Thermo Fisher Scientific VetMAX Schmallenberg Virus Mode d'emploi

NOTICE D’UTILISATION
VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit
RT-PCR temps réel TaqMan™ pour la détection du SBV (Schmallenberg Virus)
Référence Catalogue SBVS50
Partie Nº 100020434 Pub. Nº MAN0007811 Rév. D
Technique
RT-PCR temps réel (ARN)
– Duplex
– IPC Endogène
Espèce(s)
Acides nucléiques isolés à partir des matrices
Test
Bovins
Petits ruminants
(ovins, caprins)
Tissu encéphalique
Sang (en tubes EDTA)
Sérum
Individuel
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes
de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse
thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques
du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Informations sur le produit
Description du produit
Applied Biosystems™ VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit est un outil de diagnostic moléculaire du virus SBV. Il permet la détection
spécifique du gène S du virus SBV par la technique de PCR en temps réel.
Chaque échantillon d’ARN obtenu après extraction est analysé en monocupule : la même cupule est utilisée pour la détection
spécifique de l’ARN viral du SBV et pour la détection d’un IPC (Internal Positive Control). La positivité de l’IPC traduit à la fois
l’efficacité de l’extraction et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.
Il est utilisable sur ARNs viraux extraits à partir de tissu encéphalique, de sang (en tube EDTA) ou de sérum. La recherche du virus
est réalisée préférentiellement sur les encéphales des avortons, mais le virus peut également être localisé dans le sang (Source FLI –
Laboratoire National de Référence allemand). En l’absence d’informations complémentaires sur la durée de la virémie qui semble très
courte (2 à 3 jours) et sur la localisation du virus chez l’animal vivant, nous recommandons de travailler préférentiellement ARN viraux
extraits à partir de tissu encéphalique.
Les protocoles complets d’extractions des ARN viraux à partir de ces matrices sont disponibles sur demande au Support Technique.
Réactifs du kit et conservation
VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit se présente sous la forme d’un coffret contenant des réactifs pour la détection en duplex du SBV
et d’un contrôle interne IPC. À réception, le kit doit être conservé dans sa totalité entre −30°C et −10°C. A la première utilisation du kit,
suivre les recommandations de conservation du tableau suivant pour chaque composant :
Nom
3 - Mix SBVS
(Tube vert)
4a - EPC SBVS
(Tube marron)
Description
Mix pour RT-PCR TaqMan™. Il contient :
• Le système de détection pour la cible SBV : primers
forward et reverse, ainsi qu’une sonde TaqMan™ marquée
FAM™ - NFQ (NFQ = Non-Fluorescent Quencher).
• Le système de détection pour l’IPC : primers forward et
reverse, ainsi qu’une sonde TaqMan™ marquée
VIC™ - TAMRA™.
• Le tampon, la reverse transcriptase et l’enzyme de PCR.
External Positive Control :
Contrôle positif en SBV. Il s’agit d’acides nucléiques déjà
extraits à amplifier lors de la RT-PCR temps réel.
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
Conservation
Volume
(50 réactions)
A réception
Après première
utilisation
2 × 500 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
90 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
Témoins d’extraction et d’amplification
Le VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit contient 1 témoin permettant la validation de l’amplification des ARN viraux :
4a - EPC SBVS : contrôle positif en SBV
Contrôle positif déjà extrait à amplifier lors de la RT-PCR temps réel.
Un résultat positif compris dans l’intervalle accepté de Ct permet de valider l’amplification de la cible SBV par RT-PCR temps réel.
La validation de l’extraction des acides nucléiques pour chaque échantillon s’effectue grâce à la détection d’un IPC endogène (Internal
Positive Control), présent dans chaque échantillon.
Un résultat IPC positif pour un échantillon permet de valider l’extraction de cet échantillon qu’il soit positif ou négatif pour le
pathogène recherché : élimination des faux négatifs et vérification de l’effet des inhibiteurs.
Il est recommandé de réaliser deux contrôles négatifs pour valider le bon déroulement de l’analyse :
NCS : contrôle négatif d’extraction
C’est un témoin composé des réactifs utilisés lors de l’extraction, sans ajout d’échantillon (le volume d’échantillon peut être remplacé
par le tampon utilisé lors de la préparation des échantillons ou par de l’eau DNase/RNase-free), qui subit le même traitement que les
échantillons : extraction des acides nucléiques (avec ajout d’IPC) puis RT-PCR temps réel.
Un résultat négatif en SBV and en IPC permet de valider l’absence de contamination au cours de l’extraction et de la PCR temps réel.
NC : contrôle négatif d’amplification
Il s’agit du mix d’amplification déposé dans la plaque au moment de la préparation de la RT-PCR temps réel, complété de 5 µL d’eau
DNase/RNase-free pour ajuster la réaction à 25 µL.
Un résultat négatif pour toutes les cibles (SBV et IPC) permet de valider l’absence de contamination au cours de la préparation de la
RT-PCR temps réel.
Matériel et réactifs requis pour la RT-PCR temps réel non fournis dans le kit
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.
• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre
• Eau DNase/RNase-free
• Tampon TE 1X
• Tampon PBS 1X
• Un thermocycleur de PCR temps réel capable de détecter les fluorophores suivants :
- FAM™ (maximum d’émission : λ515 nm)
- VIC™ (maximum d’émission : λ554 nm)
• Consommables de qualité optique compatibles avec le thermocycleur utilisé : Plaques PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits),
microtubes ou capillaires; films ou bouchons adaptés à la fermeture
Procédure d’analyse
Le volume réactionnel de la PCR temps réel est de 25 µL :
• 3 - Mix SBVS : 20 µL par analyse
•
ARN extrait : 5 µL par analyse
Extraction des ARN viraux
Il est nécessaire d’isoler les ARN à partir des échantillons pour l’analyse par RT-PCR temps réel.
NOTE : Pour connaître des méthodes d’extractions compatibles et validées avec le VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit, merci de
contacter le Support Technique.
Préparation de la RT-PCR temps réel
1. Créer un plan d’analyse pour la distribution des mix et échantillons. Éloigner si possible le contrôle positif (EPC) des autres
échantillons.
2. Décongeler le tube 3 - Mix SBVS entre +2°C et +8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant.
3. Homogénéiser le tube 3 - Mix SBVS par agitation douce, puis centrifuger brièvement.
4. Distribuer 20 µL de 3 - Mix SBVS par puits de la plaque PCR, barrette PCR ou capillaire utilisé.
5. Ajouter les ARN des échantillons et contrôles au mix réactionnel, selon le plan d’analyse prédéfini :
Composant
Volume d’échantillon
ARN extraits de l’échantillon
5 µL
Contrôle positif d’amplification
4a - EPC SBVS
5 µL
Contrôle négatif d’extraction (NCS)
NCS extrait
5 µL
Contrôle négatif d’amplification (NC)
Eau DNase/RNase-free
5 µL
Type d’analyse
Echantillon pour analyse
6. Fermer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires avec un film adhésif ou des bouchons adaptés.
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VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit Notice d’Utilisation
Amplification par PCR en temps réel
Remarque : En France, utilisez le programme Standard pour les échantillons extraits par la méthode d’extraction « Sang Total ».
1. Créer les détecteurs suivants sur le thermocycleur :
Reporter
Quencher
SBV
FAM™
NFQ (Non-Fluorescent Quencher)
IPC CAS
VIC™
TAMRA™(1)
Référence passive : ROX™(1)
(1)
Les fluorophores ROX™ et TAMRA™ sont à renseigner obligatoirement pour l’analyse par PCR temps réel si le thermocycleur est capable de les détecter.
Pour les autres thermocycleurs, l’absence de détection de ces fluorophores ne remet pas en cause l’analyse par RT-PCR temps réel.
2. Attribuer pour chaque échantillon les détecteurs SBV et le détecteur IPC SBV dans le puits utilisé pour l’analyse.
3. Créer le programme de RT-PCR temps réel suivant pour l’analyse :
Table 1 Programme Standard
Répétitions de l’étape
Température
Durée
Etape 1
×1
45°C
10 minutes
Etape 2
×1
95°C
10 minutes
Etape 3
×40
95°C
15 secondes
60°C(1)
45 secondes
(1)
Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 45 secondes
Table 2 Programme Express
Répétitions de l’étape
Température
Durée
Etape 1
×1
48°C
5 minutes
Etape 2
×1
97°C
5 minutes
97°C
2 secondes
60°C(1)
35 secondes
×40
Etape 3
(1)
Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 35 secondes
4. Placer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires dans le thermocycleur et démarrer la PCR temps réel.
Analyse des résultats
Analyse des données brutes
Se référer aux recommandations du fournisseur du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.
1. Placer les lignes seuils (threshold) de manière indépendante pour chaque cible de la RT-PCR temps réel.
2. Interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct obtenues pour les échantillons pour chaque détecteur selon les
recommandations ci-après.
Validation du test
La validation du test passe par l’acceptation des critères suivants :
Détecteur SBV
Détecteur IPC SBV
Validation
Ct = Ct QC SBV de 4a - EPC SBV ± 3Ct(1)
Ct < 40 ou Ct > 40(2)
PCR validée
NCS
Ct > 40
Ct < 40
Extraction validée
NC
Ct > 40
Ct > 40
Réactifs PCR validés
EPC SBVS
(1)
(2)
Se référer aux valeurs indiquées pour “EPC” dans le Certificat d’analyse du lot utilisé pour le test.
Ne pas prendre en compte la valeur d’IPC dans l’EPC pour la validation du test.
Interprétation des résultats
Pour chaque échantillon analysé, interpréter les résultats comme décrit ci-dessous :
(1)
Détecteur SBV
Détecteur IPC SBV
Interprétation
Ct < 40
Ct < 40 ou Ct > 40
SBV détecté
Ct > 40
Ct < 40
SBV non détecté
Ct > 40
Ct > 40
Non validé(1)
L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la valeur non conforme de l’IPC.
VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit Notice d’Utilisation
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Conduite à tenir pour les échantillons non validés
1. Diluer l’ARN de l’échantillon non validé au 1:5 en tampon TE 1X.
2. Faire une nouvelle analyse RT-PCR sur 5 µL de cette dilution.
3. Si l’ARN dilué est positif en SBV ou négatif en SBV avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu est alors validé.
4. Si l’ARN dilué est négatif en SBV avec un résultat IPC non conforme, le résultat obtenu est toujours non valide. Dans ce cas,
renouveler l’extraction de l’échantillon en le pré-diluant au 1:2 dans du tampon PBS 1X avant extraction.
Documentation et support
Service clientèle et assistance technique
Garantie produit limitée
Support technique : rendez-vous sur
thermofisher.com/askaquestion
Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux
dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance
technique, notamment :
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs
produits selon les termes et conditions générales de ventes
disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home
/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions,
vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à
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Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
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Certificats d’analyse
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Fiches de Données de Sécurité (FDS, également
appelées FS (Fiches Signalétiques))
Remarque: Pour les FDS relatives aux réactifs et aux
produits chimiques d'autres fabricants, contacter
chaque fabricant.
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France
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RÉSULTANT.
Historique des révisions pour Pub. N° MAN0007811 (français)
Révision
Date
Description
D
10 décembre 2024
Une note pour l’utilisation du programme standard pour la France a été ajoutée (voir « Amplification par RT-PCR en temps
réel »).
C.0
18 décembre 2020
Mise à jour pour inclure un nouveau protocole thermique express et modifier le nombre de cycles du protocole standard.
B.0
9 mars 2017
Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.
A.0
Novembre 2015
2.0
Juin 2013
Correction des marques de commerce
1.0
Avril 2013
Nouveau document
Modification des matrices
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10 décembre 2024
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