ALK Break Apart DNA-FISH Probe Sonde “Break Apart”, Bicolore VC h21-002 -20oC s wF Mode d’emploi Usage prévu La sonde ALK «Break-Apart» de Cancer Genetics Italia est conçue pour détecter la translocation entre le gène ALK situé en 2p23 et l’un de ses 14 loci partenaires de translocation par hybridation in situ en fluorescence (FISH).[1] La translocation du gène ALK se produit dans environ 50% des cas de lymphome anaplasique à grandes cellules (ALCL) avec une translocation t(2;5) (p23;q35), déterminée par cytogénétique conventionnelle; dans de tels cas, la présence de la translocation t(2;5)(p23;q35) supporte un pronostic globalement meilleure pour les patients ALCL.[2] La translocation du gène ALK a été observée dans les tumeurs vésicales inflammatoires myofibroblastique (IMT) de la vessie (> 66%)[3,4] et sert de biomarqueur pour le diagnostic différentiel de l’IMT à partir de lésions sarcomateuses.[3] La translocation du gène ALK est observée dans environ 5% à 16% des cas de cancer du poumon non à petites cellules[5] sous la forme d’inv(2)(p21p23), déterminée par FISH,[5] et sert de biomarqueur pour la réponse thérapeutique.[5,6] La présence de la translocation ALK chez les patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules est corrélée avec une sensibilité marquée aux traitements de incluant du pemetrexed et du crizotinib.[7] ALK 2p23 5’ télomère ~541kb ALK 3’ centromère ~556kb 2 Représentation schématique de la sonde DNA-FISH ALK «Break-Apart»: Les barres horizontales rouges et vertes indiquent les régions couvertes par les sondes (approximativement à l’échelle,GRCh37/Hg19/2009). Les sondes directement marquées ALK 5’ (rouge) et ALK 3’ (verte) flanquent les points de cassure du gène. Conservation À l’arrivée, conserver le produit à - 20°C, à l’abri de la lumière, jusqu’à la date de péremption. Conservation des lames : Conserver les lames hybridées a -20oC, à l’abri de la lumière. Remarque: Ces conditions de conservation s’appliquent à la fois aux produits non ouverts et ouverts. Le nombre de cycles de gel-dégel ne doit pas dépasser le nombre de tests recommandés par flacon. Conserver dans le flacon d’origine. Les flacons conservés dans d’autres conditions peuvent ne pas offrir de performance optimale et par conséquent affecter les résultats du test. Manipulation »» Tous les réactifs doivent être manipulés comme s’ils étaient capables de transmettre des agents infectieux. Après usage, tout le matériel doit être éliminé conformément à la loi nationale en vigueur. »» Manipuler tous les réactifs et lames contenant des fluorophores en éclairage réduit, afin d’éviter toute détérioration du signal fluorescent. Avertissements et mises en garde Lire le mode d’emploi avant toute utilisation. »» Tout transport ou conservation impropre peut détruire ou détériorer la performance du produit. »» En cas de réception d’emballage ou de flacon endommagé, de défaillance du dispositif (après utilisation conforme au mode d’emploi) ou de blessure de l’utilisateur, contacter le fabricant. »» Tout flacon endommagé doit être éliminé conformément à la loi nationale en vigueur et aucun essai ne doit être réalisé à partir d’un tel réactif. »» Manipuler tous les réactifs avec soin et porter un équipement de protection individuelle approprié. »» Le formamide, la solution saline de citrate de sodium (SSC/Saline-Sodium Citrate) et le dodécyl sulfate de sodium (SDS) peuvent avoir des effets tératogènes et mutagènes : éviter toute inhalation, ingestion ou contact avec la peau. »» Le DAPI est un irritant. Consulter le Material Safety Data Sheet (MSDS) du produit pour les informations concernant la sécurité. Réactif fourni Sonde DNA-FISH prête à l’emploi : 100 μL par flacon (10 tests). Un test est défini comme suffisant pour une aire de 22mm x 22mm. Sonde étiquetée au fluorophore pour le locus 5’ ALK (rouge) et au fluorophore pour le locus 3’ ALK (vert), prémélangée avec de l’ADN bloquant et un tampon d’hybridation (formamide, sulfate de dextran, SSC et SDS). Réactifs et matériel nécessaire mais non fournis Equipements Reactifs Bocal coplin Microtube à centrifuger Étanol à 100% Lamelles couvre-objets (0,5 mL) PBS 10X (22x22 e 25x25) Micropipettes (1 à 200 mL) HCl 1N Microscope à épifluoresParafilm MgCl2 1M cence pH-mètre NaOH 1M Pinces Lames plus NaSCN 1M Hotte aspirante Colle de caoutchouc SSC 20X Gants Plateau pour lames Formaline à 10% Chambre humidifiée Thermomètre, calibrè DAPI et Antifade Huile d’immersion (37oC to 80oC) Eau distillée Incubateur Plaque chauffante Pepsine Lampe à mercure (100 watts) Bain-marie 20 Tween Microcentrifugeuse Préparation des réactifs Remarque: Utiliser de l’eau distillée pour la préparation de toutes les solutions-mères et CitrisolvTM est une marque enregistrée de Fisherbrand. de toutes les solutions de travail. Série d’éthanol (70%, 85% et 100%): Préparer des dilutions vol/vol d’éthanol à 100% et d’eau distillée. Conserver à TA. HCl 0,01N (acide chlorhydrique): Ajouter 0,5 mL de HCl 1N à 49,5 mL d’eau distillée. Conserver à TA. Préchauffer la solution à 37oC dans un bain-marie avant usage. Solution-mère de pepsine à 0.4% (4 mg/mL): Dissoudre 100 mg de pepsine dans 25 mL de HCL 0.2N. Conserver des aliquots de 500 μL à - 20oC. Formaldéhyde à 1%: Ajouter 12,5 mL de formaline à 10% (4% formaldehye) à 37 mL de PBS 1X. Ajouter 500 mL de MgCl2 100X. Conserver à 4oC jusqu’à une semaine. SSC 0,5X(Citrate de sodium salin)/Tween 20 à 0,1%: Ajouter 25 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 à 974 mL d’eau distillée. Bien mélanger en tournoyant. Conserver à TA. PBS 1X (solution saline dans un tampon phosphate): Mélanger 100 mL de PBS 10X et 900 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à 7,0. Conserver à TA. SSC 2X: Mélanger 100 mL de SSC 20X et 900 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à 7,0. Conserver à température ambiante (TA). SSC 2X/Tween 20 à 0,1%: Ajouter 100 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 à 899 mL d’eau distillée. Bien mélanger en tournoyant. Conserver à TA. MgCl2 100X (Chlorure de magnesium) dans PBS 1X: Ajouter 50 mL de MgCl2 1M a 450 mL de PBS 1X. Procédure Standard for FISH tement à l’aide d’un enzyme protéolytique du type pepsine (voir prétraite- »» Seul(e) un(e) technologiste médical(e) familiarisé(e) avec les méthodes de cytogénétique et formé(e) à la technique FISH peut réaliser le test. Tout l’équipement doit être étalonné avant la réalisation du test. 1. Préchauffer 50 mL de HCl 0,01N à 37°C. 2. Ajouter 10 à 15 μL de solution-mère de pepsine à 0.4% aux 50 mL de HCl 0,01N préchauffés et incuber la lame pendant 5 à 10 min à 37°C dans la pepsine. Remarque: Produit prêt à l’emploi. Ne pas reconstituer ni diluer. Pour usage professionnel ment facultatif à la pepsine). uniquement. Prétraitement facultatif des lames à la pepsine »» Le tissu visé est du sang périphérique et la moelle osseuse. Les lames doivent être préparées conformément aux directives des méthodes cytogénétiques standards du laboratoire réalisant le test. Préparation des lames Toutes les lames fraîchement préparées doivent être vieillies pendant 1 heure et demie à 45 -50°C avant l’hybridation. Si l’hybridation n’a pas lieu le même jour que la préparation, conserver les lames à 4°C ou à - 20°C. Les lames avec des cellules à cytoplasme visible peuvent nécessiter un prétrai- Remarque sur la procédure: Certains spécimens peuvent nécessiter des temps de digestion plus longs dans la pepsine. 3. Laver deux fois la lame pendant 5 min dans une solution PBS 1X à température ambiante (TA). 4. Incuber la lame pendant 5 min dans du formaldéhyde à 1% à TA. 5. Laver la lame pendant 5 min dans une solution PBS 1X à TA. (Suite à la page suirante) Procédure Standard for FISH Lavage post-hybridation 6. Déshydrater la lame dans de l’éthanol à 70%, 85% et 100% à TA pendant Remarque sur la procédure: Eviter de faire sécher la lame avant que le lavage soit fini. 1 min chacun. 1. Préchauffer les solutions de SSC 2X/Tween 20 à 0,1% et de SSC 0,5X/ 7. Laisser sécher la lame à l’air libre. Tween 20 à 0,1% à 45°C. Remarque sur la procédure: Vérifier la morphologie de l’échantillon à l’aide d’un 2. Retirer la colle de caoutchouc de la lame à l’aide de pinces. microscope à contraste de phase avant l’hybridation. Ne pas hybrider en cas de 3. Tremper brièvement la lame dans la solution de SSC 2X à TA. Retirer la compromission de la morphologie nucléaire. lamelle couvre-objet. Dénaturation/hybridation de la sonde DNA-FISH 4.Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 2X/Tween 20 à 0,1% à 45°C. 1. Vortexer brièvement la sonde DNA-FISH et centrifuger le tube dans une 5.Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 0,5X/Tween 20 microcentrifugeuse pendant 30 secondes. à 0,1% à 45°C. 2. Appliquer 10 μL de sonde DNA-FISH sur la zone cible sur la lame et la 6.Rincer brièvement la lame dans de l’eau distillée. recouvrir d’une lamelle couvre-objet (22 x 22 mm). Remarque sur la procédure: Prendre soin d’éviter toute formation de bulles d’air. Des 7.Laisser sécher la lame à l’air libre à l’abri de la lumière directe. lamelles couvre-objets plus petites ou plus grandes peuvent être utilisées en 8.Appliquer 20 μL de DAPI/Antifade à la zone hybridée et recouvrir d’une lamelle couvre-objet (25 x 25 mm). fonction du changement proportionnel de volume de la sonde DNA-FISH. 3. Sceller soigneusement les bords de la lamelle couvre-objet à l’aide de colle de caoutchouc. 4. Co-dénaturer la lame et la sonde DNA-FISH pendant 3 min à 80°C sur une plaque chauffante à température controlée. 5. Incuber pendant 12 à 18 heures dans une chambre humidifiée à 37°C, à l’abri de toute lumière directe. Procédure pour section FFPE 11.Incuber la lame dans du formol neutre tamponné à 10 % pendant 15 min, à TA. Remarque: Produit prêt à l’emploi. Ne pas reconstituer ni diluer. Pour usage professionnel uniquement. 12.Rincer la lame en 2 changements de SSC 2X de 5 min chacun, à TA. »» Seul un(e) technologiste familiarisé(e) avec les méthodes de cytogénétique 13.Plonger brièvement dans de l’eau distillée et sécher à l’air. et formé(e) à la technique FISH peut réaliser le test. Tout l’équipement doit Dénaturation/hybridation de la sonde DNA-FISH être étalonné avant la réalisation du test. 1. Vortexer la sonde DNA-FISH pendant 2 à 3 secondes et centrifuger le tube »» Le tissu visé correspond à des sections FFPE de 4 à 5 mm d’épaisseur. Les dans une microcentrifugeuse. lames doivent être préparées conformément aux directives des méthodes 2. Appliquer 10 μL de sonde DNA-FISH à la zone cible sur la lame et la recoucytogénétiques standards du laboratoire réalisant le test. vrir d’une lamelle couvre-objet (22 x 22 mm). Préparation des lames Remarque sur la procédure: Prendre soin d’éviter toute formation de bulles d’air. Des Remarque sur la procédure: Simultanément aux coupes sériées utilisées pour l’analyse FISH, une ou des coupe(s) doivent être préparées pour coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E). lamelles couvre-objets plus petites ou plus grandes peuvent être utilisées en fonction du changement proportionnel de volume de la sonde DNA-FISH. 3. Sceller soigneusement les bords de la lamelle couvre-objet à l’aide de 1. Les coupes pour essai FISH doivent être montées sur des lames Plus encolle de caoutchouc. robées. 4. Co-dénaturer la lame et la sonde DNA-FISH pendant 5 min à 90 °C sur une 2. Cuire les lames sur la nuit (12 à 18 heures) à 55 °C avant l’hybridation. plaque chauffante à température contrôlée. Utilise sous 3 jours. 5. Incuber pendant 12 à 18 heures dans une chambre humidifiée à 37 °C, à Prétraitement des lames (à réaliser sous une hotte à aspiration) l’abri de toute lumière directe. 1. Déparaffiner la lame dans 3 bains de CitriSolv™ de 10 min chacun, à TA. Lavage post-hybridation Remarque sur la procédure: Les bocaux de CitriSolv™peuvent être utilisés deux fois. Remarque sur la procédure: Ne pas laisser la lame sécher avant la fin des lavages. Toutefois, le troisième bocal doit contenir du réactif encore inutilisé. 1. 1. Retirer la colle de caoutchouc de la lame à l’aide de pinces. 2. Déshydrater la lame en l’incubant dans deux bains d’éthanol à 100 % de 5 min chacun, à TA. Sécher à l’air (peut rester a TA pendant plusieurs heures). Remarque sur la procédure: La lame peut être conservée sèche à TA pendant plusieurs heures. 3. Incuber la lame dans du HCl 0,2N pendant 20 min, à TA. 4. Rincer la lame dans un bain d’eau distillée pendant 1 min à TA et 2 bains de SSC 2X de 5 min chacun, à TA. 5. Incuber la lame dans une solution de NaSCN 1M préchauffée pendant 10 min à 80°C. Remarque sur la procédure: Certain types de tissus, tel le tissue mammaire, nécessitent un temps d’incubation plus long (30-60 minutes). 6. Rincer la lame dans un bain d’eau distillée et 2 bains de SSC 2X de 5 min chacun, à TA. 7. Mettre la lame soit dans une chambre humide ou dans un Thermobrite. Couvrir la zone cible avec au moins 100 mL de pepsine 0,4%, garder la lame en cours d’incubation dans des conditions humides. Ne pas laisser l’échantillon se dessécher. 8. Incuber pendant 10 min à 37 °C. Remarque sur la procédure: Cette durée peut devoir être ajustée en fonction des conditions de fixation et de l’âge de la coupe. 9. Rincer la lame pendant 5 min dans de l’eau distillée, à TA. 10.Rincer la lame en deux bains de SSC 2X de 5 min chacun, à TA. Plonger brièvement dans de l’eau distillée et sécher à l’air. 2. Tremper la lame dans la solution SSC 2X à TA et retirer la lamelle couvreobjet. 3. Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 2X/Tween 20 à 0,1 % à 45°C. 4. Rincer la lame en la trempant dans de l’eau distillée. 5.Laisser sécher la lame à l’air libre à l’abri de la lumière directe. 6.Appliquer 20 μL de DAPI/antifade à la zone hybridée et recouvrir d’une lamelle couvre-objet (25 x 25 mm). Remarque sur la procédure: Selon la fixation, l’âge de la coupe et les conditions de prétraitement, on peut apercevoir un bruit de fond vert. Si le bruit de fond vert est excessif ou interfère avec l’attribution de score, les lames peuvent être relavées de manière plus stringente. Avant le relavage, retirer l’antifade en enlevant la lamelle couvre-objet et en procédant au lavage en deux changements de solution SSC 2X/Tween 20 à 0,1 % de 5 min chacun avec agitation, à TA. Procéder immédiatement au relavage, ne pas laisser la lame sécher. La stringence peut être accrue en ajoutant une étape de lavage de 2 x 5 min, dans une solution de SSC 0,5X/Tween 20 à 0,1 % à 45 °C. Une stringence supplémentaire peut être obtenue en augmentant la durée de lavage et/ou la température (jusqu’à 65 °C). Accessoires pour microscope »» Filtres recommandés »» Objectifs Fluorophore Un objectif 10X est adapté au balayage de la zone cible. Un grossissement supérieur s’avère nécessaire pour l’analyse des signaux et doit avoir lieu Verte avec un objectif à immersion à huile 63X ou 100X. Rouge »» Huile d’immersion L’huile d’immersion doit être adaptée à la microscopie en fluorescence. DAPI »» Lampe Une lampe à mercure de 100 watts avec une durée de vie maximale de 200 heures est recommandée. Remplacer la lampe avant qu’elle ne dépasse les 200 heures. Excitation max Émission max 496 nm 520 nm 580 nm 603 nm 360 nm 460 nm (Suite à la page suirante) Visualisation et interprétation des signaux Le signal doit être visualisé à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé des filtres appropriés. Remarque sur la procédure: Les signaux peuvent être à différents plans focaux, c’est pourquoi il est important de focaliser vers le haut et vers le bas des spécimens, afin de s’assurer du comptage de tous les signaux. »» Dans les noyaux normaux en interphase et les chromosomes en métaphase, la sonde DNA-FISH ALK «Break-Apart» génère deux signaux de fusion (rouge/vert ou jaune) correspondant aux deux chromosomes 2 normaux. »» Dans les cellules avec réarrangements chromosomiques mettant en jeu le gène ALK, le modèle le plus couramment observé est un signal de fusion représentant le chromosome 2 normal, ainsi qu’un signal rouge et un signal vert, représentant les chromosomes dérivés. Glossaire des symboles g Numéro de lot FRisques biologiques h Numéro de catalogue YAttention, consulter la documentation d’accompagnement CMarquage CE de conformité XContient suffisamment pour 10 tests V Dispositif médical de diagnostic in vitro wConserver à l’abri de la lumière du soleil MFabricant s Limite supérieure de température H Utiliser avant le Recommendations and limitations »» Ce produit a été optimisé pour être utilisé sur des lames préparées à partir de spécimens de sang périphérique, et de moelle osseuse et FFPE conformément aux méthodes cytogénétiques courantes. Le fabricant garantit que ce produit répond aux caractéristiques de performance analytique (sensibilité, spécificité, reproductibilité et intervalle de validité) établies sur du sang périphérique normal ou des tissus prévus. »» Chaque nouveau lot de sonde DNA-FISH doit être testé pour la spécificité du locus sur un spécimen de sang périphérique normal et sur le tissu prévu, pour vérifier la bonne performance du réactif. Il incombe au laboratoire d’établir les intervalles de validité à l’aide de spécimens de controle positifs et négatifs du tissu prévu. »» L’utilisation de filtres aux caractéristiques spectrales autres que celles spécifiées peut affecter négativement la force du signal. Par exemple, le fluorophore rouge est visible à travers un filtre orange, mais les signaux apparaissent faibles. »» La technique FISH sur métaphase est recommandée pour caractériser les variantes et les patrons de signaux anormaux atypiques. »» Le test FISH est considéré comme une adjonction à la cytogénétique classique (caryotype). Les résultats de ces tests doivent être interprétés dans la totalité du contexte des antécédents cliniques du patient. Aucune décision médicale ne peut être prise en se fondant uniquement sur les résultats du test FISH. M Cancer Genetics Italia S.r.l. Viale Luigi Majno, 17 20122 Milano - Italia www.cancergeneticsitalia.com [email protected] DNA-FISH Probe fabriquée dans la communanté européenne par Cancer Genetics Italia S.r.l. Bibliographie 1. Huret, J. L., et al. www.AtlasGeneticsOncology.org. 2. Drexler, H. G., et al. Leukemia, 2000. 14(9):p.1533-59. 3. Freeman, A., et al. Mod Pathol, 2004. 17(7):p.765-71. 4. Sukov, W. R., et al. 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