthène 16,99 252,0 20 Perylène-d12 Benzo[k]fluoranthène 17,08 252,0 20 Perylène-d12 Benzo[a]pyrène 17,85 252,0 20 Perylène-d12 Pérylène 18,09 252,0 20 Perylène-d12 Indo[1,2,3-cd]pyrène 20,72 276,0 20 Perylène-d12 Dibenz[a,h]anthracène 20,87 278,0 20 Perylène-d12 Benzo[g,h,i]pérylène 21,29 276,0 20 Perylène-d12 Naphtalène-d8 3,87 136,0 20 – Acénaphtylène-d10 5,52 162,0 20 – Phénanthrène-d10 7,22 188,0 20 – Chrysène-d12 13,86 240,0 20 – Perylène-d12 18,03 264,0 20 – Étalons internes 6 9. Références 1. Anon. Compendium Method T0-13A. 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Pour plus d’informations sur nos produits et services, consultez notre site Internet sur www.agilent.com/chem. 7 www.agilent.com/chem Agilent décline toute responsabilité en cas d’erreurs dans le présent document, ainsi qu’en cas de dommages fortuits ou consécutifs à la fourniture, aux performances ou à l’utilisation de ce matériel. Les informations, descriptions et spécifications de cette publication peuvent être modifiées sans préavis. © Agilent Technologies, Inc., 2015 Imprimé aux USA, le 30 juillet 2015 5991-6088FR ">
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