MACHEREY-NAGEL Biologie Moléculaire Bioanalysis User manual Manuel d’utilisation Purification d’ADN génomique n NucleoSpin® gDNA Clean-up Septembre 2023 / Rev. 05 www.mn-net.com www.mn-net.com Purification d’ADN génomique Résumé du protocole (Rev. 05) NucleoSpin® gDNA Clean‑Up 150 μL d’échantillon + 450 μL DB 1 Ajustement des conditions de fixation des ADN Vortexer 5 s (Pour les plus petits volumes d’échantillons, ajuster à 150 μL avec de l’eau, pour les plus grands volumes d’échantillons, augmenter proportionnellement le tampon de fixation). Charger l’échantillon sur la colonne NucleoSpin® gDNA Clean-up 2 Fixation des ADN 11,000 x g 30 s + 700 μL DW Vortex 2 s 1er lavage 11,000 x g 30 s 3 Lavage de la membrane de silice + 700 μL DW Vortex 2 s 2ème lavage 11,000 x g 30 s 11,000 x g 4 Séchage de la membrane de silice 1 min 50 μL DE RT 1 min 11,000 x g 30 s 5 Elution de l’ADN (Optionnel: Répéter l’élution avec le premier éluat ou 50 μL supplémentaires de tampon DE frais. Utiliser du tampon d’élution chauffé à 70 °C peut favoriser l’élution) MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com Purification d'ADN génomique Sommaire 1 Composants 4 1.1 Contenu du kit 4 1.2 Réactifs, consommables et équipement nécessaires 4 1.3 À propos de ce manuel 4 2 Description 5 2.1 Principe général 5 2.2 Caractéristiques du kit 5 2.3 Élimination de l’ARN 6 2.4 Interprétation des valeurs de rendement et de pureté évaluées par spectrophotométrie UV-VIS ? 6 3 Conditions de stockage et de préparation des réactifs 7 4 Instructions de sécurité 8 4.1 Élimination des déchets 8 5 Protocole NucleoSpin® gDNA Clean-Up 9 6 Annexes 11 6.1 Guide de resolution des problèmes 11 6.2 Informations de commande 11 6.3 Restrictions d'utilisation / garantie 12 MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05 3 Purification d'ADN génomique 1 Composants 1.1 Contenu du kit NucleoSpin® gDNA Clean-up 10 preps 740230.10 50 preps 740230.50 250 preps 740230.250 Tampon de fixation DB 25 mL 25 mL 125 mL Tampon de lavage DW (concentré)* 6 mL 25 mL 3 × 50 mL Tampon d’élution DE** 13 mL 13 mL 30 mL Colonnes NucleoSpin gDNA Clean-up (bagues vertes) 10 50 250 Tubes collecteurs (2 mL) 10 50 250 Manuel d’utilisation 1 1 1 REF ® 1.2 Réactifs, consommables et équipement nécessaires Réactifs • Ethanol 96 – 100 % Consommables • Tubes à centrifuger 1,5 mL • Cônes de pipette jetables Equipement • Pipettes manuelles • Centrifugeuse pour microtubes • Équipement de protection individuelle (par exemple : blouse de laboratoire, gants, lunettes) 1.3 À propos de ce manuel Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs du kit NucleoSpin® gDNA Clean-up de lire les chapitres détaillés du protocole de ce manuel d’utilisation. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Celui-ci est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil supplémentaire permettant un suivi rapide des différentes étapes de la procédure de purification. Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante : www.mn-net.com. * Pour la préparation des réactifs et leurs conditions de stockage, voir le chapitre 3. ** Composition du tampon d’élution DE : 5 mM Tris/HCl, pH 8.5 4 MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05 Purification d'ADN génomique 2 Description 2.1 Principe général L’ADN génomique prépurifié, de poids moléculaire particulièrement élevé, et dissous dans l’eau, dans le tampon d’élution ou tout autre tampon de réaction, est tout d’abord mélangé au tampon de fixation DB, puis chargé sur une colonne NucleoSpin® gDNA Clean-up. Les divers contaminants sont éliminés lors de deux étapes de lavage avec le tampon de lavage DW. Après une étape de séchage, l’ADN purifié et concentré peut être élué avec le tampon d’élution DE (Tris/HCl 5 mM, pH 8,5). 2.2 Caractéristiques du kit • Le kit NucleoSpin® gDNA Clean-up est conçu pour la purification rapide de l’ADN génomique de petit et surtout de haut poids moléculaire préalablement extrait. Il est utilisé pour purifier et concentrer l’ADN génomique après des méthodes d’extraction insuffisantes, par exemple à l’aide de Trizol, ou encore après des réactions enzymatiques ou chimiques. • La procédure n’emploie pas de dénaturants organiques ou d’étapes d’extraction au moyen de chloroforme. • Toutes les impuretés, telles que le phénol, les enzymes, les sels, les colorants, les marqueurs, les nucléotides, les petits oligonucléotides et même les détergents en forte concentration jusqu'à 5% (comme par exemple du SDS, Triton, Tween, Lauroylsarcosin) sont complètement éliminées. • Le tampon de fixation DB et le tampon de lavage DW sont spécialement conçus pour permettre la fixation et un lavage très doux afin de maximiser le rendement en ADN de haut poids moléculaire et des fragments d’ADN plus petits (jusqu’à 100 pb). • L’ADN élué est prêt à être utilisé pour toutes les applications standard telles que la PCR, la restriction par endonucléases, le Southern Blot et le marquage. Table 1: Résumé des caractéristiques du kit Paramètre NucleoSpin® gDNA Clean-up Volume type de l’échantillon 150 µL de solution d’ADN Quantité d’ADN < 25 µg Rendement 80 – 90 % Taille des fragments 100 bp – environ. 50 kbp Capacité de fixation 50 µg Volume d’élution 50 – 100 µL Temps de préparations < 15 min/10 preps Format Mini colonne à centrifuge Utilisation Pour la recherche uniquement (RUO) MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05 5 Purification d'ADN génomique 2.3 Élimination de l’ARN Les nucléotides et les petits oligonucléotides sont éliminés par l’utilisation de conditions de fixation douces et des étapes de lavage rigoureuses. Pour éliminer complètement la contamination de l’ADNg par de l’ARN, il est recommandé d’ajouter 1 µg de RNase A (voir ’Informations de commande’) à 150 µL d’échantillon d’ADNg et d’incuber à température ambiante pendant 5 à 15 minutes. 2.4 Interprétation des valeurs de rendement et de pureté évaluées par spectrophotométrie UV-VIS ? La méthode la plus courante pour déterminer le rendement en ADN est la spectrophotométrie UV-VIS. La concentration d’ADN dans l’éluat final peut être calculée à partir de son maximum d’absorption à 260 nm (A₂₆₀), sachant qu’une absorption A₂₆₀ = 1 correspond à 50 µg/mL d’ADN double brin. Toutefois, ce calcul suppose l’absence de tout autre composé absorbant la lumière UV à 260 nm. Toute contamination par du phénol, de l’ARN, des protéines, des détergents, etc. contribue de manière significative à l’absorption totale à 260 nm, ce qui conduit à une surestimation de la concentration réelle d’ADN. Rapport de pureté A₂₆₀/A₂₃₀ Pour évaluer la fiabilité du rendement déterminé à partir des lectures A₂₆₀, le rapport de l’absorption à 260 nm et 230 nm peut être utilisé. Le rapport A₂₆₀/A₂₃₀ doit être supérieur à 2,0 pour l’ADN pur et est acceptable jusqu’à des rapports d’environ 1,5. Des valeurs inférieures ou proches de 1,0 indiquent la présence d’importantes quantités d’impuretés et la concentration réelle d’ADN est bien inférieure à sa valeur calculée à partir de la valeur A₂₆₀. Rapport de pureté A₂₆₀/A₂₈₀ Un autre indicateur de la pureté de l’ADN est le rapport A₂₆₀/A₂₈₀, qui doit être compris entre 1,8 et 1,9. Les valeurs inférieures à 1,8 indiquent une contamination par les protéines, tandis que les valeurs supérieures indiquent une contamination par l’ARN. Toutefois, ce rapport doit être considéré avec prudence, car les contaminations conjointes par des protéines et de l’ARN peuvent se compenser et aboutir à un rapport A₂₆₀/A₂₈₀ parfait. Électrophorèse sur gel d’agarose Idéalement, l’ADN se doit d’être analysé sur un gel d’agarose afin d’évaluer sa qualité en termes de distribution de taille des fragments et pour vérifier la cohérence de la quantification UV-VIS, en particulier si les ratios A₂₆₀/A₂₃₀ et A₂₆₀ / A₂₈₀ ne sont pas optimaux. 6 MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05 Purification d'ADN génomique 3 Conditions de stockage et de préparation des réactifs Attention : Le tampon DB contient du chlorhydrate de guanidine. Porter des gants et des lunettes ! Conditions de stockage : • Tous les composants du kit doivent être conservés à une température comprise entre 15 et 25 °C et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette sur le kit. Le stockage à des températures inférieures peut entraîner la précipitation des sels. En cas de précipitation, incuber le flacon pendant plusieurs minutes à environ 30 – 40 °C et mélanger bien jusqu’à ce que le précipité soit dissous. Avant de commencer la procédure NucleoSpin® gDNA Clean-up, préparer les éléments suivants : • Tampon de lavage DW : ajouter le volume indiqué d’éthanol (96 – 100 %) au tampon DW concentré. Marquer l’étiquette du flacon pour indiquer que de l’éthanol a été ajouté. Le tampon DW est stable à température ambiante (15 – 25 °C) pendant au moins un an. NucleoSpin® gDNA Clean-up REF Tampon de lavage DW (concentré) 10 preps 740230.10 50 preps 740230.50 250 preps 740230.250 6 mL Ajouter 14 mL d’éthanol 25 mL Ajouter 60 mL d’éthanol 3 × 50 mL Ajouter 110 mL d’éthanol dans chaque bouteille MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05 7 Purification d'ADN génomique 4 Instructions de sécurité Lorsque vous travaillez avec les kits NucleoSpin® gDNA Clean-up, portez des vêtements de protection appropriés (par exemple, une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité (FDS disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds). Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon DB peut former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, ne pas ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation d’échantillons. Les déchets générés par le kit NucleoSpin® gDNA Clean-up n’ont pas été testés pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du traitement fortement dénaturant réalisé avec le tampon de lyse, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme potentiellement infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux règles de sécurité locales 4.1 Élimination des déchets Éliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du matériel biologique de manière sûre et conforme aux dispositions règlementaires locales. 8 MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05 NucleoSpin® gDNA Clean‑up 5 Protocole NucleoSpin® gDNA Clean-Up Avant de débuter le protocole Vérifier si le tampon de lavage DW a été préparé conformément au chapitre 3. 1 Créer les conditions de fixation de l’ADN Ajouter 450 µL de tampon de fixation DB à 150 µL de solution d’ADN à purifier. Mélanger au vortex pendant 5 s. Note : si le volume de l’échantillon est inférieur à 150 µL, compléter avec de l’eau jusqu’à 150 µL. Si plus de 150 µL d’échantillon doivent être traités, augmenter le Binding Buffer DB proportionnellement. Plusieurs étapes de chargement peuvent alors être nécessaires à l’étape 2. 2 150 µL échantillon + 450 µL DB Vortex 5 s Fixer l’ADN Placer une colonne NucleoSpin® gDNA Clean-up dans un tube collecteur (2 mL). Charger l’échantillon Charger jusqu’à 700 µL d’échantillon sur la colonne. Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur 3 11,000 x g 30 s Laver la membrane de silice + 700 µL DW 1er lavage Déposer 700 µL de tampon DW sur la colonne NucleoSpin® gDNA-Clean-up. Refermer puis vortexer la colonne pendant 2 s, puis centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g. Vortex 2 s 11,000 x g 30 s Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. 2ème lavage Déposer 700 µL de tampon DW sur la colonne NucleoSpin® gDNA-Clean-up. + 700 µL DW Refermer puis vortexer la colonne pendant 2 s, puis centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g. Vortex 2 s Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. 11,000 x g 30 s MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05 9 NucleoSpin® gDNA Clean‑up 4 Sécher la membrane de silice Centrifuger pendant 1 minute à 11 000 x g et jeter le tube collecteur. 11,000 x g 1 min Note : des résidus de tampon de lavage contenant de l’éthanol peuvent inhiber les réactions enzymatiques. 5 Eluer l’ADN Placer la NucleoSpin® gDNA Clean-up dans un nouveau tube 1,5 mL (non fourni). + 50 µL DE RT 1 min Déposer 50 µL de tampon DE sur la colonne. Ne pas refermer la colonne et incuber pendant 1 minute à température ambiante. Refermer la colonne et centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g. Note : il est possible d’augmenter le rendement ADN en procédant à une deuxième élution. Il faut soit réappliquer le premier éluat sur la colonne, soit déposer 50 µL de nouveau tampon d’élution DE. L’augmentation de la température du tampon d’élution à 70 °C peut encore augmenter l’efficacité de l’élution. 10 MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05 11,000 x g 1 min Purification d'ADN génomique 6 Annexes 6.1 Guide de resolution des problèmes Problème Cause possible et suggestions Mauvaise utilisation ou préparation des réactifs Rendement d’ADN faible ou nul • Toujours distribuer exactement les volumes de tampon indiqués dans le protocole ! • Toujours suivre scrupuleusement les instructions données en ce qui concerne l’ordre et le mode de mélange (agitation, vortex, etc.). • Ajouter le volume indiqué d’éthanol (96 – 100 %) au tampon de lavage DW concentré et mélanger soigneusement (voir chapitre 5 pour plus d’informations). • Garder les flacons bien fermés afin d’éviter l’évaporation ou la contamination des solutions. Contamination par de l’éthanol ou des sels Performance insuffisante de l’ADN dans les applications ultérieures 6.2 • Veiller à sécher complètement la membrane de silice de la colonne NucleoSpin® gDNA Clean-up avant l’élution afin d’éviter la contamination par de l’éthanol provenant du tampon DW. • Vérifier que le tampon DW a été équilibré à la température ambiante avant utilisation. Le lavage à des températures plus basses diminue l’efficacité de l’élimination des sels. Informations de commande Produit REF Conditionnement ® 740230.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 preps ® NucleoSpin gDNA Clean-up XS 740904.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 preps RNase A (lyophilisée) 740505.50 740505 50 mg 100 mg Tubes collecteurs (2 mL) 740600 1000 NucleoSpin gDNA Clean-Up Visitez le site www.mn-net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit. MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05 11 Purification d'ADN génomique 6.3 Restrictions d'utilisation / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04 Veuillez contacter : MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tel. : +49 24 21 969‑333 [email protected] 12 MACHEREY-NAGEL – 09/2023, Rev. 05 Plasmid DNA Clean up RNA DNA Viral RNA and DNA Protein High throughput Accessories Auxiliary tools www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 [email protected] CH +41 62 388 55 00 [email protected] FR +33 388 68 22 68 [email protected] US +1 888 321 62 24 [email protected] ">
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