PROTOCOLE AUTOMATISÉ
Isolement automatisé d’ADN génomique à partir d’échantillons de couches leucocytaires à l’aide de l’appareil Tecan Freedom
EVO
®
-HSM Workstation
Mode d’emploi des produits
A1751 et A2751
Réservé à la recherche. N’est pas destiné à une utilisation dans le cadre de procédures de diagnostic.
EP049
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Isolement automatisé d’ADN génomique à partir d’échantillons de couches leucocytaires à l’aide de l’appareil Tecan Freedom
EVO
®
-HSM Workstation
Toute la documentation technique est disponible à l’adresse : www.promega.com/protocols/
Veuillez consulter ce site Internet pour vérifier que vous utilisez la version la plus à jour de ce protocole automatisé.
Si vous avez des questions sur l’utilisation de ce système, veuillez contacter le service technique de Promega à l’adresse [email protected].
1. Description ..............................................................................................................2
2. Composants du produit et conditions de stockage .........................................................2
3. Avant de commencer ..................................................................................................3
3.A. Types d’échantillons compatibles ............................................................................................ 3
3.B. Options de traitement des échantillons ................................................................................... 3
3.C. Options d’élution ................................................................................................................... 3
3.D. Quantification et évaluation de l’ADN ..................................................................................... 4
4. Traitement automatisé ...............................................................................................4
4.A. Matériaux supplémentaires .................................................................................................... 4
4.B. Procédure de purification de l’ADN ......................................................................................... 5
4.C. Étapes de purification ............................................................................................................ 6
5. Résultats du développement .......................................................................................7
5.A. Rendement de la purification automatisée ............................................................................... 7
5.B. Contrôle de contamination croisée .......................................................................................... 8
6. Dépannage ...............................................................................................................8
7. Produits associés.....................................................................................................10
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Numéro vert aux États-Unis 800-356-9526 · +1-608-274-4330 · Fax +1-608-277-2516
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1. Description
L’appareil Tecan Freedom EVO
®
-HSM workstation permet d’automatiser l’isolement d’ADN génomique (ADNg) à partir d’échantillons de couches leucocytaires et utilise la formulation chimique du ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA Isolation System. Le protocole automatisé est préconfiguré, tout en offrant la flexibilité nécessaire pour répondre aux besoins des applications génomiques à haut débit. Le système est capable de traiter n’importe quelle combinaison de volumes d’échantillons dans la gamme entière de volume de départ pour cette méthode. Les réactifs sont automatiquement ajustés en fonction du volume des échantillons individuels. L’utilisateur n’a qu’à préciser le nombre d’échantillons à traiter et le volume d’élution souhaité. Des options supplémentaires permettent à l’utilisateur de personnaliser la procédure de purification de l’ADN pour répondre à ses besoins.
2. Composants du produit et conditions de stockage
PRODUIT RÉF.
ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA Isolation System A1751
Réservé à la recherche. Chaque système contient assez de réactifs pour 96 purifications, chacune à partir d’un maximum de 10 ml. Comprend :
• 23 ml Solution de protéinase K (PK)
• 130 ml Protéase alcaline (Alkaline Protease, APA)
• 1 020 ml Tampon de lyse cellulaire (Cell Lysis Buffer, CLD)
• 2 × 765 ml Tampon de liaison (Binding Buffer, BBA)
• 115 ml Résine ReliaPrep™
• 3 × 815 ml Tampon de lavage (Wash Buffer, WBA)
• 2 × 150 ml Eau sans nucléases
PRODUIT RÉF.
ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA Isolation System A2751
Réservé à la recherche. Chaque système contient assez de réactifs pour 96 purifications, chacune à partir d’un maximum de 10 ml. Comprend :
• 23 ml Solution de protéinase K (PK)
• 130 ml Protéase alcaline (Alkaline Protease, APA)
• 1 400ml Tampon de lyse cellulaire (Cell Lysis Buffer, CLD)
• 1 600 ml Tampon de liaison (Binding Buffer, BBA)
• 115 ml Résine ReliaPrep™
• 3 500 ml Tampon de lavage préparé (Prepared Wash Buffer, WBC)
• 4 × 150 ml Eau sans nucléases
Conditions de stockage : stocker le ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA Isolation System à température ambiante (15–30 °C). Ne pas réfrigérer ou congeler les réactifs. Entre utilisations, stocker les réactifs de la plateforme recouverts ou fermés à température ambiante.
Remarque : pour des renseignements sur les commandes en dehors des États-Unis, adressez-vous à une succursale ou un distributeur Promega local. Les coordonnées de ceux-ci sont disponibles au site :
www.promega.com. Adresse électronique : [email protected].
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Conventions de dénomination
Tout au long de ce document, les solutions fournies dans le ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA Isolation System
•
•
•
•
• sont nommées comme suit :
• Solution de protéinase K (PK) = Solution de protéinase K
Protéase alcaline (Alkaline Protease, APA) = Protéase alcaline
Tampon de lyse cellulaire (Cell Lysis Buffer, CLD) = Tampon de lyse cellulaire
Tampon de liaison (Binding Buffer, BBA) = Tampon de liaison
Tampon de lavage (Wash Buffer, WBA) = Tampon de lavage
Tampon de lavage préparé (Prepared Wash Buffer, WBC) = Tampon de lavage préparé
Remarque : pour Réf. A1751, comportant le Tampon de lavage (WBA), il est nécessaire de préparer ce dernier avant de le charger dans l’appareil, en ajoutant de l’éthanol à 50 % à la bouteille de tampon de lavage (WBA) tel que décrit à la section 4.A. Pour Réf. A2751, comportant le Tampon de lavage préparé (WBC), aucune préparation supplémentaire n’est requise.
3. Avant de commencer
3.A. Types d’échantillons compatibles
Les méthodes présentées dans ce document sont prévues pour le traitement d’échantillons de couches leucocytaires préparés à partir de 2,5 à 10 ml de sang total. Le sang peut être prélevé en présence de la plupart des anticoagulants couramment utilisés. Les échantillons peuvent être frais ou congelés, mais les échantillons de couches leucocytaires doivent être préparés à partir de sang non congelé pour maximiser le rendement en leucocytes. Des échantillons préparés à partir de sang de qualité non optimale peuvent être traités, cependant la quantité et la qualité de l’ADN isolé peuvent être compromises selon les conditions spécifiques. Veuillez contacter le service technique de Promega pour toute question au sujet des types d’échantillons compatibles à l’adresse suivante : [email protected].
3.B. Options de traitement des échantillons
Les échantillons sont traités à l’aide de tubes coniques standard de 50 ml préchargés dans l’appareil HSM. Si vous ne souhaitez pas transférer les échantillons manuellement, le système peut les transférer automatiquement à partir de tubes de 2 ml à bouchons vissés (par ex. Sarstedt Réf. 72.609). Le temps de traitement total est prolongé d’environ 20 minutes quand le transfert automatisé des échantillons est sélectionné. Les échantillons peuvent au besoin être traités à la RNase A (réactif facultatif, acheté séparément).
3.C. Options d’élution
L’ADN doit être élué à l’aide d’eau sans nucléases (comprise). Les utilisateurs peuvent choisir des volumes d’élution compris entre 500 et 1 500 µl. L’élution de l’ADN dans un volume bas augmente la concentration de l’ADN purifié, mais réduit le rendement total. Des volumes finaux d’élution inférieurs à 1 ml peuvent entraîner une resuspension incomplète de la résine ReliaPrep™ pour les échantillons de volume élevé, ce qui diminue la performance et augmente la présence de résine résiduelle dans les éluats.
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3.C. Options d’élution (suite)
Tous les ADN élués sont transférés du HSM à une plaque intermédiaire à 96 puits profonds. Si vous souhaitez stocker l’ADN dans du tampon TE, le système peut ajouter du Tris-EDTA concentré à la plaque intermédiaire.
Après la centrifugation manuelle, le système peut transférer les échantillons aux récipients finaux. Ces derniers peuvent consister en tubes de 2 ml à bouchons vissés (par ex. Sarstedt Réf. 72.609) ou en une plaque à 96 puits profonds. Si vous choisissez de transférer les échantillons dans des tubes, vous serez invité à placer ceux-ci sur la plateforme suite à l’élution. Au moment de l’installation du système veuillez discuter des récipients finaux requis avec le technicien.
3.D. Quantification et évaluation de l’ADN
La qualité et la concentration de l’ADN peuvent être déterminées de diverses manières, notamment par spectrophotométrie, à l’aide de colorants fluorescents, par électrophorèse sur gel et par PCR quantitative.
Des rapports font état du fait que différentes méthodes de quantification de l’ADN donnent souvent des valeurs absolues inégales. Nous vous recommandons d’utiliser une même méthode pour déterminer la qualité et la quantité de l’ADN tout au long de votre procédure (c.-à-d. utiliser une même méthode pour quantifier l’ADN purifié et pour déterminer la quantité d’ADN à utiliser dans vos applications d’aval). Tout au long de ce document, des résultats de la méthode de spectrophotométrie NanoDrop ® sont présentés.
4. Traitement automatisé
L’appareil Tecan Freedom EVO ® -HSM Workstation offre plusieurs options de traitement des échantillons.
Ces options sont contrôlées sur l’interface TouchTools™. Toutes les options décrites à la section 3 sont accessibles sur cette interface. Consultez le Manuel technique de l’appareil Tecan Freedom EVO ® -HSM Workstation, n o TM402, pour obtenir les instructions concernant l’interface TouchTools™. Pour assistance complémentaire concernant l’interface de l’utilisateur et les options de traitement, veuillez contacter le service technique de
Promega à l’adresse [email protected].
4.A. Matériaux supplémentaires
En plus des réactifs fournis par Promega, d’autres matériaux et réactifs doivent être préparés et fournis par l’utilisateur.
moléculaire à de l’eau de qualité biologie moléculaire. Mélanger. Remarque : l’utilisation d’alcool dénaturé contenant du méthanol ou de l’isopropanol peut réduire le rendement en ADN et sa qualité.
bouteille entière de Tampon de lavage (WBA). Bien mélanger avant l’emploi. Remarque : si la configuration de votre kit (Réf. A2751) comporte du Tampon de lavage préparé (WBC), ne pas ajouter d’éthanol avant utilisation.
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4.A. Matériaux supplémentaires (suite)
de l’eau déionisée pour chaque série d’échantillons. Ce réactif est utilisé pour nettoyer le système (par ex.
Fisher Réf. ss276-4).
(Réf. A7974) préparée à la concentration recommandée.
concentrée 20X (pH 7,5 ; Réf. A2651). Un stock de TE concentré peut également être préparé selon la méthode préférée de votre laboratoire. Le stock doit avoir une concentration 10 à 20 fois plus élevée que la concentration finale souhaitée. Il est important de sélectionner le facteur de concentration au cours de l’installation initiale de l’appareil pour faire en sorte que la dilution appropriée soit appliquée au cours du traitement des échantillons.
Les fournitures Tecan suivantes sont nécessaires pour l’extraction de 32 échantillons. Nous recommandons d’utiliser uniquement des cônes jetables à filtre pour minimiser le risque de contamination croisée.
Description de l’article Qté
Réf. Tecan
Cônes jetables LiHa, 1 000 µl, avec filtre 176 cônes 10 612 513
Bacs à réactif jetables, gris
Bacs jetables de 25 ml
6
3
10 613 049
30 055 743
4.B. Procédure de purification de l’ADN
L’interface principale de la méthode de purification de l’ADN est le logiciel Tecan TouchTools™. À l’aide des écrans interactifs, vous pouvez sélectionner toutes les options configurables par l’utilisateur pour la purification. Pour obtenir les instructions du système, consultez le Manuel technique de l’appareil Tecan Freedom EVO ®
-HSM
Workstation, n o TM402. Dans la liste des programmes disponibles, sélectionnez ReliaPrep_Buffy_HSM_2_0_v1.0 et suivez les instructions de l’interface graphique TouchTools™ pour sélectionner tous les paramètres du traitement.
L’interface vous guidera tout au long de la configuration du système avant le démarrage du traitement.
Une fois toutes les informations saisies, le système commencera la procédure de purification. Il n’y aura plus d’autres informations à saisir jusqu’à la fin de la méthode, sauf en cas de problème au cours du transfert, de la détection des échantillons ou de l’aspiration sous vide. En cas de problème, reportez-vous à la section Traitement des erreurs du Manuel technique de l’appareil Tecan Freedom EVO ® -HSM Workstation, n o TM402. Après l’élution, il vous sera demandé de centrifuger la plaque intermédiaire. Cette étape est nécessaire afin d’éliminer les particules de résines résiduelles présentes dans les éluats. Si vous avez choisi de laisser vos échantillons dans la plaque intermédiaire, ce message ne s’affichera pas, et la méthode sera alors terminée. La plaque doit être centrifugée avant toute manipulation supplémentaire. À l’issue de la purification, le système vous demandera de retirer vos échantillons, d’éteindre la pompe à vide et de stocker les réactifs restants de la plateforme.
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4.C. Étapes de purification
1. Facultatif : transfert des échantillons à partir de tubes.
2. Vérification automatique du volume des échantillons et calcul du volume des réactifs.
3. Le HSM agite les échantillons à 500 tours/min lorsque chaque réactif est ajouté.
4. De la protéinase K (60 µl) est ajoutée à chaque tube.
5. Facultatif : de la RNase A (60 µl) est ajoutée à chaque échantillon.
6. De la Protéase alcaline (375 µl) est ajoutée à chaque échantillon.
7. Du Tampon de liaison (3 ml) est ajouté à chaque échantillon.
8. Après l’ajout de Tampon de lyse, les échantillons sont incubés à 65 °C pendant 30 minutes sous agitation à
500 tours/min, suivi par une période de 10 minutes d’agitation à 500 tours/min sans chaleur. Pendant ce temps, la résine ReliaPrep™ est maintenue en suspension par mélange intermittent avec un cône.
9. Du Tampon de liaison (3,6 ml) est ajouté à chaque échantillon.
10. La résine ReliaPrep™ est complètement remise en suspension, et un volume de 300 µl de résine est ajouté
à chaque échantillon. La liaison des acides nucléiques à la résine s’effectue en incubant les échantillons pendant 20 minutes sous agitation à 550 tours/min, puis la résine est recueillie à l’aide d’un aimant pendant
20 minutes.
11. Les déchets provenant de la lyse et de la liaison sont retirés de chaque tube. Après élimination des déchets,
1 ml de Tampon de lavage préparé est ajouté aux tubes. Cette étape est répétée jusqu’à ce que tous les déchets aient été éliminés de tous les tubes et le tampon de lavage ajouté.
12. Les échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 2 minutes.
13. Après agitation, les échantillons sont mélangés en pipetant pour disperser complètement la résine. Ensuite, l’appareil ajoute, sous agitation, un volume supplémentaire (4,3 ml) de Tampon de lavage préparé. Les
échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 2 minutes, puis à 700 tours/min pendant 2 minutes de plus.
Après cette étape, la résine est capturée pendant 3 minutes.
14. Les déchets du premier lavage sont éliminés de chaque tube, puis 1 ml de Tampon de lavage préparé est ajouté aux échantillons. Ensuite, l’appareil ajoute, sous agitation, un volume supplémentaire (4,3 ml) de Tampon de lavage préparé. Les échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 2 minutes, puis à 700 tours/min pendant
2 minutes de plus. Les échantillons sont ensuite soumis à une capture magnétique pendant 3 minutes.
15. Les déchets du deuxième lavage sont éliminés de chaque tube, puis un volume de 4,3 ml d’éthanol à 50 % est ajouté aux échantillons. Les échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 4 minutes. Les échantillons sont ensuite soumis à une capture magnétique pendant 3 minutes.
16. Tous les déchets sont éliminés colonne par colonne, et le volume calculé d’eau sans nucléases est ajouté à chaque tube. Les échantillons sont agités à 500 tours/min pendant 3 minutes, puis à 400 tours/min pendant
15 minutes à 70 °C. Une capture magnétique est effectuée pendant 5 minutes, puis les éluats sont transférés
à la plaque intermédiaire.
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4.C. Étapes de purification (suite)
17. Si l’option de transférer les échantillons dans une plaque ou des tubes finaux a été sélectionnée, un message s’affiche pour demander à l’utilisateur de centrifuger la plaque intermédiaire à 2 500 × g pendant 20 minutes afin d’éliminer les particules résiduelles.
18. La plaque intermédiaire est replacée dans l’appareil, puis les éluats sont transférés aux tubes finaux ou à la plaque finale.
19. La méthode est terminée.
5. Résultats du développement
Les données décrites ci-dessous sont représentatives de plusieurs groupes de données obtenues au cours du développement. Le traitement de tous les échantillons présentés a été démarré dans des tubes de 50 ml. Les éluats obtenus ont été laissés sur la plaque intermédiaire pour l’analyse.
5.A. Rendement de la purification automatisée
La quantité d’ADN obtenue avec le système de purification automatisé de l’ADN ReliaPrep™ présente un rapport linéaire avec le volume initial de l’échantillon, tout au long de la plage recommandée de volume de départ. Les
échantillons présentés à la Figure 1 proviennent d’un seul donneur. Chaque échantillon a été traité à l’aide du système automatisé ReliaPrep™.
300
250
200
150
100
50
0
0 2
1.0
4 6
Rendement moyen (µg)
Rapport 260/280 moyen
Rapport 260/230 moyen
8
Volume initial de sang (ml)
10 12
0.5
0
2.0
1.5
Figure 1. Rendement en ADN par la procédure automatisée en fonction du volume de départ. Les
échantillons de couches leucocytaires ont été préparés à partir d’un seul donneur. Chaque point est la moyenne de quatre réplicats et les barres d’erreur représentant un écart-type. Rendements en ADN déterminé à l’aide du spectrophotomètre NanoDrop
®
.
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5.B. Contrôle de contamination croisée
Ce système intégré utilise une série d’étapes de nettoyage pour faire en sorte que les constituants entrant en contact avec les échantillons et partagés entre ceux-ci ne présentent pas de risque de contamination croisée. Pour une description détaillée des méthodes utilisées pour vérifier l’intégrité des échantillons sur l’appareil Tecan
Freedom EVO
®
-HSM Workstation, veuillez vous reporter à la note d’application Verification of Sample Integrity
for the Tecan Freedom EVO
®
-HSM Workstation, n o
AN204, à l’adresse www.promega.com.
6. Dépannage
Pour toute question qui ne serait pas traitée ci-dessous, veuillez consulter une succursale ou un distributeur
Promega local. Les coordonnées de ceux-ci sont disponibles au site : www.promega.com. Adresse électronique :
Symptômes
Faible rendement en ADN
Causes possibles et commentaires
La résine ReliaPrep™ n’a pas été remise en suspension de façon adéquate avant l’emploi. Resuspendez la résine ReliaPrep™ avec soin dans le flacon de réactif avant de la transférer pour la purification des échantillons.
L’échantillon contenait trop peu de leucocytes. Le rendement en
ADN dépend de la quantité de matériel de départ. Les échantillons avec un faible taux en leucocytes ou les couches leucocytaires où seule une partie des leucocytes a été récupérée présenteront un moindre rendement en raison de la quantité réduite au départ.
Le volume initial de l’échantillon dépasse la capacité de traitement du système. Le ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA Isolation
System a été optimisé pour purifier de l’ADN d’échantillons de couches leucocytaires préparés à partir de 2,5 à 10 ml de sang total.
Le traitement d’échantillons de sang en dehors de cette plage recommandée peut entraîner une réduction du rendement en ADN et de sa concentration. Le ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA
Isolation System a été optimisé pour des échantillons de sang normaux provenant d’adultes en bonne santé, qui contiennent en général entre 4,5 × 10
6
et 1 × 10
7
leucocytes/ml.
L’utilisation réussie du ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA
Isolation System dépend de l’usage des réactifs appropriés dans l’ordre voulu. Vérifiez si tous les réactifs ont bien été placés dans la position adéquate de l’appareil et s’ils ont été dilués correctement avant l’emploi.
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6. Dépannage (suite)
Symptômes
ADN dégradé
Résine ReliaPrep™ dans l’éluat final
Médiocre pureté de l’ADN
Message d’erreur de l’appareil
Causes possibles et commentaires
Des nucléases ont été introduites au cours de la purification ou du maniement. Utilisez des récipients en plastique ou en verre sans nucléases. Utilisez des cônes à filtre pour toutes les étapes de pipetage. Portez des gants à tout moment. Les nucléases
éventuellement introduites après l’élution dégradent l’ADN. Pour protéger l’ADN élué contre les nucléases, sélectionnez l’option d’ajouter du tampon TE concentré à une concentration de 1X dans l’éluat final.
L’ADN était dégradé avant la procédure de purification. Si l’ADN
était dégradé avant la purification, l’ADN résultant le sera également.
Les solutions concentrées d’ADN peuvent être visqueuses. Il peut
être nécessaire de prolonger le temps de capture de la résine
ReliaPrep™ pour ces solutions visqueuses. Éliminez la résine résiduelle de l’ADN élué en effectuant la centrifugation comme indiqué.
Une médiocre pureté de l’ADN, observée par les rapports spectroscopiques ou dans les analyses en aval, est souvent le résultat d’un retrait incomplet du lysat. Tout ajustement physique du système robotique peut influencer l’efficacité du retrait du lysat.
Contactez le service technique à l’adresse
[email protected] avant de tenter d’ajuster le système robotique.
Si le système signale un volume insuffisant dans un bac de réactif, vérifiez que le type de bac utilisé est adéquat et ajoutez du réactif au bac.
Si vous observez d’autres erreurs, contactez le service technique de Promega. Notez le message d’erreur précis et l’heure. Vous aurez besoin des fichiers de rapport détaillés EVOware ® , enregistrés sous : C:\ProgramData\Tecan\EVOware\AuditTrail\log.
Les fichiers de rapport utilisent la convention de dénomination suivante : EVO_aaaammjj_hhmmss.log (la date et l’heure correspondent à la création du fichier).
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7. Produits associés
PRODUIT
Appareil HSM 2.0
Solution de RNase A
Solution tampon TE 20X (pH 7,5)
Tecan Freedom EVO
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-HSM Workstation
Protéase alcaline (Alkaline Protease, APA)
Tampon de lyse cellulaire (Cell Lysis Buffer, CLD)
Tampon de liaison (Binding Buffer, BBA)
Résine ReliaPrep™
Tampon de lavage (Wash Buffer, WBA)
Solution de protéinase K (PK)
Eau sans nucléase
Tampon de lyse tissulaire (Tissue Lysis Buffer, TLA)
Bouteille pour éthanol à 50 %
CONDITIONNEMENT RÉF.
1 pièce A2715
5 ml
25 ml
A7974
A2651
130 ml
1 400 ml
1 600 ml
Contacter Promega
A1721
A1731
A1741
115 ml
130 ml
23 ml
500 ml
1 000 ml
500 ml
1 pièce
A1752
A2681
A5051
P1197
P1199
A5091
A2691
© 2013, Promega Corporation. Tous droits réservés.
QuantiFluor et ReliaPrep sont des marques de commerce de Promega Corporation.
TouchTools est une marque déposée de Tecan AG Corporation. EVOware et Freedom EVO sont des marques déposées de
Tecan AG Corporation. NanoDrop est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific.
Tous les prix et toutes les caractéristiques sont sujets à modification sans avis préalable.
Les déclarations relatives aux produits sont sujettes à modification. Veuillez contacter le service technique de Promega ou consulter le catalogue en ligne de Promega pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits Promega.
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