Thermo Fisher Scientific VetMAX NDV Kit Mode d'emploi

NOTICE D’UTILISATION
VetMAX™ NDV Kit
TaqMan® RT-PCR temps réel pour la détection du paramyxovirus de type 1
Référence Catalogue NDV
Partie Nº 100020400 Pub. Nº MAN0008825 Rév. B.0
Technique
Espèces
Matrice
Type de test
Volaille
Écouvillons trachéaux, cloacaux
Fèces
Tissus
Individuel
RT-PCR temps réel (ARN)
•
Test en duplex
•
Contrôle Xeno™ RNA
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes
de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse
thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques
du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Matériel requis non fourni
Informations sur le produit
Nom, utilisation prévue et principe de la procédure
Applied Biosystems™ VetMAX™ NDV Kit (Réf. NDV) permet la
détection par reverse-transcription PCR (RT-PCR) en temps réel
du paramyxovirus de type 1 à partir d’écouvillons, de fèces ou
de tissus.
Le NDV est un paramyxovirus enveloppé de type 1 à ARN
simple brin responsable de la maladie de Newcastle, une maladie
infectieuse et contagieuse qui touche les oiseaux domestiques et
sauvages.
Le VetMAX™ NDV Kit contient les tests et les réactifs nécessaires
à la RT-PCR temps réel monocupule dans laquelle l’ARN est
transcrit en ADNc, et les cibles NDV et Xeno™ RNA sont
amplifiées et détectées à l’aide de sondes fluorescentes TaqMan®
(chimie d’hydrolyse de sonde). Il contient :
• 25X NDV Primer Probe Mix : primers et sondes TaqMan® pour
l’amplification par PCR temps réel optimisée en duplex des
cibles NDV et Xeno™ RNA.
•
2X qRT-PCR Buffer : tampon RT-PCR.
•
•
25X qRT-PCR Enzyme Mix : enzyme RT-PCR.
25X NDV Control RNA : sert de contrôle positif externe pour les
composants de la RT-PCR temps réel et permet également de
définir le seuil de cycle (Ct) pour évaluer les résultats du test.
Contrôle Xeno™ RNA : le contrôle positif interne est ajouté à
chaque échantillon et contrôle lors de la lyse de la procédure
d’extraction d’ARN. Il sert de contrôle positif interne pour le
processus de purification d’ARN et permet de surveiller la
présence des inhibiteurs de RT-PCR.
•
Réactifs du kit et conservation
Les réactifs sont fournis pour 100 tests de RT-PCR temps réel 25-µL.
Composant
Volume
Conservation
25X NDV Primer Probe Mix
110 µL
−30°C à −10°C
2X qRT-PCR Buffer
1375 µL
−30°C à −10°C
25X qRT-PCR Enzyme Mix
110 µL
−30°C à −10°C
Nuclease-free Water
1750 µL
−30°C à +25°C
25X NDV Control RNA
15 µL
−25°C à −15°C
Xeno™ RNA Control (10,000 copies/µL)
110 µL
−25°C à −15°C
Nucleic Acid Dilution Solution
500 µL
−30°C à −10°C
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur
thermofisher.com. PFL : Fisher Scientific (fisherscientific.com) ou
l’un des principaux fournisseurs de matériel de laboratoire.
Élément
Source
Thermocycler de PCR temps réel capable de détecter :
• FAM™ (émission maximale : λ515 nm)
• CAL Fluor™ Orange 560
(émission maximale : λ561 nm)
PFL
Plaque PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits),
microtubes ou capillaires compatibles avec le
thermocycler utilisé
PFL
Film de fermeture de plaque ou bouchons adaptés
PFL
Pipettes et embouts de pipettes à filtres nuclease-free
PFL
Tubes nuclease-free pour la préparation du master mix
PFL
2 seaux à glace ou portoirs réfrigérants :
• Un pour la zone de la PCR où est préparé le master
mix pour la RT-PCR
• Un pour la zone où de l’ARN peut être présent
PFL
Tampon TE 1X
PFL
Eau DNase/RNase-free
PFL
Isoler l’ARN des échantillons
L’extraction d’ARN à partir des échantillons de départ est
nécessaire avant l’analyse par PCR temps réel.
Étape ou processus
Recommandation
Préparation des
échantillons négatifs
purifiés à utiliser
comme contrôle
négatif d’extraction
Préparer les échantillons négatifs purifiés,
avec Nuclease-free Water comme matériel
de départ. Procéder avec la méthode
d’isolation d’ARN utilisée pour les
échantillons à tester.
Méthodes d’isolation
de l’ARN proposées
MagMAX™-96 Viral RNA Isolation Kit
(Réfs. AM1836, AMB18365) ou une méthode
d’isolation d’ARN équivalente.
Modifications
nécessaires de la
méthode d’isolation
d’ARN
• Distribuer 1 µL de contrôle Xeno™ RNA non
dilué par isolation dans la solution de lyse
utilisée pour l’isolation de l’ARN.
• Distribuer l’ARN carrier dans la solution de
lyse conformément aux recommandations du
fournisseur. L’ARN carrier est fourni dans le
MagMAX™-96 Viral RNA Isolation Kit
(Réfs. AM1836, AMB18365).
Effectuer la RT-PCR temps réel
1
2
3
4
Déterminer le
nombre de
réactions et
décongeler les
réactifs.
Préparer le
Contrôle Positif
NDV dilué.
Préparer le master
mix de RT-PCR
temps réel sur la
glace.
Préparer les
réactions de
RT-PCR temps réel.
a.
Pour chaque analyse par RT-PCR temps réel, inclure les réactions suivantes :
• Contrôle positif ; utiliser 10.5 µL de Contrôle Positif NDV dilué.
• Contrôle d’extraction ; utiliser 10.5 µL de contrôle négatif d’extraction purifié.
• Contrôle sans matrice ; utiliser Nuclease-free Water à la place de l’ARN de l’échantillon.
b.
Décongeler les réactifs composant le master mix de PCR dans un seau à glace ou un portoir
réfrigérant, et les contrôles et les échantillons dans un autre seau à glace ou portoir réfrigérant.
Vortexer délicatement chaque tube pour bien mélanger son contenu puis le centrifuger
brièvement pour recueillir la solution au fond du tube. Laisser les réactifs sur la glace ou sur un
portoir réfrigérant.
Combiner les composants suivants et placer le mélange sur la glace entre 2ºC et 8ºC pour une
utilisation immédiate, ou en dessous de −16ºC pour une utilisation ultérieure.
Composant
Volume
Nucleic Acid Dilution Solution
9.5 µL
25X NDV Control RNA
1.0 µL
Volume total de Contrôle Positif NDV dilué
10.5 µL
Combiner les composants suivants pour le nombre de réactions nécessaires et prévoir 10 % en plus.
Composant
Volume par réaction
2X qRT-PCR Buffer
12.5 µL
25X qRT-PCR Enzyme Mix
1.0 µL
25X NDV Primer Probe Mix
1.0 µL
Volume total du master mix de RT-PCR temps réel
14.5 µL
a.
b.
Distribuer 14.5 µL de master mix de RT-PCR temps réel par puits de plaque PCR, barrette PCR
ou capillaire utilisé.
Ajouter le composant approprié au type d’échantillon, conformément au tableau suivant :
Type d’échantillons
Composant
Volume par réaction
ARN de l’échantillon
10.5 µL
Contrôle Positif NDV dilué
10.5 µL
Contrôle d’extraction
Contrôle négatif d’extraction purifié
10.5 µL
Contrôle sans matrice
Nuclease-free Water
10.5 µL
Échantillon à tester
Contrôle positif
5
Paramétrer et
démarrer
l’instrument de
RT-PCR temps réel.
c.
Fermer la plaque PCR, la barrette PCR ou les capillaires.
a.
Selon les recommandations du fournisseur, utiliser les paramètres suivants pour l’analyse
RT-PCR temps réel.
• Volume de réaction : 25 µL
• Référence passive ROX™ : inclus dans 2X qRT-PCR Buffer (à renseigner obligatoirement si le
thermocycler est capable de détecter le fluorochrome ROX™)
b.
Attribuer les reporters de sonde TaqMan® et les quenchers pour chaque puits, tube ou
capillaire utilisé pour l’analyse :
Cible
Reporter
Quencher
FAM™
BHQ™-1
CAL Fluor™ Orange 560
BHQ™-1
NDV
Contrôle Xeno™ RNA
Note : Utiliser si possible CAL Fluor™ Orange 560 pour calibrer le thermocycler. Sinon, utiliser
des détecteurs équivalents tels que VIC™.
c.
Démarrer le programme du thermocycler et collecter les données de l’amplification en temps
réel pendant l’étape de l’élongation (45 secondes à 60ºC). Utiliser les paramètres suivants pour
le thermocycler :
Étape
2
Répétitions
Température
Durée
1
1×
48ºC
10 minutes
2
1×
95ºC
10 minutes
3
40×
95ºC
15 secondes
60ºC
45 secondes
VetMAX™ NDV Kit Notice d’Utilisation
Analyse des données
Consulter les recommandations du fabricant du thermocycler pour l’analyse des données brutes.
1. Définir les seuils séparément pour chaque cible de RT-PCR temps réel.
2. Interpréter les résultats pour chaque contrôle et échantillon conformément aux valeurs de Ct obtenues, comme indiqué dans la
section ci-dessous.
Validation du test
L’analyse est validée si les critères suivants sont satisfaits :
Type de contrôle
Valeur Ct pour l’ARN NDV
Valeur Ct pour le contrôle de Xeno™ RNA
24–27
>40 (aucun signal détecté)
Contrôle d’extraction
>40 (aucun signal détecté)
29–34
Contrôle sans matrice
>40 (aucun signal détecté)
>40 (aucun signal détecté)
Valeur Ct pour le contrôle Xeno™ RNA
Interprétation
<40
Échantillon positif pour NDV
>40 (aucun signal détecté)
< Contrôle d’extraction Ct ± 3Ct
Échantillon négatif pour NDV
>40 (aucun signal détecté)
>40 (aucun signal détecté)
Non validé(1)
Contrôle positif
Interprétation des résultats
Valeur Ct pour l’ARN NDV
<40
(1)
Voir « Troubleshooting ».
Troubleshooting
Observation
Échantillons à tester
Contrôle Xeno™ RNA—aucun signal
ARN NDV—signal fort
Échantillons à tester
ARN NDV—aucun signal
Cause possible
Action recommandée
Les primers et les sondes pour le contrôle
Xeno™ RNA sont présents dans les réactions de
RT-PCR aux concentrations limites.
Des niveaux élevés d’ARN NDV dans un
échantillon peuvent réduire l’amplification du
contrôle Xeno™ RNA.
Aucun signal ou un signal faible du contrôle Xeno™ RNA
est prévisible dans une réaction qui présente un signal
fort pour l’ARN NDV.
Le contrôle Xeno™ RNA a été omis
Vérifier que le contrôle Xeno™ RNA a été ajouté dans la
solution de lyse pendant l’extraction de l’ARN.
Faible récupération de l’ARN
Vérifier la récupération de l’ARN carrier utilisé dans
l’extraction de l’ARN.
Les échantillons d’ARN contiennent des
inhibiteurs de RT-PCR
Réduire la quantité d’échantillon utilisé dans les
réactions de RT-PCR. Par exemple :
Contrôle Xeno™ RNA—aucun signal
• Utiliser 1–2 µL d’échantillon (ajouter Nuclease-free
Water afin que la réaction soit au volume souhaité)
• Diluer l’échantillon d’ARN au 1:10 dans la solution de
•
Faible récupération de l’ARN
Ou
Les échantillons d’ARN contiennent des
inhibiteurs de RT-PCR
VetMAX™ NDV Kit Notice d’Utilisation
dilution d’acide nucléique avant de l’ajouter dans la
réaction.
Les valeurs Ct pour le contrôle Xeno™ RNA et les
amplifications NDV vont vraisemblablement diminuer
proportionnellement à la diminution de la quantité
d’échantillon (~2–3Ct).
Comparer les résultats de l’amplification de l’ARN de
l’échantillon à l’aide du master mix de RT-PCR avec et
sans 1 µL de contrôle Xeno™ RNA :
• Si les réactions amplifiées à l’aide du master mix de
RT-PCR avec ajout de contrôle Xeno™ RNA émettent un
signal alors que les réactions amplifiées à l’aide du
master mix de RT-PCR sans ajout de contrôle Xeno™
RNA n’émettent aucun signal, le contrôle Xeno™ RNA
n’a pas été récupéré.
• Si le signal du contrôle Xeno™ RNA n’est détecté dans
aucun échantillon, l’échantillon d’ARN contient des
inhibiteurs de RT-PCR temps réel.
3
Observation
Réaction de contrôle positif
Contrôle Positif NDV—aucun signal
Contrôle Xeno™ RNA—aucun signal
Réaction de contrôle sans matrice
Cause possible
Action recommandée
Le contrôle positif NDV n’a pas été manipulé
correctement, occasionnant une dégradation
de l’ARN.
Prendre les précautions qui s’imposent contre la
contamination par RNase lors de la manipulation des ARN
de contrôle. Par exemple, porter des gants propres et
utiliser des embouts de pipettes nuclease-free.
Le 25X qRT-PCR Enzyme Mix a été stocké ou
manipulé de façon incorrecte, et est devenu
moins actif.
Répéter la RT-PCR avec de nouveaux réactifs.
Le thermocycler n’a pas été paramétré
correctement.
Vérifier les paramètres du thermocycler. Voir « Paramétrer
et démarrer l’instrument de PCR temps réel » page 2.
Le master mix de RT-PCR a été préparé de
façon incorrecte.
Répéter le test avec un master mix de RT-PCR préparé
de façon correcte.
Contamination pendant la PCR.
• Répéter la RT-PCR temps réel avec de nouveaux
réactifs et des pipettes fraichement décontaminées.
ARN NDV—signal détecté
ou
Contrôle Xeno™ RNA—signal détecté
Réaction de contrôle d’extraction
• Préparer la RT-PCR temps réel dans une zone isolée
des zones utilisées pour l’isolation de l’ARN et l’analyse
du produit par PCR.
Contamination pendant l’extraction de l’ARN
ou la PCR.
• Répéter l’isolation de l’ARN ou la RT-PCR temps réel
ARN NDV—signal détecté
•
avec de nouveaux réactifs et des pipettes fraichement
décontaminées.
Préparer la RT-PCR temps réel dans une zone isolée
des zones utilisées pour l’isolation de l’ARN et l’analyse
du produit par PCR.
Documentation et support
Service clientèle et assistance technique
Garantie produit limitée
Support technique : rendez-vous sur
thermofisher.com/askaquestion
Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux
dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance
technique, notamment :
• Numéros de téléphone partout dans le monde
• Commande et Support web
• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
• Certificats d’analyse
• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également
appelées FS (Fiches Signalétiques))
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs
produits selon les termes et conditions générales de ventes
disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/
global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous
pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web
suivante : thermofisher.com/support.
Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux
produits chimiques d'autres fabricants, contacter
chaque fabricant.
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France
Traduit de l’anglaise Pub. N° MAN0008826 Rév. B.0.
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT.
Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008826 (anglais)
Révision
Date
B.0
9 mai 2017
Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.
Description
A.0
07 mai 2014
Base de référence pour l’historique de révision
Licence à Usage Limité Nº 460 : Diagnostic vétérinaire PCR. Avis aux acheteurs : destiné à des services de diagnostic vétérinaire, notamment l’établissement de rapports de
diagnostic payants et pour les besoins de la recherche uniquement. Le diagnostic chez l’homme nécessite une licence séparée de Roche.
©2017 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire.
TaqMan est une marque déposée de Roche, utilisée sous autorisation et licence. CAL Fluor et BHQ sont des marques de BioSearch Technologies, Inc.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
9 mai 2017
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