Macherey-Nagel NucleoMag DNA FFPE kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
Moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d'utilisation
ADN génomique d'échantillons FFPE
n NucleoMag® DNA FFPE
Novembre 2023 / Rev. 04
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ADN génomique d'échantillons FFPE
Sommaire
1 Composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, équipements et consommables à fournir par l’utilisateur
5
1.3 A propos de ce manuel
5
2 Description du produit
6
2.1 Principe général
6
2.2 Caractéristiques du kit
6
2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons
7
2.4 Systèmes de séparation magnétique
8
2.5 Réglage des paramètres de l’agitateur
8
2.6 Manipulation des billes
9
2.7 Utilisation de la protéinase K
10
2.8 Procédures d’élution
10
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
11
4 Instructions de sécurité
12
4.1 Elimination des déchets
12
5 Protocole d’extraction de l’ADN génomique à partir de tissus
13
6 Annexes
19
6.1 Guide de résolution des problèmes
19
6.2 Informations de commande
21
6.3 Restriction de l’utilisation du produit / ​garantie
22
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
3
ADN génomique d'échantillons FFPE
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoMag® DNA FFPE
1 × 96 prep.
744320.1
4 × 96 preps
744320.4
Billes NucleoMag® B-Beads
1,8 mL
4 × 1,8 mL
Tampon de lyse FL
30 mL
4 × 30 mL
Tampon de liaison MB2
100 mL
500 mL
Tampon de lavage MB4
75 mL
300 mL
Tampon d’élution MB6
30 mL
125 mL
Protéinase K (lyophilisée)*
75 mg
4 × 75 mg
Tampon de protéinase PB
15 mL
35 mL
Tampon de dissolution
de la paraffine « Paraffin
Dissolver » (bleu)
60 mL
2 × 125 mL
Tampon de décrosslink
D-Link
30 mL
2 × 30 mL
1
1
REF
Manuel d’utilisation
* Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3.
4
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
ADN génomique d'échantillons FFPE
1.2
Réactifs, équipements et consommables à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
•
80 % d’éthanol
Équipement / ​Consommables
Produit
REF
Conditionnement
Système de séparation magnétique
p.e. NucleoMag® SEP (voir paragraphe 2.4)
744900
1
Plaque pour la séparation des billes magnétiques,
p.e. Square-well Block (bloc 96 puits avec des puits
carrés de 2,1 mL)
740481
740481.24
4
24
740477
740477.24
4 sets
24 sets
740486
24
740673
20
744950
1 set
Barrettes de tubes pour l’incubation des
échantillons et la lyse,
p.e. Rack of Tubes Strips (1 set comprend 1 Rack, 12
barrettes de 8 tubes chacun (puits de 1,2 mL) et 12
barrettes de 8 bouchons)
Plaque d’élution pour la collecte d’acides
nucléiques purifiés,
Plaque d’élution à ’fond en U’ (96 puits de 0,3 mL)
Plaque d’élution à ’fond plat’ (96 puits de 0,3 mL)
®
Pour l’utilisation du kit sur le KingFisher 96 :
Set d’accessoires ’KingFisher® 96 Accessory Kit A’
(Square-well Blocks, Tip Combs, Plaques d’élution pour
4 × 96 preps NucleoMag® DNA FFPE pour le système
KingFisher® 96)
1.3
A propos de ce manuel
Il est recommandé de lire attentivement les instructions de ce manuel avant toute utilisation.
Toute la documentation technique est également disponible sur Internet à l’adresse suivante
www.mn-net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées de ce manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
5
ADN génomique d'échantillons FFPE
2
Description du produit
Les échantillons de tissus fixés à la formaline et inclus en paraffine (dits ’FFPE’ : Formalin-fixed
paraffin-embedded) sont couramment préparés à partir d’échantillons de tissus chirurgicaux
humains par fixation à la formaline suivie d’une inclusion dans la paraffine. De fines coupes
d’échantillons FFPE sont utilisées en routine pour des analyses d’histopathologie et les
blocs de tissus inclus en paraffine restants sont généralement archivés. Les vastes archives
existantes d’échantillons de tissus FFPE représentent une source précieuse pour les études
rétrospectives des profils d’expression des gènes et l’analyse des mutations. Toutefois,
l’utilisation de ces échantillons pour l’analyse de l’ADN est limitée en raison des modifications
chimiques entrainées par le formaldéhyde et la fragmentation de l’ADN pendant la préparation
des tissus (prélèvement, fixation, inclusion) et leur stockage (humidité, durée, température) des
échantillons. Les procédures standard d’extraction de l’ADN aboutissent souvent à un faible
rendement d’ADN ou à de mauvaises performances dans les applications en aval (par exemple,
PCR).
2.1
Principe général
Le kit NucleoMag® DNA FFPE est conçu pour l’extraction de l’ADN à partir d’échantillons
de tissus fixés à la formaline et inclus en paraffine (FFPE). La procédure remplace l’utilisation
de xylène ou de d-limonène, inflammables et malodorants, couramment utilisés pour le
déparaffinage. De plus, la procédure permet d’éviter les difficultés liées à l’élimination des
solvants organiques à partir de culots de tissus souvent à peine visibles. Le NucleoMag® DNA
FFPE utilise un tampon inodore breveté (Paraffin Dissolver, brevet en cours) et permet une lyse
efficace en deux phases. Ce kit fournit des réactifs et des billes magnétiques pour une méthode
pratique, fiable et rapide d'extraction de l’ADN à partir de 96 ou 384 échantillons. Tout d’abord,
la paraffine des paragraphes FFPE est dissoute dans le Paraffin Dissolver. Le tissu est ensuite
digéré par la protéinase pour solubiliser le tissu fixé et libérer l’ADN dans la solution. Ensuite,
une incubation à chaud avec un tampon spécialement formulé élimine efficacement les liaisons
covalentes (crosslink) de l’ADN précédemment libéré en solution. Pour la fixation de l’ADN aux
billes paramagnétiques, le tampon de fixation MB2 et les billes NucleoMag® B-Beads sont
ajoutés au lysat.
La procédure est basée sur l’adsorption réversible des acides nucléiques sur des billes
paramagnétiques dans des conditions de tampons appropriées. Après la séparation
magnétique, les billes paramagnétiques sont lavées pour éliminer les contaminants et les
sels à l’aide de tampons de lavage MB4 et d’éthanol 80 %. L’éthanol résiduel des étapes de
lavage précédentes est éliminé par séchage à l’air. Enfin, l’ADN hautement pur est élué avec
le tampon d’élution MB6 à faible teneur en sel. L’ADN purifié peut être directement utilisé pour
des applications en aval, par exemple la qPCR. Le kit NucleoMag® DNA FFPE peut être utilisé
manuellement ou automatiquement sur des robots pipeteurs standards ou des séparateurs
magnétiques automatisés.
2.2
Caractéristiques du kit
Le kit NucleoMag® DNA FFPE est recommandé pour l’extraction de l’ADN à partir
d’échantillons de tissus fixés à la formaline et inclus en paraffine (FFPE). Les échantillons sont
généralement des coupes fines (d’une épaisseur d’environ 3 à 20 µm) d’origine humaine ou
animale généralement obtenus par résection ou biopsie tissulaire.
•
Quantité d’échantillon : La quantité maximale de l’échantillon est déterminée par : a) la
quantité de tissu et b) la quantité de paraffine. NucleoMag® DNA FFPE convient pour
un maximum de 5 mg de tissu. La quantité de paraffine est limitée à 15 mg, lors de
6
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
ADN génomique d'échantillons FFPE
l’utilisation du protocole standard avec le Paraffin Dissolver (environ 7 coupes de 10 µm
x 250 mm²). Cependant, des quantités plus importantes d’échantillons de paraffine
peuvent être traitées en utilisant soit un volume supérieur de Paraffin Dissolver ou soit une
déparaffinant à l’aide de xylène.
•
Le rendement en ADN dépend fortement du type d’échantillon, de sa qualité, de sa
quantité ainsi que des conditions et de la durée de stockage. De plus, le rendement
d’ADN mesuré peut varier considérablement d’une méthode de quantification à l’autre.
Le rendement déterminé par une mesure d’absorption à 260 nm ou par un colorant
fluorescent (par exemple, PicoGreen®) peut s’écarter des valeurs obtenues par
quantification au moyen de la PCR. Même les valeurs de quantification obtenues par PCR
avec un amplicon court (par exemple, 80 pb) et un amplicon long (par exemple, 300 pb)
peuvent également différer considérablement. L’écart de quantification dépend également
de la distribution de la taille de l’ADN ainsi que de l’efficacité de la réticulation (ou de la
persistance de réticulation).
•
Distribution de la taille des fragments d’ADN : L’ADN isolé à partir de tissus fixés à
la formaline et inclus en paraffine présente une distribution de taille allant de 50 à 5 000
bases. On observe surtout de l’ADN d’environ 100 à 300 bases, en particulier lorsque
l’échantillon est ancien. Cependant, les échantillons qui ont été soumis à de bonnes
pratiques de fixation, d’inclusion et de stockage des tissus peuvent produire de l’ADN
d’une taille supérieure à 5 000 pb.
•
Le temps de préparation de l’ADN dépend fortement de l’échantillon et du temps de
lyse nécessaire. Pour obtenir les meilleurs résultats, la lyse est effectuée à température
ambiante pendant au moins trois heures. Pour certains types d’échantillons, une lyse
plus longue (par exemple toute la nuit) permet même d’obtenir un rendement d’ADN
significativement supérieur.
•
L’utilisation de ce kit est réservée à l’usage de la recherche.
Le kit NucleoMag® DNA FFPE est conçu pour être utilisé avec le séparateur magnétique
NucleoMag® SEP (voir les informations de commande, paragraphe 6.2) ou d’autres systèmes
de séparation magnétique (voir paragraphe 2.4). Le temps de préparation manuelle de 96
échantillons est d’environ 120 minutes.
Le kit NucleoMag® DNA FFPE permet une automatisation facile sur les instruments courants
de manipulation des liquides ou les séparateurs magnétiques automatisés. Le temps de
préparation réel dépend de la configuration de l’instrument et du système de séparation
magnétique utilisé. Typiquement, 96 échantillons peuvent être purifiés en moins de 120 minutes
en utilisant le NucleoMag® SEP sur une plateforme d’automatisation.
2.3
Manipulation, préparation et stockage des échantillons
De nombreux facteurs influencent le rendement et la qualité de l’ADN obtenu à partir d’échantillons
FFPE. La procédure d’échantillonnage des tissus, le délai entre l’échantillonnage et la fixation,
la durée de la fixation, l’inclusion et les conditions de stockage ont un impact important sur la
qualité et le rendement de l’ADN. À partir d’un bloc de tissu inclus en paraffine, les échantillons
doivent être coupés proprement. Les coupes de paraffine peuvent être conservés à +4 °C ou
à une température inférieure pendant au moins plusieurs semaines sans effets observables sur
le rendement de l’ADN ou la possibilité d’utilisation. Le stockage à long terme des coupes de
paraffine peut avoir un effet négatif sur l’ADN en raison de l’oxydation de l’air. Porter des gants
à tout moment pendant la préparation. Changer de gants fréquemment.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
7
ADN génomique d'échantillons FFPE
2.4
Systèmes de séparation magnétique
Pour l’utilisation du NucleoMag® DNA FFPE, il est recommandé d’utiliser le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. La séparation est effectuée dans un bloc 96 puits carrés (voir
les informations de commande, paragraphe 6.2). Le kit peut également être utilisé avec d’autres
séparateurs magnétiques.
Séparateur magnétique
Plaque ou tube de séparation
®
NucleoMag SEP (MN REF 744900)
Bloc 96 puits carré (MN REF 740481 / ​.24)
Tecan Te-MagS™
Tubes de 1,5 mL sans couvercle (Sarstedt)
Séparation à aimants statiques
Les séparateurs à aimants statiques, par exemple notre NucleoMag® SEP (utilisation manuelle
ou sur robot pipeteur), sont recommandés en association avec un agitateur à plaques pour
une resuspension optimale des billes lors des étapes de lavage et d’élution. Alternativement,
les billes peuvent être resuspendues dans les tampons par plusieurs cycles d’aspiration / ​
refoulement. Pour une automatisation totale de la procédure sur un automate de pipetage,
un bras ’gripper’ est nécessaire pour le transfert des plaques de séparation de l’aimant vers
l’agitateur et inversement.
Systèmes à aimants mobiles
Les séparateurs à aimants mobiles font bouger les aimants d’un côté à l’autre des puits,
entrainant ainsi les billes à travers les solutions de lavage et d’élution. La séparation magnétique
a lieu lors de l’arrêt des aimants.
Séparateurs automatisés
Ces séparateurs transfèrent les billes dans les différents tubes ou plaques. Les billes sont
resuspendues par rétractation des aimants à l’intérieur de leur protection. Après chaque étape
de fixation, de lavage ou d’élution, les billes sont collectées et transportées dans le tube ou
plaque correspondant à la solution suivante.
2.5
Réglage des paramètres de l’agitateur
Lors de l’utilisation d’un agitateur de plaques pour les étapes de lavage et d’élution, les
réglages des paramètres de l’agitateur doivent être soigneusement ajustés afin d’éviter toute
contamination croisée d’un puits à l’autre. Procéder comme suit :
Réglage de l’agitation pour les étapes de fixation et de lavage :
•
Déposer 600 µL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque
sur l’agitateur et commencer à l’agiter à vitesse modérée pendant 30 secondes. Arrêter
l’agitateur et vérifier l’absence de projections à la surface de la plaque.
•
Augmenter la vitesse, agiter pendant 30 secondes supplémentaires et vérifier l’absence
de projections à la surface de la plaque.
•
Continuer à augmenter la vitesse d’agitation jusqu’à observer des projections sur le
dessus de la plaque de séparation. Réduire ensuite progressivement la vitesse, vérifier
l’absence de projections et utiliser ce réglage pour les étapes de lavage.
8
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
ADN génomique d'échantillons FFPE
Réglage de l'agitation pour l’étape d’élution :
•
Introduire 100 µL d’eau colorée dans les puits de la plaque de collecte et procéder
comme mentionné ci-dessus.
2.6
Manipulation des billes
Distribution des billes
Une distribution homogène des billes magnétiques dans les différents puits de la plaque de
séparation est essentielle pour une bonne reproductibilité. Par conséquent, avant de distribuer
les billes, s’assurer qu’elles sont complètement remises en suspension. Bien agiter le flacon de
stockage ou le placer brièvement sur un vortex. Le mélange préliminaire des billes magnétiques
avec le tampon de fixation permet une distribution plus homogène des billes dans les différents
puits de la plaque de séparation. Lors de l’automatisation, une étape de mélange des billes et
du tampon de fixation dans les réservoirs avant leur distribution dans les plaques de séparation
est recommandée afin de s’assurer que les billes demeurent bien en suspension.
Durée de séparation magnétique
L’attraction des billes magnétiques sur les aimants magnétiques dépend de la force magnétique
de l’aimant, de la plaque de séparation sélectionnée, de la distance entre les parois des puits
et les aimants ainsi que du volume présent dans les puits. Les temps d’aimantation des billes
doivent être ajustés en fonction de chaque système. Il est recommandé d’utiliser des plaques
ou tubes de séparation validés pour le type de séparateur magnétique utilisé.
Lavage des billes
Le lavage des billes est effectué par agitation ou pipetage. Contrairement au pipetage, l’agitation
permet la resuspension des billes dans tous les puits simultanément. Ceci permet de réduire
le temps de la procédure et le nombre de cônes nécessaires. Cependant, la resuspension par
pipetage est plus efficace que l’agitation de la plaque ou l’agitation magnétique.
Efficacité de
resuspension
Rapidité
Nombre de cônes
Magnétique
+
++
Faible
Agitateur
++
++
Faible
Pipetage
+++
+*
Elevé
Méthode
+ : acceptable, ++ : bon, +++ : excellent, * Pipette 8-canaux
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
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ADN génomique d'échantillons FFPE
2.7
Utilisation de la protéinase K
Afin de distribuer la solution de protéinase K à chaque échantillon, il est recommandé de
préparer la quantité nécessaire dans un tube séparé. En utilisant un dispositif de manipulation
des liquides, il est recommandé de distribuer la solution de protéinase K nécessaire (25 µL
par préparation) avec 10 % de volume supplémentaire dans un tube approprié pour le robot.
La solution de protéinase K non utilisée doit être conservée à - 20 °C pour les extractions
ultérieures.
2.8
Procédures d’élution
L’ADN purifié peut être directement élué avec le tampon d’élution MB6 fourni avec un volume
≥ à 25 µL. Il est essentiel de couvrir complètement les billes NucleoMag® B-Beads avec le
tampon d’élution durant cette étape. Le volume de tampon d’élution distribué dépend du
système de séparation magnétique (p.e. la position du culot de billes à l’intérieur des tubes
de la plaque de séparation). Pour une élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être
complètement remis en suspension dans le tampon d’élution. Pour certains séparateurs, des
volumes d’élution plus élevés peuvent être nécessaires pour recouvrir totalement le culot de
billes magnétiques.
L’élution est possible à température ambiante. Le rendement peut être augmenté de 15 à 20 %
si l’élution est effectuée à 55 °C.
10
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
ADN génomique d'échantillons FFPE
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention : Les tampons MB2 et MB4 contiennent des sels chaotropiques ! Porter des gants
et des lunettes !
Conditions de stockage :
•
Tous les composants du kit NucleoMag® DNA FFPE doivent être conservés à température
ambiante (15 – 25 °C) et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette de l’emballage.
•
Tous les tampons sont livrés prêts à l’emploi.
Avant de commencer le protocole NucleoMag® DNA FFPE, préparer les éléments suivants :
•
Protéinase K : avant la première utilisation du kit, ajouter le volume indiqué de tampon
protéinase PB pour dissoudre la protéinase K lyophilisée. La solution de protéinase K est
stable à - 20 °C pendant au moins 6 mois.
NucleoMag® DNA FFPE
REF
Protéinase K (lyophilisée)
•
1 × 96 prep.
744320.1
4 × 96 preps
744320.4
75 mg
75 mg
Ajouter 2,8 mL de tampon
protéinase PB
Ajouter 2,8 mL de tampon
protéinase PB
Éthanol à 80 % : Utiliser de l’éthanol de qualité biologie moléculaire, diluer avec de l’eau
exempte de nucléases jusqu’à 80 %.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
11
ADN génomique d'échantillons FFPE
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® DNA FFPE, portez des vêtements de protection
appropriés (par exemple, une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de
protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées
(les FDS sont disponibles en ligne sur www.mnnet.com/msds).
Attention : Le perchlorate de sodium contenu dans les tampons MB2 et MB4 peut former des
composés hautement réactifs lorsqu’il est combiné à de l’eau de Javel ! Par conséquent, ne
pas ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation
d’échantillons.
Les déchets générés par le kit NucleoMag® DNA FFPE n’ont pas été testés pour détecter
la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du
matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison de la forte dénaturation du
tampon de lyse et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut pas être totalement exclue.
Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être
manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Éliminer les matériaux dangereux, infectieux ou biologiquement contaminés d’une manière sûre
et acceptable et conformément à toutes les exigences locales et réglementaires.
12
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
NucleoMag® DNA FFPE
5
Protocole d’extraction de l’ADN génomique à
partir de tissus
Résumé du protocole
•
Pour les exigences complémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les
paragraphes 1.2 et 2.4, respectivement.
•
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 16.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier si la protéinase K a été préparée conformément au chapitre 3.
Déparaffinage de
l’échantillon
400 µL de Paraffin Dissovler
60 °C, 3 min
Mélanger immédiatement
l’échantillon chaud au vortex
Refroidir jusqu’à TA
2
Lyse de l’échantillon
Ajouter à chaque échantillon :
200 µL de FL
25 µL de protéinase K
Mélanger au vortex pendant 5 s
11 000 x g, 1 min
56 °C, 1 – 3 h
3
Décrosslink
11 000 x g, 30 s
100 µL D-Link
Mélanger au vortex pendant 5 s
11 000 x g, 1 min
90 °C , 30 min
11 000 x g, 1 min
4
Transfert de l’échantillon
Charger la phase aqueuse
(inférieure) dans le Square-well
Block
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
13
NucleoMag® DNA FFPE
5
Fixation de l’ADN aux
NucleoMag® B-Beads
14 µL NucleoMag® B-Beads
600 µL MB2
Mélanger en agitant à 1 000 rpm
pendant 5 min à TA.
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant après
2 min de séparation.
6
Lavage avec le tampon
MB4
Retirer le Square-well Block du
NucleoMag® SEP
600 µL MB4
Agiter 1 – 3 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant après
2 min de séparation.
7
Lavage avec de
l’éthanol à 80 % (1er)
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
600 µL d’éthanol à 80 %.
Agiter 1 – 3 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
8
Lavage avec de
l’éthanol à 80 % (2ème)
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
600 µL d’éthanol à 80 %.
14
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
NucleoMag® DNA FFPE
Agiter1 – 3 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
9
Séchage des billes
magnétiques
Sécher à l’air pendant 10 min
à TA
10
Elution de l’ADN
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
25 – 100 µL MB6
(Optionnel : élution à 56 °C)
Agiter 5 min à RT
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs
)
Séparer 2 min et transférer
l’ADN dans la plaque d’élution / ​
les tubes.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
15
NucleoMag® DNA FFPE
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (p. ex. NucleoMag®
SEP) et les agitateurs de plaques appropriés (voir paragraphe 2.4). Il est recommandé
d’utiliser un Square-well Block pour la séparation (voir paragraphe 1.2). L’extraction de l’ADN
peut également être réalisée dans des tubes de réaction avec des séparateurs magnétiques
appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et peut servir de guide pour
l’automatisation du kit.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier si la protéinase K a été préparée conformément au chapitre 3.
Déparaffinage de l’échantillon
Placer l’échantillon dans un microtube approprié de 1,5 mL.
Ajouter 400 µL de Paraffin Dissolver à l’échantillon. Incuber 3 min à 60 °C (pour
faire fondre la paraffine). Vortexer ou agiter l’échantillon immédiatement (à 60 °C) à
une vitesse élevée pour dissoudre la paraffine. Refroidir l’échantillon à la température
ambiante.
Veiller à ce que la paraffine fonde complètement pendant l’étape d’incubation à chaud
et bien mélanger après la dissolution pour dissoudre complètement la paraffine.
Un mélange insuffisant de l’échantillon chauffé peut entraîner la réapparition de
particules de paraffine solides. S’assurer que l’échantillon ne contient pas plus de
15 mg de paraffine ou ajuster le volume du Paraffin Dissolver.
2
Lyse de l’échantillon
Ajouter 200 µL de tampon de lyse FL et 25 µL de protéinase K à la phase aqueuse
inférieure. Bien mélanger par pipetages successifs, en vortexant ou par agitation.
Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 min et incuber à 56 °C pendant 1 à 3 h ou toute
une nuit sous agitation.
3
Décrosslink
Centrifuger pendant 1 min à 11000 x g.
Régler le bloc chauffant à 90 °C. Ajouter 100 µL de tampon D-Link, mélanger par
pipetages successifs, vortexer pendant 5 s ou agiter.
Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g pour obtenir la formation d’une phase. Incuber
à 90 °C pendant 30 min, mélanger au vortex pendant 5 s. Refroidir les échantillons à
température ambiante
Centrifuger les échantillons pendant 1 min à 11 000 x g.
L’étape de décrosslink est fortement recommandée pour les lyses de courte durée
(1 – 3 h) et peut être omise après une lyse d’une nuit.
4
Chargement de l’échantillon dans le Square-well Block.
Transférer 400 µL de la phase aqueuse inférieure de chaque échantillon dans un
Square-well Block pour la suite de la procédure.
16
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
NucleoMag® DNA FFPE
5
Fixation de l’ADN aux NucleoMag® B-Beads
Ajouter 14 µL de billes NucleoMag® B-Beads et 600 µL de tampon MB2 à
l’échantillon lysé.
Mélanger par pipetages successifs 6 fois et agiter pendant 5 min à température
ambiante.
Sinon, lors de la procédure sans agitateur, répéter le pipetage 10 fois et incuber
pendant 5 min à température ambiante.
Note : Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les retirer
du flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une
suspension homogène soit formée.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce
que toutes les billes soient attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide
d’une pipette.
Note : Ne pas pertuber les billes sur l’aimant lors de l’aspiration du surnageant.
6
Lavage avec le MB4
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 µL de tampon MB4 dans chaque puits et mélanger les billes en
agitant jusqu’à ce qu’elles soient complètement remises en suspension (1 – 3 min).
Alternativement, remettre complètement les billes en suspension par pipetages
successifs (15 fois).
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
7
Lavage avec de l’éthanol à 80 % (1er)
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 µL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et mélanger les billes en
agitant jusqu’à ce qu’elles soient complètement remises en suspension (1 – 3 min).
Alternativement, remettre complètement les billes en suspension par pipetages
successifs (15 fois).
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
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NucleoMag® DNA FFPE
8
Lavage avec de l’éthanol à 80 % (2ème)
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 µL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension
(1 – 3 min). Alternativement, remettre complètement les billes en suspension par
pipetages successifs (15 fois).
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
9
Séchage à l’air
Sécher à l’air le culot de billes magnétiques pendant 10 min à température ambiante.
10
Elution de l’ADN
Ajouter le volume désiré de tampon MB6 (25 – 100 µL) à chaque Square-well Block
et remettre les billes en suspension en agitant 5 min à température ambiante.
Alternativement, remettre complètement les billes en suspension par pipetages
successifs et incuber pendant 10 min à 56 °C.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
soient attirées par l’aimant. Transférer le surnageant contenant l’ADN génomique purifié
dans des microtubes ou des barrettes de tubes (voir les informations de commande,
paragraphe 6.2).
Note : Le rendement peut être augmenté de 15 à 20 % en utilisant un tampon d’élution
préchauffé (55 °C) ou en incubant la suspension billes/tampon d’élution à 55 °C
pendant 10 min.
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MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
ADN génomique d'échantillons FFPE
6
Annexes
6.1
Guide de résolution des problèmes
Problèmes
Causes possible et suggestions
Volume de tampon d’élution insuffisant
•
Les billes doivent être entièrement recouvertes de tampon
d’élution.
Performance insuffisante du tampon d’élution
•
Faible rendement
en ADN
Les tampons doivent être éliminés totalement après chaque
séparation magnétique. Les tampons résiduels diminuent
l’efficacité des lavages et de l’élution.
Séchage excessif des billes
•
Ne pas laisser les billes sécher car cela pourrait entraîner une
baisse de l’efficacité de l’élution.
Aspiration d’une partie des billes présents sur l’aimant
•
Ne pas perturber le culot de billes lors de l’aspiration du
surnageant, en particulier lorsque le culot n’est pas visible dans
le lysat.
Aspiration et perte de billes
•
Prolonger le temps de séparation magnétique ou diminuer la
vitesse d’aspiration.
Procédure de lavage insuffisante
•
Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de séparateur
et de plaque, par exemple, le Square-well Block en combinaison
avec le NucleoMag® SEP.
•
S’assurer que les billes sont complètement remises en
suspension pendant la procédure de lavage. Pipeter plusieurs
fois si l’agitation est insuffisante.
Pureté insuffisante
Contamination par de l’éthanol des tampons de lavage
•
Mauvaise
performance de
l’ADN lors des
applications avales
Veiller à éliminer l’éthanol provenant des étapes de lavage,
l’éthanol résiduel impactant négativement les applications avales.
Évaporation de l’éthanol des tampons de lavage
•
Fermer hermétiquement les flacons de tampons, éviter
l’évaporation de l’éthanol des flacons ainsi que des tampons
remplis dans les réservoirs pour la procédure automatisée. Ne
pas réutiliser les tampons de ces réservoirs.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
19
ADN génomique d'échantillons FFPE
Durée de séparation magnétique trop court
•
Perte de billes
Augmenter la durée de séparation pour permettre aux billes
d’être complètement attirées par les aimants magnétiques avant
d’aspirer tout liquide du puits.
Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution)
•
Une vitesse d’aspiration élevée lors de l’étape d’élution peut
entraîner l’aspiration des billes. Réduire la vitesse d’aspiration
pour l’étape d’élution.
Lyse incomplète
•
Absence ou faible
rendement en ADN
L’échantillon n’a pas été complètement immergé pendant
l’incubation thermique. Couper les échantillons en petits
morceaux. Bien mélanger. S’assurer que les échantillons sont
complètement immergés dans le mélange tampon FL / ​Proteinase
K. Incuber jusqu’à ce que les échantillons soient complètement
lysés.
Réactifs mal préparés
•
Préparer la solution tampon de protéinase K selon les instructions
(voir chapitre 3).
ARN dans l’échantillon
Contamination par
de l’ARN
•
Si l’on souhaite obtenir un ADN exempt d’ARN, refroidir
à température ambiante après l’incubation de la lyse et
ajouter 20 µL d’une solution de RNase A (20 mg/ml ; voir les
informations de commande, paragraphe 6.2). Incuber pendant
15 min en agitant modérément.
Quantité de paraffine trop élevée
Élimination
insuffisante de la
paraffine
20
•
L’utilisation d’un trop grand nombre de coupes de paraffine
ou d’un excès de paraffine peut entraîner une solidification
immédiate de la paraffine après l’incubation thermique lors du
refroidissement du lysat à la température ambiante. Répéter
l’incubation thermique en augmentant (par exemple, en doublant)
le volume du Paraffin Dissolver.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
ADN génomique d'échantillons FFPE
6.2
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoMag DNA FFPE
744320.1
744320.4
1 × 96 preps
4 × 96 preps
NucleoSpin® 96 DNA FFPE
740240.1
740240.4
1 × 96 preps
4 × 96 preps
NucleoSpin® FFPE DNA XS
740980.10
740980.50
740980.250
10 preps
50 preps
250 preps
Paraffin Disolver (bleu)
740343.60
60 mL
Protéinase K (lyophilisée)
740506
100 mg
RNase A (lyophilisée)
740505.50
740505
50 mg
100 mg
NucleoMag® SEP
744900
1
Blocs 96 puits carrés ’Square-well Block’
740481
740481.24
4
24
Film PE auto-adhésif
740676
50 feuilles
Rack de barrettes de tubes
(l’ensemble comprend 1 rack, 12 barrettes de 8 tubes
chacun et 12 barrettes de 8 bouchons)
740477
740477.24
4 sets
24 sets
Plaque d’élution à ’fond en U’
740486.24
24
Plaque d’élution à ’fond plat’
740673
20
KingFisher® 96 Accessory Kit A
(ensemble composé de Square-well Blocks,
Deep-well Tip combs, Plaques d’élution pour 4 ×
96 NucleoMag® DNA FFPE preps pour le système
KingFisher® 96)
744950
1 set
®
Visitez le site www.mn‑net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur les produits.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 04
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ADN génomique d'échantillons FFPE
6.3
Restriction de l’utilisation du produit / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne
font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société.
MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez
contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur
les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour
obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la
documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
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Tel. : +49 24 21 969‑333
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KingFisher est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific.
NucleoMag® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG.
NucleoSpin® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG.
PicoGreen est une marque déposée de Molecular Probes Inc.
Te-MagS est une marque déposée de Tecan Group Ltd, Suisse.
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
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marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
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