Thermo Fisher Scientific VetMAX Rotavirus A/B/C Kit Mode d'emploi

NOTICE D’UTILISATION
VetMAX™ Rotavirus A/B/C Kit
Détection des espèces de rotavirus A, B et C par RT-PCR en temps réel TaqMan™
Référence catalogue A57452
N° de document A40001104
Technique
Pub. nº MAN0029773 Rév. B
Espèces
RT-PCR temps réel
(ARN)
• Essai 4-plex
• IPC exogène
Porcin et
sanglier
Échantillons
Type de test
Fèces
En mélange
(jusqu’à
5 échantillons
mélangés)
Fèces, tissu
intestinal
Individuel
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de
sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation.
Porter des lunettes de protection, des gants et des
vêtements appropriés. Les fiches de données de
sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse suivante :
thermofisher.com/support.
Description du produit
™
™
Le Applied Biosystems VetMAX Rotavirus A/B/C Kit
(réf. n° A57452) permet la détection monopuits par PCR en temps
réel avec transcriptase inverse (RT-PCR) de l’ARN des espèces de
rotavirus porcin A, B et C (RVA, RVB et RVC).
Le kit a été validé pour une utilisation sur l’ARN extrait d’échantillons
de fèces et tissus intestinaux individuels et d’échantillons en
mélange de fèces (jusqu’à 5 échantillons). Lors de cet essai, le
rotavirus et l’ARN de contrôle sont rétro-transcrits en ADNc, puis
™
amplifiés et détectés en temps réel à l’aide des sondes TaqMan
fluorescentes.
Ce kit comprend les composants suivants :
• 1 – Sequences Rota A/B/C : contient des amorces et des
sondes optimisées pour la détection du RVA, RVB et RVC, ainsi
™
que des séquences cibles Xeno .
• 2 – Master Mix Rota A/B/C : contient des enzymes, des
™
tampons et un fluorophore ROX pour une RT-PCR temps réel
multiplexe.
• 4a – EPC Rota A/B/C : contient les matrices d’ARN avec les
séquences cibles RVA, RVB, RVC ainsi que les séquences du
™
Xeno . Elles sont utilisés comme contrôle positif externe et pour
définir les critères de validation pour les résultats du test.
• 5 – IPC Rota A/B/C : contient des matrices d’ARN avec des
™
séquences cibles Xeno , qui sont utilisées comme contrôle pour
la procédure d’extraction d’ARN et pour surveiller la présence
d’inhibiteurs de la PCR.
• 6 – Negative control : contient de l’eau exempte de nucléases
à utiliser comme contrôle sans matrice (NTC).
Contenu et conservation
Des réactifs en quantité suffisante pour 100 tests de RT-PCR temps
réel de 20 µl sont fournis.
Tableau 1 VetMAX™ Rotavirus A/B/C Kit (N° Cat. A57452)
Composant
1 – Sequences Rota
A/B/C
2 – Master Mix Rota
A/B/C
4a – EPC Rota A/B/C
5 – IPC Rota A/B/C
6 – Negative control
Couleur du
bouchon
Quantité Conservation
Bouchon vert
220 μl
Bouchon blanc
1 100 μl -30°C à -10°C
Bouchon marron
Bouchon jaune
Bouchon transparent
80 μl
250 μl
180 μl
-30°C à 25°C
Matériel requis non fourni
Article
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System
• Precision Plate Holder pour systèmes de PCR en
temps réel 7500 (réf. n° A24820)
• Precision Plate Holder pour les tubes et les
barrettes de 0,2 ml (réf. n° 4367033)
Source[1]
™
Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR
System
• Precision Plate Holder pour systèmes de PCR en
temps réel 7500 Fast (réf. n° 4359652)
• 7500 Fast Precision Plate Holder pour les
barrettes de 0,1 ml (réf. n° A29252)
QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR System
MicroAmp™ Optical Adhesive Film
MicroAmp™ Clear Adhesive Film
Deux bacs à glace ou portoirs réfrigérants
Agitateur de laboratoire, vortex ou équivalent
Équipement et consommables de laboratoires
généralistes (centrifugeuse, pipeteurs, cônes de
pipette sans nucléase, tubes de réactif et autres)
Contacter un
représentant
commercial local.
4311971
4306311
PFL
PFL
PFL
[1] Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.
"PFL" indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès
d'un autre fournisseur principal de laboratoire. Les références catalogue qui
s’affichent sous forme de liens ouvrent les pages Web de ces produits.
Consignes pour l’extraction d’ARN
• Nous recommandons de lire le document Guide
™
complémentaire du VetMAX Rotavirus A/B/C Kit (réf.
™
n° MAN1000631) lors de l’utilisation du Applied Biosystems
™
MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit (réf. n° A32700,
A32702) pour l’extraction d’ARN.
• Préparer au moins un contrôle d’extraction négatif (NEC) à l’aide
d’eau exempte de nucléases (sans traitement au DEPC) comme
matériel de départ. Utilisez la même procédure d’extraction
d’ARN que celle utilisée pour les échantillons testés. Le NEC
se compose des composants utilisés lors de l’extraction sans
ajout de l’échantillon.
• Lors de l’extraction d’ARN, ajoutez 2 µl de 5 – IPC Rota A/B/C
à chaque échantillon et au NEC, comme recommandé par le
protocole.
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
™
Instructions
• Respecter les bonnes pratiques de laboratoire pour aider à
éviter les faux positifs et la contamination des échantillons
testés par des produits de PCR.
• Ce test peut être réalisé sur les instruments Applied
™
Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System et
™
QuantStudio 5 Real‑Time PCR System. Si vous utilisez un
autre système de PCR en temps réel, il doit prendre en charge la
™
™
™
™
détection des fluorophores ABY , FAM , VIC et Cy5
Avant de commencer
1. Décongelez les 1 – Sequences Rota A/B/C, 2 – Master Mix
Rota A/B/C, 4a – EPC Rota A/B/C, 5 – IPC Rota A/B/C,
6 – Negative control et les échantillons sur la glace ou un
portoir réfrigérant.
2. Homogénéisez le contenu de chaque tube en le vortexant, puis
centrifugez brièvement. Stocker les réactifs, les contrôles et les
échantillons décongelés de 2 à 8°C jusqu’à utilisation.
Dénaturation des échantillons et des contrôles
par la chaleur
Le rotavirus est un virus à ARN double brin (ds RNA). Il doit être
dénaturé par la chaleur pour une transcription inverse efficace.
Après l’extraction de l’ARN, dénaturez les échantillons et contrôles
comme suit.
1. Créez un programme sur l’instrument de PCR avec un
couvercle chauffant à 105°C et un volume de 10 µl.
Le volume total peut être ajusté selon le nombre de réplicats à
tester.
Température
Durée
95°C
4°C
3 minutes
∞
2. Déposez 10 µl de chaque échantillon, ainsi que 10 µl de
contrôles 4a – EPC Rota A/B/C, 6 – Negative control et NEC
dans chaque puits approprié dans une plaque à 96 puit.
3. Recouvrez les puits ou scellez la plaque à l’aide d’un
™
MicroAmp Clear Adhesive Film, chargez la plaque dans
l’instrument de PCR, puis lancez le programme créé à
l’étape 1.
4. Lorsque le test est terminé, centrifugez l’échantillon à
2 000 tr/min pendant 20 secondes pour recueillir le contenu.
Conservez la plaque dans la glace à une température comprise
entre 2 et 8°C jusqu’à son utilisation.
Préparer le mélange réactionnel de RT-PCR
temps réel
Préparez le mélange réactionnel de RT-PCR temps réel dans un bac
de glace selon le tableau suivant. Déterminez le volume nécessaire
selon le nombre d’échantillons et de contrôles à tester.
Composant
Volume par réaction[1]
2 – Master Mix Rota A/B/C
1 – Sequences Rota A/B/C
Volume total par réaction
2. Scellez chaque plaque de PCR à l’aide d’un MicroAmp
Optical Adhesive Film.
3. Vortexez la plaque de PCR pour mélanger, puis centrifugez
l’échantillon à 2 000 tr/min pendant 1 minute pour recueillir le
contenu.
Configuration et démarrage de l’instrument de
PCR en temps réel
1. En respectant la notice d’utilisation de l’instrument, configurez
le test de PCR en temps réel à l’aide des paramètres suivants.
• Volume réactionnel : 20 µl
™
• Référence passive : Fluorophore ROX (inclus dans
2 – Master Mix Rota A/B/C)
™
Remarque : Le fluorophore ROX doit être configuré en
tant que fluorophore de référence passive si l’instrument le
détecte. Les instruments qui ne détectent pas le fluorophore
™
ROX peuvent être utilisés sans affecter l’exactitude de la
lecture.
™
• Pour le QuantStudio 5 Real‑Time PCR System, assurezvous que les Filter settings (Paramètres des filtres) sont
sélectionnés de façon appropriée.
• Fluorophores reporter et quencher :
Cible
Quencher dans les réglages de
l’instrument
Reporter
RVA Fluorophore ABY™
RVB Fluorophore FAM™
RVC Fluorophore VIC™
IPC[2] Fluorophore Cy5™
Aucun
NFQ-MGB[1]
NFQ-MGB[1]
Aucun
[1] Quencher non fluorescent, Minor Grove Binder (MGB)
[2] IPC : 5 – IPC Rota A/B/C.
2. Sélectionnez ou créez un des profiles thermiques suivants.
Tableau 2 Mode fast
Description
Phase
Répétitions Température
Phase 1
Phase 2
Maintien en
température
1
1
Phase 3
PCR
40
50°C
95°C
95°C
60°C[1]
Durée
5 minutes
10 minutes
3 secondes
30 secondes[1]
[1] Les données d’amplification en temps réel sont recueillies durant cette
phase.
Tableau 3 Mode standard
Description
Phase
Phase 1
Phase 2
Maintien en
température
Répétitions Température
1
1
Phase 3
PCR
40
48°C
95°C
95°C
60°C[1]
Durée
10 minutes
2 minutes
15 secondes
45 secondes[1]
[1] Les données d’amplification en temps réel sont recueillies durant cette
phase.
3. Exécutez le programme.
10 μl
2 μl
12 μl
[1] Incluez jusqu’à 10 % de volume en plus pour compenser l’erreur de pipetage lors
de la préparation d’un mélange réactionnel pour plusieurs réactions.
Préparation des réactions PCR
Conservez les plaques de PCR dans la glace.
1. Distribuez 12 µl du mélange réactionnel de RT-PCR temps réel
dans chaque puits de la plaque de PCR, puis ajoutez 8 µl du
composant indiqué pour chaque type de réaction.
• Échantillon testé : échantillon d’ARN dénaturé
• Contrôle positif externe (EPC) : 4a – EPC Rota A/B/C
dénaturé (contient l’ARN de l’IPC)
• Contrôle d’extraction négatif (NEC) : NEC dénaturé
• Contrôle négatif d’amplification (NTC) : 6 – Negative control
dénaturé
2
™
Notice d’utilisation du VetMAX Rotavirus A/B/C Kit
Consignes pour l’analyse des données
• Suivez le guide de l’utilisateur de l’instrument de PCR en temps réel pour l’analyse des données brutes.
• Fixer les seuils pour chaque cible séparément. Définissez la ligne de base pour l’analyse des données. Utilisez le réglage de la ligne de
™
™
™
base automatique pour ABY (cible RVA) et VIC (cible RVC), ainsi que le réglage de la ligne de base manuelle (3-15) pour FAM (cible
™
RVB) et Cy5 (cible IPC). Si la ligne de base recommandée n’est pas optimale, ajustez la ligne de base comme souhaité.
• Voir le Certificat d’analyse (CoA) pour connaître le lot de fabrication du kit, afin de valider le test et d’interpréter les résultats. Pour localiser
le CoA, consulter le site thermofisher.com, puis saisir le numéro de lot de votre kit dans la barre de recherche.
Critères de validation
Reportez-vous aux valeurs Ct CQ dans le certificat d’analyse du lot de fabrication de votre kit. Le test est validé si les critères de Ct suivants
sont respectés :
Type de réaction
Contrôle positif
externe (EPC)
Contrôle d’extraction
négatif (NEC)
Contrôle négatif
d’amplification (NTC)
Cible RVA
(fluorophore ABY™)
Cible RVB
(fluorophore FAM™)
Cible RVC
(fluorophore VIC™)
Cible IPC
(fluorophore Cy5™)
Interprétation
Ct = Ct CQ du RVA
±3 Ct
Ct = Ct CQ du RVB ±3 Ct
Ct = Ct CQ du RVC ±3 Ct
Ct < 40[1]
La PCR est validée.
Ct > 40
Ct > 40
Ct > 40
Ct = Ct CQ de l’IPC ±3 Ct
Ct > 40
Ct > 40
Ct > 40
Ct > 40
L’extraction d’ARN
est validée.
Les réactifs PCR sont
validés.
[1] Un signal positif est attendu.
Interprétation des résultats
Rotavirus (A, B ou C) ARN cibles (fluorophores ABY™, FAM™ et VIC™)
IPC ARN cible (fluorophore Cy5™)
Interprétation
Ct < 37
Ct > 40
37 ≤ Ct ≤ 40 [2]
Ct ≥ 40
Ct = toute valeur[1]
Rotavirus détecté
Rotavirus non détecté
Résultat suspect
Résultat invalidé
Ct ≤ Ct du NEC +3 Ct
Ct > Ct du NEC +3 Ct[3]
[1] Les niveaux élevés d’ARN rotavirus dans l’échantillon peuvent diminuer le signal de l’IPC.
[2] Voir “Retester les échantillons ayant des résultats douteux” en page 3.
[3] La valeur de C de l’IPC pour chaque échantillon doit être inférieure ou égale à la valeur C de l’IPC NEC+3 C . Voir “Retester les échantillons ayant des résultats invalidés” en
t
t
t
page 3.
Retester les échantillons ayant des résultats
douteux
1. Répéter le test de RT-PCR temps réel avec 8 µl de l’ARN extrait
et dénaturé en trois replicats.
2. Déterminer le nombre d’échantillons avec une valeur de Ct
< 40.
Nombre de tests
Résultat
0 sur 3
1 sur 3
Rotavirus non détecté.
Détection présumée d’un rotavirus ; confirmer à
l’aide d’une méthode de test secondaire.
Rotavirus détecté.
≥ 2 sur 3
Assistance à la clientèle et support technique
Consulter la page thermofisher.com/support pour obtenir des
informations sur les services et l’assistance, et leurs coordonnées.
Garantie limitée du produit
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent
leurs produits selon les conditions générales
de vente de Life Technologies disponibles sur
le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-andconditions.html. Pour toute question, prendre contact avec Life
Technologies à l’adresse www.thermofisher.com/support.
Retester les échantillons ayant des résultats
invalidés
1. Diluer l’échantillon d’ARN extrait au 1:10 dans un tampon
TE 1X ou dans de l’eau exempte de nucléases.
2. Dénaturer l’ARN dilué par chauffage, puis répéter la procédure
de RT-PCR temps réel avec 8 µl de l’ARN dilué.
3. Interpréter les résultats comme suit.
Interprétation
Résultat
L’ARN dilué est positif pour au moins un
rotavirus.
L’ARN dilué est négatif pour les espèces de
rotavirus A, B et C, et le résultat de l’IPC est
conforme.
L’ARN dilué est négatif les espèces de
rotavirus A, B et C, et le résultat de l’IPC
n’est pas conforme.
Le résultat est validé.
Le résultat est invalide.
4. Pour des échantillons dilués dont les résultats sont invalidés,
recommencer la procédure d’extraction d’ARN avec un nouvel
aliquot du lysat de l’échantillon d’origine.
™
Notice d’utilisation du VetMAX Rotavirus A/B/C Kit
3
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils – Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – France
Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition.
Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN0029772 F.
Historique des révisions : Pub. nº MAN0029772 F
Révision
Date
Description
F
16 juillet 2025
Dans “Retester les échantillons ayant des résultats invalidés” en page 3, l'interprétation des résultats invalides a été
corrigée.
E
8 mai 2025
• Le volume d’IPC recommandé à ajouter lors du protocole d’extraction a été mis à jour (voir “Consignes pour
l’extraction d’ARN” en page 1).
• Le terme RT-qPCR a été modifié en RT-PCR temps réel dans tout le document.
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE
TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À
SON USAGE OU EN RÉSULTANT.
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conditions générales de toutes les licences à usage limité.
©2024-2025 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication
contraire. TaqMan est une marque de Roche Molecular Systems, Inc., utilisée sous autorisation et licence. Cy5 est une marque commerciale de Cytiva et GE Healthcare UK
Limited, utilisée sous autorisation et licence.
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23 juillet 2025
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