Thermo Fisher Scientific VetMAX M. tuberculosis Complex Kit Mode d'emploi

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Mode d'emploi VetMAX M. tuberculosis Complex Kit - Thermo Fisher Scientific | Fixfr
NOTICE D’UTILISATION
VetMAX™ M. tuberculosis Complex Kit
Détection des mycobactéries responsables de la tuberculose bovine par PCR temps réel
Référence catalogue MTBC
N° de document 100041123
Pub. nº MAN0015858 Rév. B.0
Technique
PCR temps réel (ADN)
• Analyses en duplex
• IPC exogène
Espèces
•
•
•
•
Matrices d’échantillons
Bovin
Blaireau
Sanglier
Cervidé
Nœud lymphatique et tissus lésionés
(sans le caséum, la peau et la couche adipeuse)
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité
(FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des
lunettes de protection, des gants et des vêtements appropriés.
Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à
l’adresse thermofisher.com/support.
Description du produit
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur
thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur
fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de
laboratoire. Les références catalogue qui s’affichent sous forme de
liens ouvrent les pages Web de ces produits.
Élément
Instrument de PCR temps réel, parmi les suivants :
™
Applied Biosystems™ 7500 Real-Time PCR
System
• Precision Plate Holder for 7500 Real-Time
PCR Systems (A24820)
• Precision Plate Holder for 0.2 mL Tubes and
Strips (4367033)
Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR
System
• Precision Plate Holder for 7500 Fast RealTime PCR Systems (4359652)
• 7500 Fast Precision Plate Holder, for 0.1 mL
Tube Strips (A29252)
Pipettes sans nucléase
Deux bacs de glace ou portoirs réfrigérants :
• Un pour la zone de configuration de la PCR
dans laquelle le master mix PCR est préparé
• Un pour la zone dans laquelle les échantillons
d’ADN et les contrôles sont préparés
Tubes, plaques et autres consommables
MicroAmp™ Optical 96-Well Reaction Plate
MicroAmp™ Optical Adhesive Film
MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2 mL
MicroAmp™ Optical 8-Cap Strips
Réactifs
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) (eau
exempte de nucléases (non traitée au DEPC))
TE Buffer 1X
Autres consommables
Tubes à réactifs sans nucléase pour préparer les
mélanges réactionnels
Embouts de pipette résistants aux aérosols
Contenu et conservation
3 – Mix MTBC
4a – EPC MTBC
5 – IPC MTBC
Conservation
2 × 500 µl
2 × 90 µl
1 × 550 µl
–30°C à –10°C
Source
Contacter un
représentant local.
QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR System
Équipement
Le kit fournit les essais et les réactifs nécessaires pour une PCR
temps réel monopuits au cours de laquelle les cibles du complexe
de M. tuberculosis et du contrôle positif interne (IPC) sont
amplifiées et détectées grâce à une sonde d'hydrolyse. Dans ce
document, le terme TUB est utilisé pour désigner la séquence
cible IS6110 indiquant la présence des organismes du complexe
de M. tuberculosis. Le kit comprend :
• 3 – Mix MTBC : Contient des amorces, des sondes, un tampon et
une enzyme pour une amplification optimisée des cibles TUB et
IPC par PCR temps réel duplex.
• 4a – EPC MTBC : Matrice d’ADN quantifiée (voir le
certificat d’analyse) contenant la séquence cible du complexe
de M. tuberculosis (contrôle positif externe). Elle sert de contrôle
positif pour les composants de la PCR temps réel et est utilisée
pour définir les critères de validation des résultats des tests.
• 5 – IPC MTBC : Ajouté à chaque échantillon de test et de contrôle
à l’étape suivant la lyse de la procédure d’extraction de l’ADN
(IPC exogène). Il sert de contrôle pour la procédure d’extraction
de l’ADN et permet d’évaluer la présence d’inhibiteurs de la PCR.
Quantité
Individuel
Matériels requis non fournis
Le VetMAX M. tuberculosis Complex Kit permet la détection par
PCR temps réel du complexe de Mycobacterium tuberculosis, un
groupe de mycobactéries liées génétiquement qui peut être à
l’origine de la tuberculose chez le bovin et d’autres espèces.
L’analyse cible la séquence d’insertion IS6110 présente dans les
génomes de M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M.
canetti, M. caprae et M. pinnipedii.
Le kit a été validé pour une utilisation sur de l’ADN extrait des
noeuds lymphatiques et des tissus lésionés chez le bovin, le
blaireau, le sanglier et les espèces de cervidés. Un rapport de
validation est disponible sur demande auprès de votre représentant
commercial ou votre technico-commercial. Le client est
responsable de la validation du kit avec des tissus non inclus dans
le rapport.
Composant
Type de test
Précaution d’emploi
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
PFL
PFL
4316813
4311971
4316567
4323032
AM9939
PFL
PFL
PFL
• Pour chaque série de PCR temps réel, inclure les contrôles
suivants :
– Contrôle positif — utiliser 4a – EPC MTBC.
– Contrôle d’extraction — utiliser au moins 1 échantillon témoin
préparé au cours de la même procédure d’extraction de l’ADN
que celle des échantillons à analyser.
– Contrôle sans acide nucléique (NTC) — utiliser de l’eau
nuclease-free.
• Respecter les “Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR
et la RT-PCR” en page 3 pour éviter les faux positifs et la
contamination des échantillons par des produits de PCR.
Exigences concernant l’ADN
Tableau 1 Recommandations pour l’extraction de l’ADN
Étape, processus ou paramètre
Quantité de matériel de départ pour
l’extraction de l’ADN
Méthode d’extraction de l’ADN
Recommandation
Exciser de 2 g à 5 g de tissu
présentant si possible des lésions
typiques de la tuberculose.
Les méthodes validées pour une
utilisation avec le VetMAX™ M.
tuberculosis Complex Kit sont
disponibles sur demande auprès du
support technique.
Ajouter 5 µl de 5 - IPC MTBC après la
lyse lors de l’extraction de l’ADN.
Modification de la méthode
d’extraction de l’ADN pour les
échantillons testés et l’échantillon
témoin
Préparation de l’échantillon témoin
Préparer au moins 1 échantillon
pour une utilisation dans une PCR de témoin, à l’aide d’eau sans nucléase
contrôle d’extraction
comme matériel de départ.
Traiter l’échantillon témoin au
cours de la même procédure
d’extraction de l’ADN que les
échantillons testés.
Avant de commencer
1. Décongeler réactifs et échantillons :
a. Décongeler 3 – Mix MTBC dans un bac de glace ou un portoir
réfrigérant.
b. Décongeler 4a – EPC MTBC, 5 – IPC MTBC, et les
échantillons d’ADN dans un bac de glace ou un portoir
réfrigérant différent.
2. Bien mélanger le contenu de chaque tube en le vortexant, puis
centrifuger brièvement.
Stocker les réactifs et les échantillons décongelés à 5±3°C jusqu’à
utilisation.
Configurer et démarrer l’instrument PCR temps
réel
1. En suivant les instructions du fabricant, configurer le test de PCR
temps réel à l’aide des paramètres suivants.
• Volume réactionnel : 15 µl
™
• Référence passive : Fluorophore ROX (inclus dans le
3 – Mix MTBC)
™
Remarque : Le fluorophore ROX doit être sélectionné si
l’instrument est capable de le détecter. Les instruments de
™
PCR temps réel qui ne détectent pas le fluorophore ROX
peuvent être utilisés sans conséquence sur l’exactitude des
lectures.
• Programme du thermocycleur :
Tableau 2 Programme du thermocycleur : mode standard
ou rapide
[1]
Phase
Répétitions
Température
Durée
1
2
3
1
1
40
50°C
95°C
95°C
60°C
2 minutes
5 minutes
10 secondes
30 secondes[1]
Si votre thermocycleur ne peut pas être programmé à 30 secondes,
la phase 3 à 60°C (l’étape d’élongation) peut être prolongée de 1 à
3 secondes.
2. Sélectionner ou créer des détecteurs de fluorophores, puis les
assigner à chaque tube ou puits.
Cible
Reporter
Quencher
TUB[1]
Fluorophore FAM™
Fluorophore VIC™
Quencher non
fluorescent (NFQ)
IPC[1]
[1]
TUB : cible du complexe de M. tuberculosis. IPC : cible du 5 – IPC MTBC.
3. Lancer le programme de thermocycleur approprié, avec collecte
des données d’amplification en temps réel au cours de la
phase 3.
Préparer les réactions de PCR
1. Distribuer 10 µl de 3 – Mix MTBC dans le nombre approprié de
puits de plaque ou de tubes.
2. Ajouter le composant indiqué pour chaque type de réaction.
Type de réaction
Composant
Volume par
réaction
Échantillon à analyser
Contrôle positif
Contrôle d’extraction
Contrôle sans acide
nucléique (NTC)
Échantillon d’ADN
4a – EPC MTBC
Échantillon témoin
Eau sans nucléase
5,0 µl
5,0 µl
5,0 µl
5,0 µl
3. Sceller chaque plaque ou tube, mélanger, puis centrifuger
brièvement pour amener le contenu au fond des puits de plaque
ou des tubes.
Consignes pour l’analyse des données
• Suivez le guide d'utilisation de l'instrument pour l'analyse des données brutes.
• Fixer les seuils pour chaque cible séparément.
• Voir le Certificat d'analyse du lot de kit pour valider la série et interpréter les résultats.
2
™
VetMAX M. tuberculosis Complex Kit Notice d'utilisation
Critères de validation
Se référer aux valeurs CtQC dans le Certificat d’Analyse du lot de fabrication du kit. Le test est validé si les critères suivants sont respectés :
Cible TUB
(FAM™)
Type de réaction
Contrôle positif
Contrôle d’extraction
Contrôle sans acide
nucléique
[1]
[2]
[3]
Cible IPC
(VIC™)
Ct = CtQC TUB ± 3 C
[2]
Interprétation
Ct > 40
N/A
Ct = CtQC IPC ± 4 Ct[3]
La PCR est validée.
L’extraction de l’ADN est validée.
Ct > 40
Ct > 40
Les réactifs PCR sont validés.
[1]
t
Voir le tableau EPC dans le certificat d’analyse.
N/A : non applicable ; la valeur IPC Ct de la réaction de contrôle positif n’est pas utilisée pour la validation.
Voir le tableau IPC dans le certificat d’analyse.
Interprétation des résultats
Cible TUB
(FAM™)
Ct < 40
Ct > 40
Ct > 40
[1]
Cible IPC
(VIC™)
Toute valeur
Ct ≤ Ct du contrôle d'extraction + 4 Ct[1]
Ct > Ct du contrôle d'extraction + 4 Ct[1]
Interprétation
Le complexe de M. tuberculosis est détecté.
Le complexe de M. tuberculosis n'est pas détecté.
Résultat non validé.
Le Ct du contrôle d'extraction doit être validé comme décrit dans “Critères de validation” en page 3.
Tester à nouveau les échantillons dont les résultats ne sont pas validés
1. Diluer les échantillons d'ADN au 1:10 dans du tampon TE 1X.
2. Recommencer la procédure de PCR temps réel avec 5 µL de l'ADN dilué, puis interpréter les résultats comme suit.
Résultat
L'ADN dilué est positif pour le complexe de M. tuberculosis.
L'ADN dilué est négatif pour le complexe de M. tuberculosis, et le résultat IPC est conforme.
L'ADN dilué est négatif pour le complexe de M. tuberculosis, mais le résultat IPC est non-conforme.
Interprétation
Le résultat est validé.
Le résultat n'est pas validé.
3. Pour des échantillons dilués dont les résultats ne sont pas validés, recommencer la procédure d'extraction de l'ADN avec un nouvel aliquot
du lysat de l'échantillon d'origine.
Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR
• Porter des gants et une blouse de laboratoire propres.
– Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux précédemment portés pour manipuler des produits amplifiés ou préparer des
échantillons.
• Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à leur contamination possible.
• Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des fournitures dédiés pour les étapes suivantes :
– Préparation des échantillons et configuration de la réaction.
– Amplification et analyse des produits.
• Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone pré-PCR de la réaction.
• Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute projection ou création d’aérosols.
• Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure du possible.
• Utiliser une pipette à piston ou des embouts de pipette résistant aux aérosols.
• Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une solution de
décontamination ADN.
Garantie limitée du produit
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site
www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life
Technologies à l’adresse web suivante : www.thermofisher.com/support.
™
VetMAX M. tuberculosis Complex Kit Notice d'utilisation
3
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils – Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – France
Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition.
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ: DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES
POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE
OU EN RÉSULTANT.
Historique des révisions: Pub. Nº MAN0015858
Révision
B.0
10 mai 2022
Date
A.0
23 mai 2017
Description
• Ajout de la quantification du 4a – EPC MTBC à la description du produit (“Description du produit” en page 1).
• Mise à jour de la quantité de 3 – Mix MTBC et de 5 – IPC MTBC dans la section “Contenu et conservation” en page 1.
• Mise à jour du volume réactionnel et du programme du thermocycleur dans la section “Configurer et démarrer l’instrument
PCR temps réel” en page 2.
• Ajout de l’Applied Biosystems™ 7500 Real-Time PCR System et du QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR System aux matériels
requis non fournis (voir “Matériels requis non fournis” en page 1).
• Des mises à jour mineures de la terminologie ont été effectuées dans tout le document.
Nouveau document traduit de l’anglais, publication numéro MAN0015857 Rév. B.0.
Informations importantes sur les licences : Ce produit peut être couvert par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ce produit, vous acceptez les conditions générales de
toutes les licences à usage limité.
©2022 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
10 mai 2022

Fonctionnalités clés

  • Détection du complexe M. tuberculosis
  • PCR en temps réel
  • Réaction en duplex
  • Contrôle interne
  • Facile à utiliser
  • Résultats rapides

Manuels associés

Réponses et questions fréquentes

Quels types d'échantillons puis-je utiliser avec le VetMAX M. tuberculosis Complex Kit ?
Ce kit est validé pour une utilisation sur de l'ADN extrait des nœuds lymphatiques et des tissus lésionnés chez les bovins, les blaireaux, les sangliers et les cervidés.
Quels sont les contrôles inclus dans le kit ?
Le kit comprend un contrôle positif externe (4a – EPC MTBC) et un contrôle positif interne (5 – IPC MTBC).
Quel est le volume de réaction recommandé ?
Le volume de réaction recommandé est de 15 µl.