Cytiva™ CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi Traduit de l’anglais Introduction À lire avant de déballer ou d’utiliser le kit Ces instructions contiennent des informations importantes pour la manipulation, le déballage et la préparation en toute sécurité du Cytiva™ CD34+ HSC LNP kit, 100 μL. Avant d’utiliser ce produit, tous les utilisateurs doivent lire le présent document ainsi que le NanoAssemblr® Spark™ User Guide. Utilisation prévue Le Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL est destiné à la délivrance d'ARN dans des cellules souches hématopoïétiques humaines (CSH) stimulées. Ce kit est fourni comme un produit autonome devant être utilisé uniquement en association avec l’instrument Spark et les cartouches Spark. Les produits sont uniquement destinés à la recherche et ne peuvent pas être utilisés dans le cadre de procédures cliniques ou in vitro, ou à des fins diagnostiques ou thérapeutiques. Sécurité Pour une utilisation et une manipulation des produits en toute sécurité, se reporter à la fiche de données de sécurité (FDS) de chaque produit chimique utilisé dans la procédure. Scanner le code QR figurant sur l’emballage pour accéder à la FDS des composants. precisionnanosystems.com 1002515 Rev 1 Généralités Description Le Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL est un mélange de réactifs à base de nanoparticules lipidiques (NPL) qui est optimisé pour la délivrance d’ARN (tel que de l’ARNm de Cas9/ARNsg) dans des CSH stimulées. Les composants du kit Cytiva CD34+ HSC LNP sont utilisés avec l’instrument NanoAssemblrSpark pour produire des NPL-ARN. Le kit est disponible en deux versions. Les deux versions incluent des réactifs, mais une seule d’entre elles inclut des cartouches Spark. Voir Composants du kit, à la page 3. Cette méthode de délivrance non virale peut être intégrée à des flux de travail de culture de CSH standard. Le kit Cytiva CD34+ HSC LNP permet aux chercheurs d'établir une méthode évolutive et cliniquement pertinente pour la délivrance et l’édition de gènes ex vivo. Le kit est approprié pour être utilisé dans la découverte de médicaments, le criblage, et le développement de thérapies à base de CSH modifiées par un gène. Applications typiques • Délivrance d’ARN pour exprimer des protéines d’intérêt • Délivrance d’ARNm de nucléase à des fins de manipulation génétique, par exemple une invalidation génique par CRISPR/Cas. • Délivrance d’ARNsi pour une extinction génique transitoire Produits associés Les produits suivants peuvent être utilisés avec l’instrument NanoAssemblr Ignite™ ou Ignite+™ pour des applications à l’échelle préclinique. Produit Code produit Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 2 mL 1005000 Instrument NanoAssemblr Ignite NIN0001 Instrument NanoAssemblr Ignite+ 1001413 Documentation associée Document ID du document NanoAssemblr Spark User Guide sparksystem-UG-0420 Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 µL Workbook hsckitmrnaspark-WB-1223 RiboGreen Assay Protocol to Determine RNA Encapsulation Efficiency PNI-WB-S9-001-INT Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1 2 Document ID du document Genome Editing of CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells with Lipid Nanoparticles HSC-AN-1123 Accès à la documentation utilisateur en ligne Scanner le code QR ou consulter l’adresse precisionnanosystems.com/instructions. Composants du kit Introduction Le kit est disponible en deux versions, une qui inclut des cartouches Spark, et une qui n’en inclut pas. Les sections suivantes indiquent les noms des composants et les températures de stockage pour chaque version du kit. Kit Cytiva CD34+ HSC LNP (1003000) Étiquette Contenu Taille Stockage Lipid mix Mélange de lipides 100 µl -80 °C Formulation buffer type 1 Tampon de formulation 400 µl 2 °C à 8 °C Dilution buffer type 1 Tampon de dilution 1500 µl 2 °C à 8 °C Apolipoprotein-E3 (ApoE3) Apolipoprotéine-E3 (ApoE3) 100 µg -80 °C Kit Cytiva CD34+ HSC LNP avec cartouches (1004000) Étiquette Contenu Taille Stockage Lipid mix Mélange de lipides 100 µl -80 °C Formulation buffer type 1 Tampon de formulation 400 µl 2 °C à 8 °C Dilution buffer type 1 Tampon de dilution 1500 µl 2 °C à 8 °C Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1 3 Étiquette Contenu Taille Stockage Apolipoprotein-E3 (ApoE3) Apolipoprotéine-E3 (ApoE3) 100 µg -80 °C 5 unités 15 °C à 25 °C Cartouches NanoAssemblrSpark Date d’expiration Se reporter à l’emballage des composants individuels. Capacité du kit Le kit contient du matériel suffisant pour la préparation d’au moins 5 formulations de nanoparticules lipidiques, chacune contenant 10 µg d’ARN. Matériel requis Matériel requis fourni par Precision NanoSystems Produit Code produit Instrument NanoAssemblrSpark NIS0001 Cartouches NanoAssemblrSpark Paquet de 20 : NIS0009 Paquet de 80 : NIS0013 Matériel requis fourni par l’utilisateur Pour préparer les NPL-ARN avec le kit Cytiva CD34+ HSC LNP, l’équipement, les consommables et les réactifs suivants sont requis. • • • • • • • • • • • Lecteur de plaques en fluorescence Bloc chauffant ou étuve capable de chauffer à 55 °C Étuve, capable de chauffer à 37 °C Spectromètre UV Agitateur vortex Tubes de 0,5 à 2 ml avec capuchon à vis et joint torique Micropipettes et cônes de pipette exempts de RNase - 10, 20 et 200 µl Plaques à 96 puits à fond noir Quant-iTRiboGreen Assay Kit Triton X-100 Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X, sans calcium et magnésium Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1 4 • Eau de qualité biologie moléculaire (exempte de RNase/DNase et d’endotoxines) • Isopropanol à 70 % • Solution de décontamination des RNases Vue d’ensemble du flux de travail Cette section décrit le flux de travail pour préparer des NPL-ARN sur l’instrument Spark, y compris la préparation de la solution d’ARN, la manipulation de l’instrument et la préparation des NPL. Un flux de travail typique utilisant un kit Cytiva CD34+ HSC LNP kit est indiqué dans le tableau ci-dessous. Phase Action Description 1 Remplissage du Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Workbook Calculer la consommation en réactifs et préparer le matériel 2 Préparation de l’espace de travail et de l’instrument Décongeler les réactifs et les matériels, étiqueter les flacons et paramétrer l’instrument Spark 3 Préparation de la solution d’ARN Préparer la solution de travail d’ARN en combinant la charge utile d’ARN et le tampon de formulation inclus 4 Formulation des NPL-ARN Formuler les NPL sur l’instrument Spark 5 Quantification de l’ARN chargé Quantifier l’ARN encapsulé à l’aide de l’essai RiboGreen 6 Traitement des CSH par les NPL Ajouter les NPL-ARN aux cellules Remplissage de la feuille de calcul Le Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Workbook est un outil permettant de calculer les paramètres et les volumes pour la formulation des NPL sur l’instrument Spark Le Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Workbook est également appelé Feuille de calcul dans le présent document. La Feuille de calcul est disponible sur Internet. Voir Accès à la documentation utilisateur en ligne, à la page 3. La feuille de calcul est divisée en deux sections pour tenir compte des deux applications indiquées cidessous, et l’utilisateur doit uniquement remplir les entrées sous l’en-tête de section pertinent : 1 2 1. Pour l’expression d’ARNm Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1 5 2. Pour l’édition par CRISPRCas9 (avec l’ARNm de Cas9 et un ARNsg) À l’étape 1, l’utilisateur doit saisir les valeurs des paramètres indiqués ci-dessous. Les valeurs recommandées pour ces paramètres sont indiquées dans le tableau. Paramètre Description Valeur recommandée Stock mRNA concentration (mg/ mL)1 Concentration de la solution mère d’ARNm Déterminée par l’utilisateur Stock Cas9 mRNA concentration (mg/ mL)2 Concentration de la solution mère de Cas9 Déterminée par l’utilisateur Stock sgRNA concentration (mg/ mL)2 Concentration de la solution mère d’ARNsg Déterminée par l’utilisateur Cas9 to sgRNA ratio (wt.)2 Rapport en poids de l’ARNm de Cas9 sur l’ARNsg (X:1) 1 Samples (number of replicate LNPs) Nombre de réplicats d’échantillons de NPL Déterminée par l’utilisateur Remarque : Une concentration mère d’ARNsg couramment utilisée est de 100 µM ou approximativement 3,2 mg/ml pour les produits de recombinaison de synthèse. 1 Pour l’expression d’ARNm uniquement 2 Pour l'édition par CRISPRCas9 uniquement Préparation de l’espace de travail et de l’instrument Il est important de maintenir la stérilité de l’ensemble du matériel et d’effectuer tous les travaux dans l’enceinte de sécurité biologique (ESB). Les cellules souches hématopoïétiques sont particulièrement sensibles aux pyrogènes, tels que les endotoxines, et ce même à des taux minimalement détectables. Suivre les étapes ci-dessous pour préparer l’espace de travail et l’instrument Spark. Étape Action 1 Mettre sous tension et nettoyer l’enceinte de sécurité biologique (ESB) en l’essuyant avec de l’isopropanol à 70 % et une solution de décontamination des RNases. 2 Paramétrer l’instrument Spark dans l’ESB. Pour obtenir des instructions détaillées sur l’installation et l’utilisation, se reporter au NanoAssemblr Spark User Guide. Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1 6 Étape Action a. Essuyer l’instrument avec de l’isopropanol à 70 %. b. Raccorder l’instrument à une prise électrique mise à la terre. c. Mettre l’instrument sous tension. 3 Récupérer l’aliquote ou les aliquotes d’ARN congelée(s) puis la/les décongeler sur de la glace. Toujours conserver l’ARN sur de la glace afin d’empêcher toute dégradation du matériel. 4 Décongeler le mélange de lipides à 55 °C pendant 5 minutes dans un bain à billes ou un bloc chauffant. Après la décongélation, conserver le mélange de lipides à température ambiante. Conserver le flacon fermé pour empêcher toute évaporation. 5 Agiter le mélange de lipides au vortex pour garantir une parfaite homogénéité. Centrifuger dans une microcentrifugeuse pendant 3 à 5 secondes. 6 Placer les éléments suivants dans l’ESB : Sur de la glace : À température ambiante : • Aliquote(s) • Instrument Spark et cartouches • Les composants du kit : mélange de lipides, tampon de d’ARN formulation et tampon de dilution • Trois tubes de 0,5 ml pour chaque échantillon de NPL, étiquetés de manière appropriée pour le matériel suivant : - Solution d’ARN : un tube pour préparer la solution aqueuse d’ARN - Échantillon RiboGreen : un tube de collecte pour une petite aliquote de NPL-ARN afin de réaliser l’essai RiboGreen (~20 à 25 μL) - Échantillon final : un tube de collecte pour l’échantillon de NPL-ARN, pour les NPL-ARN restantes pour la culture cellulaire (~150 μL) • Micropipettes de 20 μl et 200 µl et cônes de pipette stériles 7 Dans le menu de l’instrument, appuyer sur Purge, puis appuyer sur le bouton physique de l’instrument Spark. Résultat : L’instrument est purgé pour éliminer l’air piégé. 8 Appuyer sur Formulation dans l’interface utilisateur. 9 À l’invite, paramétrer l’instrument avec le réglage de pression 3. Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1 7 Préparation de la solution d’ARN Introduction Cette section décrit la procédure de préparation de la solution d’ARN. Il existe deux procédures différentes en fonction du type d’ARN. Avant de commencer, mesurer la concentration de la ou des solution(s) mère d’ARN par UV-Vis afin de s’assurer que la concentration est bien celle prévue. Préparation d’ARNm pour une délivrance à un seul composant Étape Action 1 Pipeter les volumes de tampon de formulation (1) et d’eau de qualité biologie moléculaire (2) indiqués à l’étape 2 de la Feuille de calcul dans un tube pour la solution d’ARN. 1 2 3 2 Bien mélanger. 3 Pipeter les volumes d’ARNm (3) indiqués à l’étape 2 de la Feuille de calcul dans le tube de solution d’ARN. Conserver la solution mère d’ARN sur de la glace jusqu’à utilisation. Préparation d’ARNm pour une délivrance à deux composants Étape Action 1 Pipeter les volumes de tampon de formulation (1) et d’eau de qualité biologie moléculaire (2) indiqués à l’étape 2 de la Feuille de calcul dans un tube pour la solution d’ARN. 1 2 3 4 2 Bien mélanger. Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1 8 Étape Action 3 Pipeter les volumes d’ARNm de Cas9 (3) et d’ARNsg (4) indiqués à l’étape 2 de la Feuille de calcul dans le tube de solution d’ARN. Conserver la solution mère d’ARN sur de la glace jusqu’à utilisation. Formulation de NPL-ARN Suivre les étapes ci-dessous pour formuler les NPL-ARN sur l’instrument Spark. Étape Action 1 Dans l’ESB, ouvrir le paquet contenant la cartouche Spark et le couvercle associé. 2 À l’aide d’une micropipette, remplir lentement le puits 1 de la cartouche Spark avec le tampon de dilution. Veiller à positionner la pipette conformément à la position de la pipette illustrée cidessous pour éviter toute formation de bulles à proximité de l’ouverture du canal. 3 Remplir le puits 2 de la cartouche avec la solution d’ARN précédemment préparée. Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1 9 Étape Action 4 Remplir le puits 3 de la cartouche avec le mélange de lipides. Immédiatement après utilisation, veiller à bien reboucher le flacon de mélange de lipides pour réduire le risque d'évaporation de cette solution à base d'éthanol. 5 Fermer la cartouche immédiatement pour éviter toute évaporation d’éthanol. 6 Insérer la cartouche fermée contenant les réactifs préparés dans l’instrument Spark. 7 Paramétrer et démarrer le cycle comme décrit dans le Spark User Guide. 8 Appuyer sur le bouton physique de l’instrument Spark pour formuler les NPL-ARN. Collecte de l’échantillon de NPL-ARN formulé Suivre les étapes ci-dessous une fois l’étape de formulation terminée sur l’instrument Spark. Étape Action 1 À l’invite de l’instrument, retirer la cartouche Spark de l’instrument. 2 Soulever le couvercle de la cartouche avec précaution. 3 À l’aide d’une micropipette, prélever la solution de NPL-ARN dans le puits 1 de la cartouche, puis l’ajouter au tube de microcentrifugation stérile de 0,5 ml pour l’échantillon final. 4 Ajouter 96 µl de tampon de dilution aux NPL-ARN formulées et pipeter de haut en bas pour mélanger minutieusement. Remarque : Cette étape de dilution à 1:1 stabilise les NPL. 5 Aliquoter 25 µl de NPL-ARN dans le tube pour l’échantillon RiboGreen. 6 Déterminer la concentration en ARN des NPL à l’aide de l’essai RiboGreen. Se reporter au RiboGreen Assay Protocol to Determine RNA Encapsulation Efficiency , disponible sur Internet, pour obtenir des instructions détaillées. Voir Accès à la documentation utilisateur en ligne, à la page 3. Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1 10 Les NPL-ARN sont désormais prêtes à être utilisées. Conserver l’échantillon à 4 °C et l’utiliser pour le traitement cellulaire dans un délai d’une (1) semaine au maximum. Traitement des CSH par les NPL Vue d’ensemble L’illustration ci-dessous représente un schéma fonctionnel du flux de travail de la culture cellulaire des CSH et du traitement par les NPL. Les moments temporels suggérés dans le flux de travail sont basés sur des modèles expérimentaux d’invalidation de CD45 et CD33. Se reporter au document Genome Editing of CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells with Lipid Nanoparticles pour plus de détails. Purification et stimulation Traitement par les NPL pour l’édition génique Ensemencement d’UFC Détection de l’invalidation Comptage des UFC Jour ~3-5 Jour 8 14 jours après l’ensemencement LNPs CD34+ cells Jour 0 Jour 1 Recommandations pour la culture cellulaire Pour obtenir une efficacité de transfection optimale des NPL, tenir compte des paramètres essentiels suivants : • Dosage des NPL-ARN : il est recommandé d’effectuer une titration complète de la dose pour chaque charge utile afin d’identifier la dose optimale. Une charge utile peut être, par exemple, une construction d’ARN guide unique différente. La plage recommandée pour la dose de titration peut aller de 0,2 à 20 µg d’ARN total par million de cellules traitées. • Pratique stérile : maintenir un environnement de travail stérile lors de la manipulation des cellules et des NPL. Les opérateurs doivent être dûment formés à la technique stérile appropriée avant de travailler dans l’enceinte de sécurité biologique. • Décongélation et expansion des cellules : les CSH CD34+ cryoconservées doivent être stimulées pendant 24 heures après la décongélation (avant l’ajout des NPL). • Densité cellulaire : une densité d’ensemencement de 0,1 à 0,5 million de cellules/ml est recommandée pour le traitement des NPL. Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1 11 • Temps de traitement des NPL : le temps d’incubation après la transfection des NPL dépend des caractéristiques de la charge utile d’ARN, par exemple de la cinétique d’expression et de la stabilité. Un traitement de 24 à 96 heures est recommandé, avec une optimisation supplémentaire si nécessaire. • Milieux de culture cellulaire : le kit Cytiva CD34+ HSC LNP montre une performance optimale dans des milieux exempts de sérum. Un milieu de culture cellulaire contenant une faible concentration de sérum (≤ 1 %) au moment de l'ajout des NPL peut être acceptable, mais doit être validé de manière expérimentale. En outre, l’utilisation d'un milieu exempt de sérum est recommandée pour une rétention optimale du caractère souche et d’un phénotype greffable (CD34+ CD38CD90+ CD133+). Procédure de traitement par des NPL Les étapes ci-dessous offrent une vue d’ensemble de la procédure de traitement par des NPL. Se reporter au document Genome Editing of CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells with Lipid Nanoparticles pour obtenir un exemple de flux de travail détaillé, qui a été optimisé pour le traitement de CSH par des NPL, ainsi que des conseils pour la résolution des problèmes. Voir la Documentation associée, à la page 2. Étape Action 1 Décongeler ou isoler les CSH CD34+. 2 Diluer les cellules à 0,1 à 0,5 million de cellules/ml dans un milieu de culture cellulaire. 3 Le jour suivant, juste avant le traitement par les NPL, ajouter de l’ApoE aux cellules de la manière suivante : a. Préparer une solution mère d’ApoE à 0,1 mg/ml en diluant les 100 µg d’ApoE inclus avec 1 ml de PBS 1X sans calcium ou magnésium. Conserver en aliquotes à -80 °C pendant 2 mois au maximum pour éviter les cycles de congélation/décongélation. b. Ajouter la solution mère d’ApoE aux cellules pour obtenir une concentration finale de 1 µg/ml (dilution à 1:100 de la solution mère à 0,1 mg/ml). c. Mélanger minutieusement par trituration. 4 Ensemencer les cellules dans un récipient de culture ou une plaque multipuits. 5 Ajouter les NPL formulées directement aux cellules ensemencées. 6 Incuber à 37 °C dans du CO2 à 5 %. 7 Effectuer une analyse en aval pour évaluer l’efficacité de la transfection, par exemple via une cytométrie en flux ou un essai d’unités formant colonies. Informations de commande Pour obtenir les informations les plus récentes, consulter le site precisionnanosystems.com. Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1 12 Nom Code produit Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL 1003000 Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL avec cartouches 1004000 Instrument NanoAssemblr Spark NIS0001 Cartouches NanoAssemblr Spark, paquet de 20 NIS0009 Cartouches NanoAssemblr Spark, paquet de 80 NIS0013 Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 2 mL 1005000 Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1 13 Page laissée intentionnellement vide precisionnanosystems.com Ignite, Ignite+, NanoAssemblr et Spark sont des marques de commerce de Precision NanoSystems. Cytiva est une marque de commerce de Life Sciences IP Holdings Corporation ou de l’une de ses sociétés affiliées opérant sous le nom de Cytiva. Triton est une marque de commerce de Union Carbide Corporation. RiboGreen et Quant-iT sont des marques de commerce de Thermo Fisher Scientific. Toute autre marque commerciale tierce est la propriété de son détenteur respectif. © 2024 Precision NanoSystems Pour les coordonnées des bureaux locaux, visiter le site precisionnanosystems.com 1002515 Rev 1 V:4 04/2024 ">
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