Edvo-Kit n° 101
Edvo-Kit n
°
101
Principes et pratique de l’électrophorèse sur gel d’agarose
Objectif expérimental:
L’objectif de cette expérience est de développer une compréhension de base de la théorie de l’électrophorèse et d’acquérir une familiarité pratique avec les processus de séparation de diverses molécules par électrophorèse horizontale sur gel.
Consulter les instructions de stockage page 3.
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Table des Matières
Matériel expérimental
Fournitures supplémentaires
Contexte
Page
3
3
4
Présentation de l’expérience
L’électrophorèse sur gel d’agarose
Guide de l’enseignant
Préparatifs
Résultats et analyse de l’expérience
Questions d’étude et réponses
Appendices
A Guide de dépannage
B Préparation de lots de gel d’agarose
10
11
12
5
7
9
13
14
15
16
Des fi ches de données de sécurité sont disponibles sur notre site internet : www.edvotek.com
EDVOTEK et The Biotechnology Education Company sont des marques déposées appartenant à EDVOTEK, Inc. Ready-to-Load, QuickStrip,
DuraGel, et UltraSpec-Agarose sont des marques déposées appartenant à EDVOTEK, Inc.
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2
Matériel expérimental
ÉCHANTILLONS D’ÉLECTROPHORÈSE READY-TO-LOAD™
Stocker les échantillons QuickStrip™ dans un réfrigérateur immédiatement après réception. Tout autre composant peut être conservé à température ambiante.
Composants (format QuickStrip™)
A Orange
B Violet
C Rouge
Liste de contrôle (√)
E Mélange de colorant
F Mélange de colorant bleu (Bleu 1 + Bleu 2)
❑
❑
❑
❑
❑
❑
REACTIFS ET FOURNITURES
• UltraSpec-Agarose™
• Tampon d’électrophorèse (50x)
• Solution d’essai de charge de colorant
• Pipette de 1 ml
• Micropipettes de transfert
❑
❑
❑
❑
❑
Fournitures supplémentaires
• Appareil d’électrophorèse horizontale
• Source de courant continu
• Micropipettes automatiques avec pointes
• Balance
• Microondes, plaque chauffante ou brûleur
• Pro-pipette
• Fioles ou vases à bec de 250 ml
• Lunettes de protection et gants de laboratoire jetables
• Système de visualisation (lumière blanche)
• Eau distillée ou déionisée
L’expérience n°101 est conçue pour 8 gels.
Stocker les échantillons
QuickStrip™ dans un réfrigérateur immédiatement après réception. Tout autre composant peut être conservé
à température ambiante.
Les composants du kit sont exclusivement d’usage
éducatif. Ils ne doivent en aucun cas être utilisés pour rendre des diagnostics ou à des effets médicaux, et ne doivent pas être consommés par des personnes, ni par des animaux.
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3
4
Contexte
L’électrophorèse sur gel d’agarose est communément utilisée pour séparer des molécules en fonction de leur charge, leur taille et leur forme. Il s’agit d’un moyen de séparation particulièrement effi cace pour des biomolécules chargées telles que l’ADN, l’ARN et les protéines.
Bien que l’électrophorèse sur gel d’agarose soit une technique simple et aisée, elle possède un pouvoir de séparation effi cace. Le gel est fabriqué à travers la dissolution de poudre d’agarose dans de la solution tampon bouillante.
La solution est ensuite refroidie jusqu’à 60° C, puis versée dans un plateau de support, où elle se solidifi e. Le support est alors submergé dans un appareil d’électrophorèse à électrodes contenant de la solution tampon.
Afi n de les préparer pour l’électrophorèse, les échantillons sont mélangés avec des composants qui leur donnent plus de densité, tels le glycérol ou le sucrose. Ces derniers rendent les échantillons plus denses que le tampon d’électrophorèse. Les échantillons peuvent alors être déposés à l’aide d’une micropipette ou d’une pipette de transfert dans des encoches créées dans le gel à partir d’un gabarit lors du coulage. Grâce à leur densité, les
échantillons sont submergés dans la solution tampon et demeurent dans les puits.
L’appareil d’électrophorèse est branché à une source de courant continu direct et mis sous tension. Les molécules chargées contenues dans les échantillons pénètrent alors le gel à travers des capillaires. Les molécules dont la charge nette est négative migrent vers l’électrode positive de l’appareil d’électrophorèse (anode), alors que les molécules dont la charge nette est positive migrent vers l’électrode négative (cathode). Dans une certaine fourchette, plus le champ électrique est fort, plus les molécules migrent rapidement. Le tampon sert à la fois de conducteur à l’électricité et de contrôle du pH. En effet, le pH infl uence la charge et la stabilité des molécules biologiques.
L’agarose est un polysaccharide dérivé de l’agar. Dans cette expérience, on se sert d’Ultra-Spec Agarose™. Ce composant est constitué d’un mélange d’agarose et d’hydrocolloïdes qui rend le gel transparent et résistant. Le gel contient des capillaires microscopiques qui agissent en tant que "tamis" moléculaires. Les propriétés du gel conditionnent la vitesse de migration des molécules : les petites molécules migrent plus rapidement que les grandes.
De plus, des molécules de même masse et charge peuvent présenter des formes différentes : celles de forme plus compacte (les formes arrondies sont plus compactes que les formes allongées) migrent plus rapidement.
Des facteurs tels que la charge, la taille et la forme des molécules, ainsi que les conditions de tamponnage, la concentration du gel et la tension électrique, ont un impact sur la mobilité des molécules dans le gel. Parmi des molécules de masse et de forme moléculaire semblable, les plus chargées migreront plus vite. Par ailleurs, différentes molécules interagissent à des degrés variables avec l’agarose. Moins l’interaction est aisée, plus la migration des molécules est ralentie.
Dans cette expérience, nous soumettrons divers échantillons à l’électrophorèse sur gel d’agarose et nous observerons la vitesse et la direction de leur migration. Les colorants A, B, C et D sont tous trois négativement chargés et ont des pH neutres. Cependant, ces molécules diffèrent par leur structure, leur composition chimique et leur charge. Le colorant F a une charge nette positive et migrera donc dans la direction opposée que celle des autres colorants. De plus, une combinaison de colorants sera déposée dans un même puits lors de cette expérience.
Ceci démontrera le pouvoir de séparation de mélanges complexes de colorants en composants individuels de l’électrophorèse sur gel d’agarose.
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Présentation de l’expérience
OBJECTIF EXPÉRIMENTAL
L’objectif de cette expérience est de développer une compréhension de base de la théorie de l’électrophorèse et d’acquérir une familiarité pratique avec les processus de séparation de diverses molécules par électrophorèse horizontale sur gel.
SÉCURITÉ EN LABORATOIRE
1. L’utilisation courante de gants et lunettes de protection est une bonne pratique de laboratoire.
2. Soyez prudent avec l’utilisation d’appareils pour chauffer ou fondre des réactifs.
3. NE PIPETTEZ PAS DE REACTIFS A LA BOUCHE - UTILISEZ LES PRO-PIPETTES.
4. Soyez prudent en vous servant d’équipement électrique dans le laboratoire.
5. Lavez-vous toujours soigneusement les mains avec du savon et de l’eau après avoir touché des réactifs ou des matériaux biologiques en laboratoire.
CAHIERS DE LABORATOIRE
Les scientifi ques documentent tout ce qui se passe pendant une expérience: les conditions expérimentales, leurs idées, leurs observations et, bien sûr, toutes les données découlant de l’expérience. Aujourd’hui, vous prendrez des notes sur votre expérience dans un cahier de laboratoire ou sur une fi che en papier.
Avant de commencer l’expérience:
• Lisez attentivement l’introduction et le protocole. Utilisez cette information pour former une hypothèse expérimentale.
• Prévoyez résultats de l’expérience.
Au cours de l’expérience:
• Notez vos observations.
Après l’expérience:
• Interprétez les résultats – ceux-ci confi rment-ils ou infi rment-ils votre hypothèse ?
• Si vous deviez refaire l’expérience, que changeriez-vous ? Révisez votre hypothèse en prenant compte de ce changement.
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Principes et pratique de l’électrophorèse sur gel d’agarose
Dispositif expérimental
1
Préparer le gel d’agarose dans le support de coulage.
2
Enlever les vis de jointure et le peigne, puis submerger le gel dans le tampon
à l’intérieur de la cassette d’électrophorèse.
3
Déposer chaque
échantillon dans un puits consécutif.
Edvo-Kit n° 101
4
Fermer le couvercle, brancher les prises
à la source de courant et réaliser l’électrophorèse.
6
Analyser à la plaque lumière blanche.
( - )
5
Après l’électrophorèse, transférer le gel pour visualisation.
6
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L’électrophorèse sur gel d’agarose
1.
50x
Le tampon concentré
Flacon
2.
L’eau distillée
Agarose
4.
60°C
5.
3.
1:00
Attention! Flacon bouillant!
IMPORTANT:
Cette expérience requiert du gel de 7x10 ou 7x14 cm.
Placer le gabarit (peigne) dans la fente du milieu.
Dans le cas où vos connaissances sur la préparation du gel d’agarose et la réalisation de l’électrophorèse seraient limitées, vous pourrez consulter des instructions détaillées et des ressources utiles sur www.edvotek.com
6.
Verser
Attendre
20 min.
7.
60°C
Portez des gants et des lunettes de protection.
1. DILUER le tampon concentré (50x) avec de l’eau distillée afi n d’obtenir du tampon 1x (voir Tableau A).
2. MELANGER la poudre d’agarose avec le tampon 1x dans une fi ole de 250 ml (voir Tableau A).
3. DISSOUDRE la poudre d’agarose en faisant bouillir la solution. CHAUFFER la solution dans le microondes à haute température pendant 1 minute. RETIRER soigneusement la fi ole du microondes et MELANGER la solution
Tableau
A
Gel Individuel UltraSpec-Agarose™ à 0,8%
Taille du support du gel
7 x 7 cm
7 x 10 cm
7 x 14 cm
Tampon concentré (50x)
0.6 ml
1.0 ml
1.2 ml en faisant tournoyer la fi ole. Continuer à CHAUFFER la solution par périodes de 15 minutes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissolue (la solution doit être claire, comme de l’eau).
+
Eau distillée
+
29.4 ml
49.0 ml
58.8 ml
Quantité d’agarose
0.23 g
0.39 g
0.46 g
=
Volume
Total
30 ml
50 ml
60 ml régulière de la chaleur.
5. Pendant que l’agarose refroidit, FERMER le support de coulage à l’aide des vis de jointure caoutchoutées.
PLACER le gabarit (peigne) dans la fente centrale.
6. VERSER la solution d’agarose refroidie dans le support de coulage. Le gel devrait se solidifi er au bout d’une vingtaine de minutes maximum. Le gel se raffermira et deviendra moins transparent en se solidifi ant.
7. ENLEVER les vis de jointure et le peigne. En enlevant le peigne, prendre soin d’éviter d’endommager les puits.
continue
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7
Principes et pratique de l’électrophorèse sur gel d’agarose
L’électrophorèse sur gel d’agarose, continue
8.
9.
Verser
Le tampon d’électrophorèse
(1X)
10.
11.
Edvo-Kit n° 101
Rappel :
Avant de déposer les
échantillons, veillez à ce que le gel soit correctement orienté dans la cuvette de l’appareil..
Portez des gants et des lunettes de protection.
8
8. PLACER le gel (le support) dans la cassette d’électrophorèse. COUVRIR le gel avec le tampon d’électrophorèse 1x (voir Tableau B contenant les volumes recommandés). Le gel doit être submergé dans son intégrité.
9. PERCER le paquet enveloppant le QuickStrip™ avec la pointe d’une pipette. DEPOSER les échantillons (35-
38 μL) dans les puits dans l’ordre indiqué dans le Tableau 1.
10. FERMER le couvercle de sécurité. VERIFIER que le gel soit placé dans la direction correcte.
11. BRANCHER les prises à la source de courant et REALISER l’électrophorèse (voir Tableau C contenant les durées et les tensions).
12. Une fois que l’électrophorèse a été complétée, RETIRER le gel et le support de coulage de la cassette d’électrophorèse et
VISUALISER le gel d’agarose.
Puits 1
Puits 2
Tableau 1: Chargement du gel
Tube A
Tube B
Orange
Violet
Puits 3
Tube C
Rouge
NOTE: Les colorants n’ont pas besoin d’être teints. Analyser et documenter les résultats immédiatement à la suite d’avoir réalisé l’électrophorèse. Les colorants se diffuseront et fi nalement disparaîtront du gel.
Puits 4
Puits 5
Puits 6
Tube D
Tube E
Tube F
Bleu 1
Mélange de colorant
Mélange de colorant bleu (1 + 2)
Tableau
B Tampon d’électrophorèse 1x (tampon de cuvette)
Taille du support du gel
M6+
M12
M36
Volume total requis
300 ml
400 ml
1000 ml
Tampon
Dilution concentré 50x
+
Eau distillée
6 ml
8 ml
20 ml
294 ml
392 ml
980 ml
Tableau
C
Volts
150
125
75
Durées et tensions
(gel d’agarose à 0,8%)
M6+
Type d’électrophorèse
M12 et M36
Min. / Max.
Min. / Max.
15/20 min.
20/30 min.
35 / 45 min.
25 / 35 min.
35 / 45 min.
60 / 90 min.
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Questions d’étude
1. En fonction de quels paramètres l’électrophorèse sur gel d’agarose sépare-t-elle les molécules ?
2. Expliquez la migration en fonction des charges.
3. Quelle conclusion pouvons-nous tirer des résultats de l’échantillon F ?
4. Pourquoi ajoutons-nous du glycérol aux solutions d’échantillon avant de les déposer dans les puits ?
5. Que se passerait-il si l’on mettait du tampon au lieu d’eau distillée dans la solution de la cuvette ou dans celle du gel?
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Principes et pratique de l’électrophorèse sur gel d’agarose Edvo-Kit n° 101
Guide de l’enseignant
Guide de l’enseignant
APERÇU DES PRÉPARATIFS À RÉALISER PAR L’ENSEIGNANT AVANT L’EXPÉRIENCE:
Cette section explique les préparatifs de laboratoire recommandés et leur durée approximative.
Ce qu’il faut faire : Quand :
Préparer les QuickStrips™
Préparer le tampon TAE dilué
Préparer le mélange d’agarose et verser le gel
Jusqu’à une journée avant la réalisation de l’expérience.
Durée :
40 min.
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Edvo-Kit n° 101 Principes et pratique de l’électrophorèse sur gel d’agarose Guide de l’enseignant
Préparatifs préalables
ELECTROPHORESE SUR GEL D’AGAROSE
Cette expérience requiert un gel d’agarose à 0,8% par groupe d’élèves. Afi n d’obtenir de meilleurs résultats, nous recommandons l’utilisation de 7x14 cm de gel et le placement du gabarit (peigne) dans la fente du milieu. Vous pouvez choisir de préparer les gels en avance ou de permettre aux élèves de les préparer eux-mêmes. Cette étape prendra 30 à 40 minutes.
Préparation individuelle de gel :
Chaque groupe d’élèves peut verser son propre gel avant de réaliser l’expérience.
Voir la description du dispositif expérimental. Les élèves auront besoin de tampon concentré 50X, d’eau distillée et de poudre d’agarose.
Préparation de lots de gel :
Afi n de gagner du temps, une quantité plus importante de solution d’agarose peut être préparée à l’avance et distribuée plus tard en classe. Voir Appendice B.
Préparation de gels en avance :
Les gels peuvent être préparés à l’avance et conservés pour une utilisation postérieure. Les gels solidifi és peuvent être stockés sous tampon dans le réfrigérateur pendant un maximum de deux semaines.
Ne pas permettre aux gels de geler à - 20°C car cela les détruirait.
Les gels qui ont été retirés des plateaux de support pour stockage doivent être refi xés aux supports à l’aide de quelques gouttes d’agarose fondue. Ceci les empêchera de glisser dans les plateaux et les cuvettes.
NOTE:
La précision du pipetage est indispensable pour maximiser le succès de l’expérience. Les expériences de la Série 100 d’EDVOTEK sont prévues pour des
élèves qui ont déjà appris des techniques de micropipetage et d’électrophorèse sur gel d’agarose.
Si les élèves ne savent pas utiliser les micropipettes, nous suggérons de réaliser Cat. nº
S-44, Bases du Micropipetage ou Cat. nº S-43, DNA DuraGel™ avant de tenter cette expérience de niveau plus avancé.
POUR L’ELECTROPHORESE
Chaque groupe d’élèves doit avoir :
• Du tampon concentré 50x
• De l’eau distillée
• L’UltraSpec-Agarose™
• Les échantillons QuickStrip™
FORMAT D’ECHANTILLONS : LA PREPARATION DES
QUICKSTRIPS™
Les tubes de QuickStrip™ comprennent un ensemble de microtitrage recouvert d’un emballage de protection. Chaque puits contient des échantillons de colorant pré-aliquotés.
En vous servant de ciseaux, divisez soigneusement l’ensemble de tubes en bandes individuelles en découpant chaque fi le (consultez le schéma ci-contre). Veillez à ne pas abîmer la pellicule de protection en séparant les
échantillons.
Chaque groupe recevra un ensemble de tubes. Rappelez aux élèves de tapoter légèrement les tubes avant de charger le gel afi n de recueillir l’échantillon dans la partie inférieure du tube.
C
D
E
A
B
F
G
H
C
D
E
F
G
H
A
B
C
D
E
A
B
F
G
H
C
D
E
F
G
H
A
B
C
D
E
A
B
F
G
H
A
D
E
B
C
F
G
H
Découper soigneusement chaque file de tubes.
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Guide de l’enseignant
Principes et pratique de l’électrophorèse sur gel d’agarose Edvo-Kit n° 101
Résultats et analyse de l’expérience
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Puits 1
Puits 2
Puits 3
Puits 4
Puits 5
Puits 6
Tableau de résultats
Orange
Violet
Rouge
Bleu 1
Mélange de colorant
Mélange de colorant bleu (1 + 2)
Dans le schéma ci-dessus, les positions relatives des colorants sont respectées mais ne sont pas représentées à l’échelle.
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Consulter les réponses aux questions d’étude, contenues dans le kit.
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APPENDICES
Appendices
A Guide de dépannage
B Préparation de lots de gel d’agarose
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Edvo-Kit n° 101 Principes et pratique de l’électrophorèse sur gel d’agarose
Appendice A
Guide de dépannage
APPENDICES
PROBLEME :
Les bandes ne sont pas visibles sur le gel.
CAUSE :
SOLUTION :
Le gel n’a pas été correctement préparé.
S’assurer que le tampon d’électrophorèse a été correctement dilué.
L’appareil d’électrophorèse ou la source de courant ne fonctionne pas correctement.
Contacter le fabriquant de l’appareil d’électrophorèse ou de la source de courant.
Les bandes ne sont toujours pas visibles.
Les colorants devraient migrer au moins
3,5 cm (support de 7x7 cm), et au moins
6 cm (support de 7x14 cm) par rapport aux puits.
Veiller à laisser progresser le gel d’au moins 6 cm (à peu près une heure à 125 V).
Il n’y a pas de séparation entre les bandes.
Un gel de concentration erronée a servi à la réalisation de l’électrophorèse.
Veiller à préparer le gel d’agarose à la concentration adéquate. Les échantillons Ready-to-Load™, servant de référence, doivent être analysés avec un gel d’agarose à 0,8%.
Je ne vois pas le colorant positivement chargé sur le gel.
Il n’y a pas suffisamment d’échantillon dans mon
QuickStrip.
Le colorant s’est écoulé du gel.
Le QuickStrip s’est desséché.
Le peigne n’a pas été placé dans la position qu’il fallait. Veiller
à placer le peigne dans les fentes situées au milieu du plateau de support.
Ajouter 40 µL d’eau, pipeter délicatement de haut en bas afin de mélanger avant de charger.
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APPENDICES
Principes et pratique de l’électrophorèse sur gel d’agarose Edvo-Kit n° 101
Appendice B
Préparation de lots de gel d’agarose
Afi n de gagner du temps, une quantité plus importante de solution d’agarose peut être préparée à l’avance et distribuée en classe par la suite. Le tampon dilué qui n’a pas servi pourra être utilisé postérieurement et la solution de gel d’agarose solidifi ée peut être refondue.
Lot de tampon d’électrophorèse
Tableau
D
Préparation d’un lot de tampon d’électrophorèse
La préparation d’une quantité (lot) de 3 litres de tampon d’électrophorèse 1x est détaillée dans le
Tableau D.
Tampon concentré
50x
60 ml
+
Eau distillée
2,940 ml
Volume total requis
3000 ml (3 L)
Lot de gels d’agarose (0,8%)
La préparation en quantité (lot) de gel d’agarose à 0,8% est décrite dans le Tableau E.
1. Utiliser une fi ole de 500 ml pour préparer le gel dilué.
2. Verser 3,0 g d’UltraSpec-Agarose™ dans la solution de gel. Tournoyer délicatement afi n d’enlever les grumeaux.
3. A l’aide d’un marqueur, indiquer le volume de concentration de la solution sur la fi ole.
4. Chauffer la solution d’agarose, tel qu’indiqué dans la section sur la préparation individuelle de gel. La durée de chauffage varie en fonction du volume total de solution tampon.
5. Laisser refroidir la solution d’agarose jusqu’à 60°C en tournoyant délicatement la fi ole afi n que la chaleur se dissipe uniformément. S’il y a eu de l’évaporation, ajouter de l’eau distillée pour maintenir le volume de concentration indiqué sur la fi ole dans l’étape 3.
6. Distribuer le volume de solution d’agarose refroidie nécessaire au coulage de gels individuels. Prévoir 30 ml pour des supports de 7x7 cm, 50 ml pour des supports de
7x10 cm, et 60 ml pour des supports de 7x14 cm.
7. Laisser le gel fi nir de se solidifi er. Il se raffermira et refroidira au bout d’une vingtaine de minutes. Préparez enfi n le gel pour la réalisation de l’électrophorèse.
Tableau
E
Note:
Le poids du contenu de la bouteille d'UltraSpec-Agarose™ du kit fi gure normalement sur l'étiquette. Lisez celle-ci attentivement. Si la quantité d’agarose n’y est pas spécifi ée ou si le sceau de fermeture de la bouteille en plastique est rompu, pesez l’agarose afi n de vous assurer d’utiliser la quantité adéquate.
60˚C
Préparation d’un lot d’UltraSpec-Agarose™ à 0,8%
Quantité d’Agarose
(g)
+
50X Tampon
Concentré
(ml)
+
Eau distillée
(ml)
Volume
Total
(ml)
3.0
7.5
382.5
390
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