NOTICE D’UTILISATION
VetMAX™ M. paratuberculosis 3.0 Kit
Références catalogue A40001754 et A40001753
N° de document A40002341
Pub. nº MAN1001190 Rév. A
Tableau 1 Informations générales
Technique
PCR temps réel (ADN)
• Essais en duplex
• IPC exogène
Espèces
Bovins, ovins, caprins,
camélidés
Échantillons
Type de test
Fèces
En mélange (jusqu’à 10 échantillons
fécaux)[1]
Fèces, matières fécales provenant de litières, organes,
colonies bactériennes, cultures, lait et échantillons
environnementaux (écouvillons, chiffonnettes)
Individuel
[1] Les recommandations et réglementations relatives au mélange peuvent varier selon les pays. Pour l’Allemagne, le mélange d’échantillons est possible conformément aux
méthodes officielles de collecte.
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de
sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation.
Porter des lunettes de protection, des gants et des
vêtements appropriés. Les fiches de données de
sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse suivante :
thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES
POTENTIELS. Lire les informations de sécurité
concernant les risques biologiques sur la page du produit
à l’adresse thermofisher.com. Porter des gants, des
vêtements et des lunettes de protection appropriés.
Description du produit
™
™
Le kit Applied Biosystems VetMAX M. paratuberculosis 3.0
Kit (réf. nº A40001754 et A40001753) permet la détection en
monopuits par PCR temps réel de la Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis, plus connue sous le nom de Mycobacterium
paratuberculosis (MAP), dans l’ADN mycobactérien extrait à partir
d’échantillons individuels ou en mélange dont la liste est dressée
dans le Tableau 1.
Avant la PCR en temps réel, chaque échantillon est traité au cours
d’une procédure d’extraction qui inclut un contrôle positif interne
(IPC), utilisé pour mesurer l’efficacité de l’extraction et l’absence
d’inhibiteurs dans l’échantillon. Le kit comprend également un
contrôle positif externe (EPC) ajouté à la réaction PCR pour mesurer
l’efficacité de l’amplification.
Ce kit comprend les composants suivants.
• 3 – Mix M. paratuberculosis 3.0 : contient des amorces, des
™
sondes TaqMan , des tampons, des enzymes et un fluorophore
™
ROX optimisés pour une amplification de PCR en duplex des
cibles MAP et IPC.
• 4a – EPC M. paratuberculosis 3.0 : matrice ADN qui sert
d’EPC pour la réaction PCR. Pour connaître la concentration,
se référer au Certificat d’analyse.
• 5 – IPC M. paratuberculosis 3.0 : IPC exogène qui peut être
ajouté à chaque échantillon et contrôle lors de la procédure
d’extraction de l’ADN. Il sert de contrôle pour le processus
d’extraction de l’ADN.
• 6 – Negative Control : eau sans nucléase qui sert de contrôle
négatif d’amplification (NTC) pour les réactions PCR.
Le kit cible la séquence d’insertion IS900, qui fait partie de la
famille IS110 de séquences d’insertion et est répétée entre 14 et
18 fois sur le génome.
Contenu et conservation
Tableau 2 VetMAX™ M. paratuberculosis 3.0 Kit
Composant
3 – Mix M. paratuberculosis 3.0
4a – EPC M. paratuberculosis 3.0
5 – IPC M. paratuberculosis 3.0
6 – Negative Control
Quantité
100 réactions (N° réf. A40001754)
500 réactions (N° réf. A40001753)
2 × 500 µl
2 × 90 µl
500 µl
180 µl
10 × 500 µl
2 × 90 µl
5 × 500 µl
2 × 180 µl
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
Conservation
-30°C à -10°C
Matériel requis non fourni
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur
thermofisher.com. "PFL" indique que le matériel est disponible sur
fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de
laboratoire. Les références catalogue qui s’affichent sous forme de
liens ouvrent les pages Web de ces produits.
Article
Source
Instrument de PCR en temps réel, parmi les modèles suivants ou
équivalents :
Applied Biosystems™ 7500 Real-Time PCR
System
• Precision Plate Holder pour les plaques
(A24820)
• Precision Plate Holder pour les tubes
0,2 ml et les barrettes (4367033)
Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time
PCR System
• Precision Plate Holder pour les plaques
(4359652)
• 7500 Fast Precision Plate Holder pour
les barrettes de tubes 0,1 ml (A29252)
Contacter un représentant
commercial local.
Centrifugeuse de paillasse ou centrifugeuse
avec adaptateur de plaque
Agitateur de laboratoire (Vortex ou
équivalent)
Plaques de réaction optiques, barrettes,
tubes ou capillaires, et couvercles pour
plaques ou bouchons compatibles
Réactifs
Eau sans nucléase
1X tampon Tris-EDTA (TE) ou équivalent
1X solution saline dans un tampon
phosphate (PBS), ou l’équivalent
PFL
PFL
thermofisher.com/plastics
PFL
PFL
PFL
Instructions
• Pour chaque exécution de PCR, inclure les contrôles indiqués à
l’étape “Préparer les réactions PCR” en page 2.
• Respecter les bonnes pratiques de laboratoire pour aider à
éviter les faux positifs et la contamination des échantillons
testés par des produits de PCR (voir “Bonnes pratiques de
laboratoire pour la PCR et la RT-PCR” en page 3).
Consignes pour l’extraction de l’ADN et les
contrôles
Étape, processus ou
paramètre
Méthode
recommandée
d’extraction de l’ADN
Préparer le contrôle
d’extraction négatif
(NEC)
Étape supplémentaire
pendant l’extraction
de l’ADN pour les
échantillons à tester et
le NEC
2
Recommandation
Voir VetMAX M. paratuberculosis 3.0
Kit Notice d’utilisation supplémentaire (pub.
nº MAN1000713) à l’aide du kit Applied
Biosystems™ MagMAX™ CORE Nucleic Acid
Purification Kit (réf. nº A32700, A32702).
Préparer au moins un NEC en utilisant de l’eau
sans nucléase comme matériel de départ. Traiter
le NEC simultanément avec la même procédure
d’extraction de l’ADN que les échantillons testés.
Le NEC est constitué des composants utilisés
dans l’extraction sans ajouter l’échantillon et
suit la même procédure que les échantillons,
y compris l’extraction de l’ADN (avec ajout de
l’IPC), puis la PCR.
Ajouter 5 µl de 5 – IPC M. paratuberculosis 3.0
pendant l’étape de lyse de l’extraction de l’ADN.
™
1. Bien mélanger 3 – Mix M. paratuberculosis 3.0, puis centrifuger
brièvement.
2. Ajouter 10 µl de 3 – Mix M. paratuberculosis 3.0 dans le
nombre approprié de puits de plaques ou de tubes.
3. Ajouter le composant indiqué pour chaque type de réaction.
Type de réaction
PFL
thermofisher.com/
pipettetips
Cônes de pipette sans nucléase
1. Décongeler 3 – Mix M. paratuberculosis 3.0, 4a – EPC M.
paratuberculosis 3.0, 5 – IPC M. paratuberculosis 3.0 et 6 –
Negative Control sur de la glace ou un portoir réfrigérant.
2. Vortexer chaque tube de façon à ce qu’il soit soigneusement
mélangé, puis centrifuger brièvement pour en collecter le
contenu.
Pendant la configuration de la PCR, maintenir les réactifs
décongelés à une température comprise entre 2 et 8°C jusqu’à
utilisation.
Préparer les réactions PCR
Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 RealTime PCR System
Équipement, tubes, plaques et autres consommables
Pipettes ajustables
Avant de commencer
Échantillon testé
Contrôle positif externe
(EPC)
Contrôle d’extraction
négatif (NEC)
Contrôle négatif
d’amplification (NTC)
Volume par
réaction
Composant
Échantillon d’ADN
4a – EPC M.
paratuberculosis 3.0
NEC extrait
5,0 µl
5,0 µl
6 – Negative Control
5,0 µl
5,0 µl
4. Couvrir la plaque ou le tube avec une protection adhésive
transparente ou des bouchons compatibles.
Configurer et démarrer l’instrument PCR en
temps réel
1. En suivant les instructions du fabricant, configurer l’exécution
de PCR à l’aide des paramètres suivants.
• Volume réactionnel : 15 µl
™
• Référence passive : Fluorophore ROX
™
Remarque : le fluorophore ROX doit être sélectionné si
l’instrument est capable de le détecter. Les instruments
™
qui ne détectent pas le fluorophore ROX en tant que
référence passive peuvent être utilisés sans conséquence
sur l’exactitude des lectures.
2. Sélectionner ou créer le programme suivant (compatible avec
le mode rapide ou standard) :
Phases
Cycles
Température
Durée
1
2
1
45
95°C
95°C
60°C[1]
5 minutes
5 secondes
30 secondes[2]
[1] Les données de fluorescence sont collectées au cours de la phase de
30 secondes à 60°C.
[2] En fonction de l’instrument utilisé, il peut être nécessaire de passer à
31 secondes.
3. Sélectionner ou créer des détecteurs de fluorophores, puis
assigner à chaque tube ou puits.
Cible
Reporter
Quencher
MAP
IPC
Fluorophore FAM™
Fluorophore VIC™
Quencher non fluorescent (NFQ)
4. Lancer le test.
™
VetMAX M. paratuberculosis 3.0 Kit Notice d’utilisation
Consignes pour l’analyse des données
•
•
•
•
Suivre le guide de l’utilisateur de l’instrument pour l’analyse des données brutes.
Fixer les seuils pour chaque cible séparément.
Pour chaque détecteur, interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct de l’échantillon obtenues.
Voir le Certificat d’analyse (CoA) pour connaître le lot de fabrication du kit, afin de valider le test et d’interpréter les résultats. Pour localiser
le CoA, consulter le site thermofisher.com, puis saisir le numéro de lot de votre kit dans la barre de recherche.
Critères de validation
Se référer aux valeurs CtQC dans le certificat d’analyse du lot de fabrication du kit. Le test est validé si les critères suivants sont respectés :
Type de réaction
Cible MAP (fluorophore FAM™)
Cible IPC (fluorophore VIC™)
Interprétation
4a – EPC M. paratuberculosis Ct = CtQC de 4a – EPC M. paratuberculosis 3.0
Toute valeur[2]
La PCR est validée.
3.0
± 3 Ct[1]
Contrôle d’extraction négatif
Ct = CtQC de 5 – IPC M. paratuberculosis 3.0 L’extraction de l’ADN est
Ct > 45
(NEC)
± 3 Ct[3]
validée.
Contrôle négatif d’amplification
Les réactifs PCR sont
Ct > 45
Ct > 45
(NTC)
validés.
[1] Voir le tableau EPC dans le Certificat d’analyse.
[2] La valeur de C IPC de l'EPC n’est pas utilisée pour l’interprétation des résultats d’échantillon.
t
[3] Voir le tableau IPC dans le Certificat d’analyse.
Interprétation des résultats
Cible MAP (fluorophore FAM™)
Cible IPC (fluorophore VIC™)
Interprétation
Ct < 45
Ct > 45
Ct > 45
Toute valeur
Ct ≤ Ct du NEC +3 Ct [1]
Ct > Ct du NEC +3 Ct[1]
M. paratuberculosis est détectée.
M. paratuberculosis n’est pas détectée.
Résultat invalide en raison d’une valeur hors gamme.[2]
[1] La valeur de C du contrôle d’extraction doit d’abord être validée comme décrit dans le paragraphe “Critères de validation” en page 3.
t
[2] Se référer à la valeur de C de l’IPC obtenue pour le NEC. La valeur de C de l’IPC obtenue pour ce NEC doit être validée (voir “Critères de validation”).
t
t
Retester les échantillons ayant des résultats
invalidés
1. Diluer les échantillons d’ADN au 1:10 dans un tampon TE 1X.
2. Recommencer l’exécution de PCR avec 5 µl d'ADN dilué, puis
interpréter les résultats comme suit.
Résultat
L’ADN dilué est détecté pour la MAP.
L’ADN dilué n’est pas détecté pour la MAP,
mais le résultat IPC est conforme.
L’ADN dilué est négatif pour la MAP, mais le
résultat IPC n’est pas conforme.
Interprétation
Le résultat est validé.
Le résultat est invalide.
3. Pour les échantillons d’ADN dilués dont les résultats sont
invalides, répéter la procédure avec un nouvel échantillon.
Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et
la RT-PCR
• Porter des gants et une blouse de laboratoire propres.
– Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux
précédemment portés pour manipuler des produits amplifiés
ou préparer des échantillons.
• Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à
leur contamination possible.
• Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et
des fournitures dédiés pour les étapes suivantes :
– Préparation des échantillons et configuration de la réaction.
– Amplification et analyse des produits.
• Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone pré-PCR
de la réaction.
• Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter
toute projection ou création d’aérosols.
• Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure
du possible.
• Utiliser une pipette à piston ou des embouts de pipette résistant
aux aérosols.
• Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de
laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une
solution de décontamination ADN.
Assistance à la clientèle et support technique
Consulter la page thermofisher.com/support pour obtenir des
informations sur les services et l’assistance, et leurs coordonnées.
Garantie limitée du produit
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les conditions générales de vente de Life Technologies
disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Pour toute question, prendre contact avec
Life Technologies à l’adresse www.thermofisher.com/support.
™
VetMAX M. paratuberculosis 3.0 Kit Notice d’utilisation
3
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils – Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – France
Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition.
Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN1000712 B.
Historique des révisions : Pub. nº MAN1000712 B
Révision
Date
Description
B
30 janvier 2025
• La description du NEC a été corrigée (voir “Consignes pour l’extraction de l’ADN et les contrôles” en page 2).
• Des corrections mineures ont été apportées à la formulation (voir “Description du produit” en page 1 et Tableau 1).
A
6 décembre 2024
Nouveau document pour VetMAX M. paratuberculosis 3.0 Kit.
™
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE
TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À
SON USAGE OU EN RÉSULTANT.
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conditions générales de toutes les licences à usage limité.
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contraire.
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5 mars 2025
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