GUIDE COMPLÉMENTAIRE VetMAX™ PRRSV EU & NA 3.0 Kit Protocoles de purification d’ARN à utiliser avec le kit (Réf. A57016) Référence catalogue A57016 Pub. nº MAN0029414 Rév. B AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de protection, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse suivante : thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité concernant les risques biologiques sur la page du produit à l’adresse thermofisher.com. Porter des gants, des vêtements et des lunettes de protection appropriés. Espèces Échantillons Type de test • Sérum • Sang total Porc • Semences • Tissus Individuel ou en mélange[1] • Fluides oraux • Fluides de soins [1] ■ ■ ■ ■ ■ ■ Mélanger jusqu’à cinq échantillons pour les échantillons de sérum, de sang total ou de semences. Objectif de ce guide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Sélection de l’échantillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Stockage de l’échantillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Matériel requis, mais non fourni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Purification de l’ARN avec le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Annexe A Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL ■ ■ Matériel requis, mais non fourni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Procédure de purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Annexe B Documentation et support ■ ■ Assistance à la clientèle et support technique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Garantie limitée du produit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Pour usage en laboratoire. Objectif de ce guide Ce guide décrit les méthodes de purification d’ARN à partir d’échantillons (sérum, sang total, semences, tissu, fluides oraux et fluide ™ de soins) à l’aide du MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit. Les méthodes ont été validées et optimisées pour une utilisation ™ ultérieure avec le VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit (N° Cat. A57016). Sélection de l’échantillon Type d’échantillon Type d’analyse Quantité Sérum ou sang total Individuel ou en mélange 200 µl Semences Individuel ou en mélange 300 µl Individuel 20 à 30 mg Fluides oraux N/A[1] 300 µl Fluides de soins N/A[1] 200 µl Tissus [1] Un mélange d’animaux ou d’échantillons différents est utilisé pour ce type d’échantillon. Stockage de l’échantillon Type d’échantillon Sérum (dans un tube sec) Sang total (dans un tube EDTA) Semences Stockage Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours maximum). Après utilisation ou expiration du délai de 8 jours, conserver les échantillons en dessous de -16°C pendant 1 an au maximum ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Conserver les échantillons selon le type de semences à tester : • Pour les semences fraîches, conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours maximum). • Pour les semences commerciales, conserver les échantillons selon les recommandations du fournisseur. Tissus Après l’échantillonnage, conserver les échantillons de tissu entre 2°C et -8°C si l’analyse est effectuée dans les 24 heures suivant le prélèvement. Après utilisation ou à expiration du délai de 24 heures, conserver les échantillons en dessous de -16°C pour une conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Fluides oraux Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 7 jours maximum). Après utilisation ou expiration du délai de 7 jours, conserver les échantillons en dessous de -16°C pendant 1 an au maximum ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Fluides de soins Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours maximum). Après utilisation ou expiration du délai de 8 jours, conserver les échantillons en dessous de -16°C pendant 1 an au maximum ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. 2 ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit Matériel requis, mais non fourni Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. Les références catalogue qui s’affichent sous forme de liens ouvrent les pages Web de ces produits. Tableau 1 Matériel requis pour toutes les méthodes de préparation des échantillons Article Source Instrument et équipement L’un des instruments suivants : • KingFisher™ Flex Purification System Contacter un représentant commercial local. • MagMAX™ Express‑96 Magnetic Particle Processor Voir page 13 pour découvrir les autres instruments compatibles. Micropipettes de précision (gamme de 1 µl à 1 000 µl) avec embouts à filtre sans nucléase et résistant aux aérosols PFL Agitateur de laboratoire, vortex ou équivalent PFL Centrifugeuse de paillasse pouvant atteindre 15 000 × g (pour tubes de 1,5 ml et 2 ml) PFL Bloc chauffant à 70°C (requis pour la méthode Semences) PFL Consommables Consommables pour les instruments KingFisher™ Flex et MagMAX™ Express-96 : • KingFisher™ 96 Deep-Well Plate • 95040450 • KingFisher™ 96 KF microplates • 97002540 • KingFisher 96 tip comb for deep-well magnets • 97002534 ™ Microtubes sans DNase / RNase de 1,5 ml et 2 ml PFL Adhesive PCR Plate Foils, ou équivalent AB0626 Réservoir de réactifs PFL Kits et réactifs MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit A32700 ou A32702 Provenant du VetMAX™ PRRSV EU & NA 3.0 Kit 5 – IPC PRRSV 3.0 Solution saline tamponnée au phosphate (PBS (1X), pH 7.4) PFL Eau sans DNase / RNase (pour les échantillons de contrôle d’extraction négatif) PFL Tableau 2 Matériel supplémentaire requis pour la méthode Simple (échantillons de tissu uniquement) Source Article Broyeur à billes parmi les modèles suivants ou équivalents : • Fisherbrand™ Bead Mill 24 Homogenizer (recommandé) • Mixer Mill MM 400 (Verder 207450001) • Fisher Scientific™ 15-340-163 • Fisher Scientific™ 08418241 PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) Fisher Scientific™ 11-312-10A Balance de précision PFL Scalpels et pinces métalliques (stériles) PFL Tableau 3 Équipement en option Article Biotang Inc Microplate Shaker, ou agitateur de plaques équivalent (pour mélanger les billes avec les échantillons) Centrifugeuse de paillasse avec adaptateurs pour plaques (pour la préparation du lysat dans les plaques) ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit Source Fisher Scientific™ 50-751-4965 PFL 3 Purification de l’ARN avec le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) Suivre cette procédure si les instruments suivants sont utilisés : ™ • KingFisher Flex ™ • MagMAX Express-96 Suivre l’Annexe A, “Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL” si les instruments suivants sont utilisés : ™ • KingFisher Duo Prime ™ • KingFisher mL Méthode Suivre la méthode appropriée en fonction de votre type d’échantillon. • Purification de l’ARN à partir de sérum, de sang total, de tissu ou de fluides de soins (méthode Simple) (page 7) • Purification de l’ARN à partir de fluides oraux (méthode Complexe) (page 9) • Purification de l’ARN à partir de semences (page 11) Purification de l’ARN à partir de sérum, de sang total, de tissu ou de fluides de soins (méthode Simple) Préparation des plaques (page 7) Préparation du mélange Beads/PK (page 7) Préparation de la solution Lysis/Binding/IPC (page 7) Préparation de l’échantillon (page 8) Mélange de l’échantillon avec le mélange Beads/PK et la solution Lysis/Binding/IPC (page 8) Traitement des échantillons dans l’instrument (page 8) 4 ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit Purification de l’ARN à partir de fluides oraux (méthode Complexe) Préparation des plaques (page 9) Préparation du mélange Beads/PK (page 9) Préparation de la solution Lysis/IPC (page 9) Préparation du lysat clarifié (page 10) ™ Combinaison du lysat clarifié avec le mélange Beads/PK et MagMAX CORE Binding Solution (page 10) Traitement des échantillons dans l’instrument (page 10) Purification de l’ARN à partir de semences Préparation des plaques (page 11) Préparation du mélange PK (page 11) Traitement des échantillons avec le mélange PK (page 11) Combinaison des échantillons avec le mélange Binding/Beads/IPC (page 12) Traitement des échantillons dans l’instrument (page 12) Instructions • Avant utilisation, retourner les bouteilles de solutions et de tampons pour bien les mélanger. • Mélanger les échantillons avec les réactifs en utilisant un agitateur de plaques ou par aspiration-refoulement. ™ Remarque : Ne pas utiliser d’agitateur de plaques avec les barrettes de tubes requises par l’instrument KingFisher mL. • Pour éviter toute contamination croisée : – Couvrir la plaque ou la barrette de tubes pendant les étapes d’incubation et d’agitation, pour éviter tout débordement. – Pipetter avec précaution les réactifs et les échantillons pour éviter les éclaboussures. • Pour éviter toute contamination par les nucléases : – Porter des gants de laboratoire pendant les procédures. Les gants vous protègent des réactifs, et ils protègent l’acide nucléique des nucléases présentes sur la peau. – Utiliser des embouts de pipettes exempts d’acide nucléique pour manipuler les réactifs, et éviter de mettre des embouts utilisés dans les récipients de réactifs. – Décontaminer les paillasses de laboratoire et les pipettes avant de commencer. ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 5 Avant la première utilisation du kit (Optionnel) Déterminer les paramètres optimaux du broyeur à billes ™ Nous recommandons l’utilisation de Fisherbrand Bead Mill 24 Homogenizer pour un rendement maximal en acides nucléiques. Si un autre instrument est utilisé, suivre les directives du fournisseur pour déterminer les paramètres de vitesse et de temps pour obtenir une lyse de cellules suffisante. Déterminer le réglage maximal de l’agitateur de plaques Si un agitateur de plaques est utilisé, suivre les étapes suivantes pour déterminer le réglage maximal. 1. Vérifier que la plaque est bien fixée sur l’agitateur. 2. Ajouter 1 ml d’eau dans chaque puits de la plaque, puis couvrir avec une feuille adhésive. 3. Déterminer le réglage maximal qu’il est possible d’utiliser avec l’agitateur afin d'éviter les projections d'eau sur la feuille adhésive. Choisir le script approprié Tableau 4 Scripts selon le type d’échantillon et la méthode Type d’échantillon Méthode Standard Express (avec ou sans étape d’élution chauffée) (sans étape d’élution chauffée) Recommandé Autre possibilité Autre possibilité Recommandé Sérum Sang total Simple Tissus Fluides de soins Fluides oraux Complexe Recommandé Autre possibilité Semences Semences Autre possibilité Recommandé Télécharger et installer le script ™ Le script approprié au MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit doit être installé sur l’instrument avant sa première utilisation. ™ IMPORTANT ! En cas d’utilisation de l’instrument KingFisher Apex, contacter le support technique pour télécharger le script. ™ 1. Sur la page produit du MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit sur Internet (sur thermofisher.com, effectuer une recherche à partir de la référence catalogue), aller dans la section Documents. 2. Localiser et télécharger la dernière version du fichier approprié, puis télécharger la dernière version du script MagMAX_CORE pour votre instrument. Tableau 5 Scripts pour l’instrument Nom du script Instrument KingFisher™ Flex Script standard Script standard Script express (sans étape d’élution chauffée) (avec étape d’élution chauffée) (sans étape d’élution chauffée) MagMAX_CORE_Flex_no_heat.bdz MagMAX_CORE_Flex.bdz MagMAX_CORE_Flex_Express.bdz KingFisher 96 ™ MagMAX_CORE_KF-96_no_heat.bdz MagMAX_CORE_KF-96.bdz MMC_KF96_Express.kf2 KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO_no_heat.bdz MagMAX_CORE_DUO_Express.bdz KingFisher™ mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz MagMAX™ Express-96 MagMAX_CORE_DUO.bdz N/A MagMAX_CORE_mL_Express.bdz 3. Se référer au guide de l’utilisateur de l’instrument ou contacter le support technique pour connaître les instructions d’installation du script. 6 ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit Purification de l’ARN à partir de sérum, de sang total, de tissu ou de fluides de soins (méthode Simple) 1 ™ ™ 1. Préparer les plaques sur l’instrument KingFisher Flex ou MagMAX Express-96. Préparation des plaques Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Volume par puits Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque. ID de la plaque [1] Position sur l’instrument. Remarque : Pour configurer les plaques ou les barrettes de tubes pour le traitement pour ™ ™ l’instrument KingFisher Duo Prime ou KingFisher mL, voir page 12. 2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées pour le traitement avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. 2 Préparation du mélange Beads/PK Nous vous recommandons de préparer un nouveau mélange Beads/PK à chaque série. Si nécessaire, vous pouvez stocker le mélange Beads/PK à 4°C pendant un maximum de 1 semaine. ™ 1. Vortexer vigoureusement les MagMAX CORE Magnetic Beads pour s’assurer que les billes sont complètement resuspendues. 2. Mélanger les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons plus 10 % d’excédent. Composant 3 Volume par échantillon MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 µl MagMAX™ CORE Proteinase K 10 µl Mélange Beads/PK total 30 µl 1. Combiner les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons plus 10 % d’excédent. Préparer la solution Lysis/Binding/IPC Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Lysis Solution 350 µl MagMAX™ CORE Binding Solution 350 µl 5 – IPC PRRSV 3.0[1] 2 µl Volume total de la solution Lysis/Binding/IPC 702 µl [1] Fourni avec VetMAX™ PRRSV EU & NA 3.0 Kit. 2. Mélanger en retournant le tube ou la bouteille au moins 10 fois. (Facultatif) Conserver la solution Lysis/Binding/IPC à température ambiante pendant 24 heures maximum. ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 7 4 Préparation de l’échantillon Préparer les échantillons selon le type d’échantillon. Type d’échantillon • Sérum Action Procéder avec 200 µl d’échantillon. • Sang total • Fluides de soins a. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml : • tissu : 20 à 30 mg Tissu • PBS (1X), pH 7,4 : 1 ml ™ • PYREX Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) : 2 billes b. Broyer (les agiter avec les billes) les échantillons. ™ • Fisherbrand Bead Mill 24 Homogenizer : 6 m/s pendant 45 secondes • Mixer Mill MM 400 : 30 Hz pendant 5 minutes Remarque : Si un autre broyeur à billes est utilisé, voir “(Optionnel) Déterminer les paramètres optimaux du broyeur à billes” en page 6. c. Centrifuger à 1 000 x g pendant 1 minute. d. Procéder avec 100 μl de surnageant. 5 Mélanger l’échantillon avec le mélange Beads/PK et la solution Lysis/Binding/IPC 1. Retourner plusieurs fois le tube de mélange Beads/PK pour resuspendre les billes, puis ajouter 30 µl de mélange Beads/PK dans les puits requis de la plaque ou de la barrette de tubes. 2. Transférer le volume adéquat de chaque échantillon préparé dans un puits contenant le mélange Beads/PK. Type d’échantillon Quantité Sérum, sang total ou fluides de soins 200 µl d’échantillon Tissus 100 µl de surnageant 3. Mélanger l’échantillon avec le mélange Beads/PK pendant 2 minutes à température ambiante selon la méthode de votre choix. • Utilisation d’un agitateur de plaques : agiter vigoureusement pendant 2 minutes (voir “Déterminer le réglage maximal de l’agitateur de plaques” en page 6). • Par pipetage : homogénéiser par plusieurs aspiration-refoulement, puis incuber 2 minutes ™ à température ambiante. (Pour le traitement en aval sur l’instrument KingFisher mL, vous devez mélanger en pipetant.) 4. Ajouter 700 µl de solution Lysis/Binding/IPC dans chaque puits ou tube contenant un ™ échantillon. (Les barrettes de tubes sont uniquement utilisées avec l’instrument KingFisher mL.) 5. Procéder immédiatement à la mise en place des échantillons sur l’instrument (section suivante). 6 Traiter les échantillons dans l’instrument 1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Télécharger et installer le script” en page 6). 2. Démarrer le test, puis placer les plaques ou barrettes de tubes préparées sur leur position lorsque l’instrument le demande. Conserver l’acide nucléique purifié sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. 8 ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit Purification de l’ARN à partir de fluides oraux (méthode Complexe) 1 ™ ™ 1. Préparer les plaques sur l’instrument KingFisher Flex ou MagMAX Express-96. Préparation des plaques Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Volume par puits Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque. ID de la plaque [1] Position sur l’instrument. Remarque : Pour configurer les plaques ou les barrettes de tubes pour le traitement pour ™ ™ l’instrument KingFisher Duo Prime ou KingFisher mL, voir page 12. 2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées pour le traitement avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. 2 Préparation du mélange Beads/PK Nous vous recommandons de préparer un nouveau mélange Beads/PK à chaque série. Si nécessaire, vous pouvez stocker le mélange Beads/PK à 4°C pendant un maximum de 1 semaine. ™ 1. Vortexer vigoureusement les MagMAX CORE Magnetic Beads pour s’assurer que les billes sont complètement resuspendues. 2. Mélanger les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons plus 10 % d’excédent. Composant 3 Volume par échantillon MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 µl MagMAX™ CORE Proteinase K 10 µl Mélange Beads/PK total 30 µl 1. Combiner les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons plus 10 % d’excédent. Préparer la solution Lysis/IPC Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Lysis Solution 450 µl 5 – IPC PRRSV 3.0[1] 2 µl Volume total de la solution Lysis/IPC 452 µl [1] Fourni avec VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit. ™ 2. Mélanger en retournant le tube ou la bouteille au moins 10 fois. (Facultatif) Conserver la solution Lysis/IPC à température ambiante pendant 24 heures maximum. ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 9 4 Préparation du lysat clarifié 1. Mélanger brièvement l’échantillon de fluides oraux, puis procéder avec 300 µl d’échantillon. 2. Ajouter la solution Lysis/IPC, puis clarifier le lysat. Équipement de traitement Traitement dans des tubes Action a. Pour chaque échantillon, ajouter 450 µl de solution Lysis/IPC dans un nouveau tube de 2 ml. b. Ajouter 300 µl d’échantillon à la solution Lysis/IPC. c. Vortexer vigoureusement pendant 3 minutes. d. Centrifuger à 15 000 × g pendant 2 minutes. e. Procéder avec 600 μl de surnageant (lysat clarifié). Attention à ne pas perturber le culot. Traitement sur des plaques a. Pour chaque échantillon, ajouter 450 µl de solution Lysis/IPC dans les puits adéquats d’une plaque deep well. b. Ajouter 300 µl d’échantillon à la solution Lysis/IPC. c. Sceller la plaque avec une feuille adhésive. d. Agiter la plaque à une vitesse modérée pendant 5 minutes. e. Centrifuger à 3 000 × g pendant 5 minutes. f. Procéder avec 600 μl de surnageant (lysat clarifié). Attention à ne pas perturber le culot. 5 Mélanger le lysat clarifié avec le mélange Beads/PK et MagMAX™ CORE Binding Solution 1. Retourner plusieurs fois le tube de mélange Beads/PK pour resuspendre les billes, puis ajouter 30 µl de mélange Beads/PK dans les puits requis de la plaque ou de la barrette de tubes. (Les ™ barrettes de tubes sont uniquement utilisées avec l’instrument KingFisher mL.) 2. Transférer 600 µl de chaque échantillon de lysat clarifié (voir “Préparation du lysat clarifié” en page 10) dans un puits contenant le mélange Beads/PK. 3. Mélanger l’échantillon avec le mélange Beads/PK pendant 2 minutes à température ambiante selon la méthode de votre choix. • Utilisation d’un agitateur de plaques : agiter vigoureusement pendant 2 minutes (voir “Déterminer le réglage maximal de l’agitateur de plaques” en page 6). • Par pipetage : homogénéiser par plusieurs aspiration-refoulement, puis incuber 2 minutes ™ à température ambiante. (Pour le traitement en aval sur l’instrument KingFisher mL, vous devez mélanger en pipetant.) ™ 4. Ajoutez 350 µl de MagMAX CORE Binding Solution. 5. Procéder immédiatement à la mise en place des échantillons sur l’instrument (section suivante). 6 Traiter les échantillons dans l’instrument 1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Télécharger et installer le script” en page 6). 2. Démarrer le test, puis placer les plaques ou barrettes de tubes préparées sur leur position lorsque l’instrument le demande. Conserver l’acide nucléique purifié sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. 10 ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit Purification de l’ARN à partir de semences 1 ™ ™ 1. Préparer les plaques sur l’instrument KingFisher Flex ou MagMAX Express-96. Préparation des plaques Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Volume par puits Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque. ID de la plaque [1] Position sur l’instrument. Remarque : Pour configurer les plaques ou les barrettes de tubes pour le traitement pour ™ ™ l’instrument KingFisher Duo Prime ou KingFisher mL, voir page 12. 2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées pour le traitement avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. 2 Préparation du mélange PK Remarque : Préparer le mélange PK immédiatement avant utilisation. 1. Combiner les composants suivants (dans l’ordre indiqué) pour le nombre requis d’échantillons, plus 10 % d’excédent (recommandé). Composant Volume par échantillon PBS (1X), pH 7,4 200 μl MagMAX™ CORE Proteinase K 10 μl Mélange PK total 210 μl 2. Retourner plusieurs fois le tube pour mélanger, puis centrifuger brièvement pour recueillir le contenu. 3 ™ 1. Ajouter 400 µl de MagMAX CORE Lysis Solution à un nouveau tube de 2 ml, puis ajouter l’échantillon de semences comme suit. Préparer l’échantillon Type d’échantillon Quantité Semences fraîches ou congelées 300 µl d’échantillon Semences commerciales Volume recommandé par le fournisseur 2. Vortexer vigoureusement pendant 1 minute. 3. Passer immédiatement à l’étape suivante. 4 Traiter les échantillons avec le mélange PK Nous recommandons de suivre cette procédure en tubes individuels pour éviter les contaminations. 1. Ajouter 210 µl de mélange PK directement au lysat. 2. Vortexer vigoureusement pendant 1 minute puis centrifuger brièvement pour recueillir le contenu. 3. Incuber l’échantillon pendant 30 minutes à 70°C. 4. Centrifuger à 15 000 × g pendant 2 minutes pour collecter le contenu. ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 11 5 Mélanger les échantillons avec le mélange Binding/Beads/IPC 1. Transférer 600 μl de chaque lysat d’échantillon dans les puits appropriés de la plaque d’échantillons ou la barrette de tubes. (Les barrettes de tubes sont uniquement utilisées avec ™ l’instrument KingFisher mL.) ™ 2. Bien vortexer les MagMAX CORE Magnetic Beads afin que toutes les billes soient resuspendues. 3. Préparer le mélange Binding/Beads/IPC : combiner les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons, plus 10 % d’excédent (recommandé). Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Binding Solution 400 µl MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 μl 5 – IPC PRRSV 3.0[1] 2 μl Mélange Binding/Beads/IPC total 422 µl [1] Inclus avec VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit. ™ 4. Homogénéiser le mélange Binding/Beads/IPC par retournement jusqu’à ce que la solution soit homogène, puis ajouter 420 μl du mélange Binding/Beads/IPC dans chaque échantillon. 5. Procéder immédiatement à la mise en place des échantillons sur l’instrument (section suivante). 6 Traiter les échantillons dans l’instrument 1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Télécharger et installer le script” en page 6). 2. Démarrer le test, puis placer les plaques ou barrettes de tubes préparées sur leur position lorsque l’instrument le demande. Conserver l’acide nucléique purifié sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR • Porter des gants et une blouse de laboratoire propres. – Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux précédemment portés pour manipuler des produits amplifiés ou préparer des échantillons. • Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à leur contamination possible. • Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des fournitures dédiés pour les étapes suivantes : – Préparation des échantillons et configuration de la réaction. – Amplification et analyse des produits. • Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone pré-PCR de la réaction. • Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute projection ou création d’aérosols. • Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure du possible. • Utiliser une pipette à piston ou des embouts de pipette résistant aux aérosols. • Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une solution de décontamination ADN. 12 ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit Annexe A Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL Matériel requis, mais non fourni Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. Tableau 6 Matériels requis pour le traitement dans l’instrument KingFisher™ Duo Prime Article Source KingFisher™ Duo Prime Purification System 5400110 Pack KingFisher™ Combi pour plaque de microtitration deep well 96 (comprend 8 plaques, 8 peignes et 8 barrettes d’élution et bouchons) 97003530 (pour Duo Prime uniquement) Barrette d’élution KingFisher™ pour aimant à 12 positions (pour Duo Prime uniquement) (40 pièces)[1] 97003520 pour plaque deep well 96 (pour Duo Prime uniquement) (50 pièces)[1] 97003500 Peigne à 12 pointes KingFisher ™ Plaque deep well 96 KingFisher™, stérile (pour Duo Prime, Flex et Presto)[1] [1] 95040460 Inclus dans le pack combi KingFisher (réf. N° 97003530). ™ Tableau 7 Matériels requis pour le traitement dans l’instrument KingFisher™ mL Source Article KingFisher™ mL Purification System 5400050 Tubes et peignes KingFisher mL (pour 240 échantillons) 97002141 Peigne KingFisher™ mL (800 pièces) 97002111 Tubes KingFisher mL (20 × 45 pièces) 97002121 ™ ™ Procédure de purification ™ Remarque : Pour la réalisation de cette procédure pour un traitement sur l’instrument KingFisher mL, mélanger les échantillons par aspiration-refoulement. Ne pas utiliser d’agitateur de plaques avec les grandes barrettes de tubes requises par l’instrument. 1. Suivre la méthode adaptée à votre type d’échantillon en commençant par la préparation du lysat d’échantillon, en mélangeant les échantillons aux billes et à la solution de lyse. Remarque : Ne pas préparer les plaques ou les tubes pour le traitement avant d’avoir préparé les échantillons. ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 13 ™ ™ 2. Ajouter les MagMAX CORE Wash Solutions et MagMAX CORE Elution Buffer aux positions indiquées, selon votre instrument. Placer le peigne et toutes les plaques ou les barrettes de tubes au même moment. L’instrument ne vous invite pas à placer les éléments individuellement. Tableau 8 Plan de plaque : Instrument KingFisher™ Duo Prime ID de la ligne Ligne sur la plaque Type de plaque Réactif Volume par puits Échantillon A Deep Well Mélange Beads / échantillon lysé Varie selon l’échantillon Lavage 1 B MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 C MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution[1] Séparer la barrette[2] Barrette d’élution MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne H Deep Well [1] [2] Placer un peigne dans la plaque. S’assurer que la barrette d’élution est placée dans le bon sens dans le bloc d’élution. Placer sur l’élément de chauffage. Tableau 9 Configuration de la barrette de tubes : Instrument KingFisher™ mL ID de la position Position de la barrette de tubes Tube Réactif Volume par puits Échantillon 1 Standard Mélange Beads / échantillon lysé Varie selon l’échantillon Lavage 1 2 MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 3 MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne N/A N/A Glisser le peigne dans le support pour peigne. 3. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Télécharger et installer le script” en page 6). 4. Démarrer le test, puis placer les plaques ou barrettes de tubes préparées sur leur position lorsque l’instrument le demande. Conserver l’acide nucléique purifié sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Annexe B Documentation et support Assistance à la clientèle et support technique Visiter thermofisher.com/support pour obtenir les informations les plus récentes sur les services et le support. • Numéros de téléphone de contact internationaux • Informations sur le support produit – FAQ relatives aux produits – Logiciels, correctifs et mises à jour – Formations sur de nombreux instruments et applications • Commandes et assistance en ligne • Documentation produit – Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles – Certificats d’analyse – Fiches de données de sécurité (FDS) Remarque : Pour obtenir les FDS relatives aux réactifs et produits chimiques d’autres fabricants, contacter ces derniers. Garantie limitée du produit Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l’adresse web suivante : www.thermofisher.com/support. 14 ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils – Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – France Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition. Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN0029145 B.0. Historique des révisions : Pub. nº MAN0029145 B.0 Révision Date Description • Le tableau pour choisir le script approprié a été ajouté (voir “Choisir le script approprié” en page 6). B.0 1 mars 2024 A.0 13 septembre 2023 • Les scripts appropriés ont été mis à jour (voir “Télécharger et installer le script” en page 6). ™ Nouveau document pour VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit. Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2023-2024 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 3 juillet 2024 ">
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