Macherey-Nagel NucleoBond Xtra Maxi EF, Maxi kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
Manuel
d’utilisation
User manual
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
n NucleoBond® Xtra Midi EF
n NucleoBond® Xtra Maxi EF
n NucleoBond® Xtra Midi Plus EF
n NucleoBond® Xtra Maxi Plus EF
Décembre 2022 / Rev. 13
www.mn-net.com
www.mn-net.com
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
(NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF)
Résumé du protocole (Rev. 13)
Midi
Maxi
1 – 3Culture et
collecte des
bactéries
4 – 5 Lyse des
cellules
(Important : vérifier
l’absence de précipité
de SDS dans le
Tampon LYS-EF)
6Equilibration
de la colonne
et de son filtre
7Neutralisation
8Clarification
et chargement
du lysat
9
4,500 – 6,000 x g
4 °C, 15 min
High-copy / ​low-copy
8 mL / ​16 mL
8 mL / ​16 mL
Tampon RES-EF
Tampon LYS-EF
High-copy / ​low-copy
12 mL / ​24 mL
12 mL / ​24 mL
TA, 5 min
Tampon RES-EF
Tampon LYS-EF
TA, 5 min
15 mL
Tampon EQU-EF
35 mL
Tampon EQU-EF
8 mL / ​16 mL Tampon NEU-EF
Mélanger jusqu’à décoloration totale
Incuber 5 min sur la glace
12 mL / ​24 mL Tampon NEU-EF
Mélanger jusqu’à décoloration totale
Incuber 5 min sur la glace
Retourner le tube 3 fois
Déposer le lysat sur le filtre de la colonne NucleoBond® Xtra
1er lavage
5 mL Buffer FIL-EF
10 Eliminer le filtre
11 2ème lavage
12 3
ème
lavage
13 Elution
14 Précipitation
15Lavage et
séchage
Jeter le filtre NucleoBond® Xtra
35 mL Tampon ENDO-EF
90 mL Tampon ENDO-EF
15 mL Tampon WASH-EF
45 mL Tampon WASH-EF
5 mL Tampon ELU-EF
15 mL Tampon ELU-EF
NucleoBond®
Xtra Midi EF
NucleoBond®
Xtra Midi Plus EF
NucleoBond®
Xtra Maxi EF
NucleoBond® Xtra
Maxi Plus EF
3.5 mL
Isopropanol
Vortexer
4,5 – 15,000 x g
4 °C, 30 min
3.5 mL
Isopropanol
Vortexer
TA, 2 min
Charger le
NucleoBond®
Finalizer
10.5 mL
Isopropanol
Vortexer
4,5 – 15,000 x g
4 °C, 30 min
10.5 mL
Isopropanol
Vortexer
TA, 2 min
Charger le
NucleoBond®
Finalizer Large
2 mL
70 % éthanol
2 mL
70 % éthanol
5 mL
70 % éthanol
4 mL
70 % éthanol
4,5 – 15,000 x g
TA, 5 min
10 – 15 min
16 Resolubilisation
10 mL Buffer FIL-EF
Volume
adéquat de TEEF ou H2O-EF
≥ 6 x air
jusqu’à sec
200 – 800 μL de
TE-EF ou H2O-EF
4,5 – 15,000 x g
TA, 5 min
15 – 30 min
Volume adéquat
de TE-EF ou
H2O-EF
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com
≥ 6 x air
jusqu’à sec
400 – 1000 μL de
TE-EF ou H2O-EF
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Sommaire
1 Composition
4
1.1 Composants des kits
4
1.2 Réactifs et équipement nécessaires
6
2 Caractéristiques des kits
7
3 A propos de ce manuel d’utilisation
8
4 Endotoxines
10
4.1 Localisation, structure moléculaire et fonction des endotoxines
10
4.2 Quantification des endotoxines
10
4.3 Elimination des endotoxines
10
®
5 Système de purification NucleoBond Xtra EF
11
5.1 Principe général
11
5.2 Colonnes échangeuses d’anions NucleoBond® Xtra
11
5.3 Croissance des cultures bactériennes
13
5.4 Amplification des plasmides low copy au moyen du chloramphénicol
14
5.5 Volume de culture pour les plasmides high copy
15
5.6 Volume de culture pour les plasmides low copy
16
5.7 Neutralisation du lysat et intérêt du réactif LyseControl
16
5.8 Lyse des cellules
17
5.9 Souches difficiles à lyser
17
5.10 Mise en place des colonnes NucleoBond® Xtra
18
5.11 Filtration et chargement du lysat
19
5.12 Lavage de la colonne
19
5.13 Elution et concentration de l’ADN plasmidique
20
5.14 Détermination du rendement et de la qualité de l’ADN
24
5.15 Etapes de pause possible
24
6 Conditions de stockage et préparation des réactifs
25
7 Instructions de sécurité
26
7.1 Elimination des déchets
26
®
8 Purification de l’ADN plasmidique avec le NucleoBond Xtra EF
27
8.1 Purification de plasmides High copy (Midi, Maxi)
27
8.2 Purification de plasmides Low copy (Midi, Maxi)
33
8.3 Concentration des éluats NucleoBond® Xtra EF avec les NucleoBond® Finalizers
36
9 Annexes
39
9.1 Guide de résolution des problèmes
39
9.2 Informations de commande
48
9.3 Restrictions d’utilisation / garantie
49
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
3
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
1
Composition
1.1
Composants des kits
NucleoBond® Xtra
Midi EF
NucleoBond® Xtra
Midi Plus EF
10 preps
740420.10
50 preps
740420.50
10 preps
740422.10
50 preps
740422.50
Tampon RES-EF*
100 mL
500 mL
100 mL
500 mL
Tampon LYS-EF
100 mL
500 mL
100 mL
500 mL
Tampon NEU-EF
100 mL
500 mL
100 mL
500 mL
Tampon EQU-EF
200 mL
1000 mL
200 mL
1000 mL
Tampon FIL-EF
60 mL
300 mL
60 mL
300 mL
Tampon ENDO-EF
2 × 200 mL
2 × 1000 mL
400 mL
2 × 1000 mL
Tampon WASH-EF
200 mL
1000 mL
200 mL
1000 mL
Tampon ELU-EF
60 mL
300 mL
60 mL
300 mL
Tampon TE-EF
30 mL
60 mL
30 mL
60 mL
H2O-EF (nucléases-free)
30 mL
60 mL
30 mL
60 mL
70 % EtOH (Concentré)
9 mL
35 mL
9 mL
35 mL
RNase A*
(lyophilisée)
6 mg
30 mg
6 mg
30 mg
Colonnes NucleoBond®
Xtra Midi et filtres
NucleoBond® Xtra Midi
10
50
10
50
NucleoBond® Finalizers
-
-
10
50
Seringues 30 mL
-
-
10
50
Seringues 1 mL
-
-
10
50
Supports en plastique
(réutilisables)
5
10
5
10
Manuel d’utilisation
1
1
1
1
REF
* Pour la préparation des réactifs et leurs conditions de stockage, voir le chapitre 5.
4
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
1.1
Composants des kits suite
NucleoBond® Xtra
Maxi EF
NucleoBond® Xtra
Maxi Plus EF
10 preps
740424.10
50 preps
740424.50
10 preps
740426.10
50 preps
740426.50
Tampon RES-EF*
150 mL
750 mL
150 mL
750 mL
Tampon LYS-EF
150 mL
750 mL
150 mL
750 mL
Tampon NEU-EF
150 mL
750 mL
150 mL
750 mL
Tampon EQU-EF
400 mL
2 × 1000 mL
400 mL
2 × 1000 mL
Tampon FIL-EF
125 mL
600 mL
125 mL
600 mL
Tampon ENDO-EF
1000 mL
5 × 1000 mL
1000 mL
5 × 1000 mL
Tampon WASH-EF
500 mL
2 × 1000 mL
500 mL
500 mL
2 × 1000 mL
500 mL
Tampon ELU-EF
180 mL
900 mL
180 mL
900 mL
Tampon TE-EF
30 mL
60 mL
30 mL
60 mL
H2O-EF (nucléases-free)
30 mL
60 mL
30 mL
60 mL
70 % EtOH (Concentré)
35 mL
3 × 35 mL
35 mL
3 × 35 mL
RNase A*
(lyophilisée)
10 mg
50 mg
10 mg
50 mg
Colonnes NucleoBond®
Xtra Maxi et filtres
NucleoBond® Xtra Maxi
10
50
10
50
NucleoBond® Finalizers
Large
-
-
10
50
Seringues 30 mL
-
-
10
50
Seringues 1 mL
-
-
10
50
Supports en plastiques
(réutilisables)
5
10
5
10
Manuel d’utilisation
1
1
1
1
Référence
* Pour la préparation des réactifs et leurs conditions de stockage, voir le chapitre 5.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
5
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
1.2
Réactifs et équipement nécessaires
Réactifs
•
Isopropanol (à température ambiante)
•
96 – 100 % ethanol (à température ambiante)
Equipement
•
Equipement standard de microbiologie pour la culture et la collecte des bactéries
(exemple : boucle d’inoculation, tubes et Erlens de culture, incubateur agitant à 37 °C,
centrifugeuse munie d’un rotor pour tubes ou flacons permettant de récolter les cellules).
•
Centrifugeuse réfrigérée capable d’atteindre ≥ 4,500 x g et munie d’un rotor compatible
avec les tubes ou flacons utilisés (inutile avec les kits NucleoBond® Xtra Midi / Maxi Plus
EF)
•
Nouveaux récipients plastiques et cônes de pipette pyrogène-et endotoxine-free. Si
des récipients en verre sont utilisés, chauffer à 180 °C sur la nuit pour détruire les
endotoxines. L’autoclavage n’inactive pas les endotoxines et n’est pas recommandé si
l’autoclave est également utilisé pour l’inactivation des cultures bactériennes.
•
Portoir pour colonnes ’NucleoBond® Xtra Combi Rack’ (’Voir Informations de
commandes’) ou support équivalent.
6
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
2
Caractéristiques des kits
•
Les kits NucleoBond® Xtra EF sont conçus pour la purification ultra rapide de
plasmides, cosmides et de très grands vecteurs (constructions P1, BACs, PACs) d’une
taille allant de 3 kpb jusqu’à 300 kpb
•
L’ADN purifié est considéré comme pratiquement exempt de contaminations par des
endotoxines (≤ 0.05 EU/µg d’ADN plasmidique).
•
Les colonnes NucleoBond® Xtra sont en polypropylène et contiennent une résine
de silice NucleoBond® Xtra conditionnée entre deux filtres inertes. Les colonnes sont
disponibles en format Midi et Maxi, pour des rendements moyens respectifs de l’ordre de
500 µg et 1000 µg avec des volumes de milieu de culture de 200 – 1200 mL.
•
Toutes les colonnes NucleoBond® Xtra sont résistantes aux solvants organiques
comme les alcools, le chloroforme, le phénol et sont aussi compatibles avec les tampons
contenant des agents dénaturants comme le formamide, l’urée ou des détergents
courants comme le Triton X-100 ou le NP-40.
•
La résine de silice NucleoBond® Xtra est utilisable dans une vaste gamme de pH
(pH 2.5 – 9) et peut rester en contact des tampons pendant plusieurs heures sans
variation de ses propriétés chromatographiques.
•
Les filtres de la colonne NucleoBond® Xtra sont des filtres larges spécialement
conçus pour s’insérer dans les colonnes NucleoBond® Xtra. Les filtres sont fournis
déjà placés dans les colonnes NucleoBond® Xtra et permettent un gain de temps en
rendant concomitantes les étapes de clarification et de chargement du lysat sur la résine
des colonnes NucleoBond® Xtra. Par ailleurs, l’utilisation des colonnes filtres évite une
fastidieuse étape de centrifugation pour la clarification du lysat.
•
Les filtres de la colonne NucleoBond® Xtra permettent l’élimination totale des
précipités, même en cas d’utilisation d’un volume important de lysat, sans colmatage et
sans endommagé l’ADN des vecteurs de grande taille comme les PACs ou BACs grâce à
une filtration douce permise par le filtre.
•
Les kits NucleoBond® Xtra Midi Plus EF et NucleoBond® Xtra Maxi Plus EF
contiennent de surcroit, respectivement, les NucleoBond® Finalizers et NucleoBond®
Finalizers Large. Ces outils sont conçus pour le dessalage et la concentration rapides
des éluats et sont compatibles avec la plupart des plasmides et cosmides de 2 – 50 kpb
avec un rendement de 40 – 90 % (dépendant du volume d’élution utilisé).
•
NucleoBond® Finalizer est un filtre seringue en polypropylène contenant une membrane
de silice spéciale. Le NucleoBond® Finalizer possède une capacité de fixation de
500 µg, tandis que le NucleoBond® Finalizer Large peut permettre de récupérer jusqu’à
2000 µg d’ADN plasmidique.
•
Grâce aux faibles volumes mort des filtres NucleoBond® Finalizers l’ADN plasmidique
peut être élué avec une concentration allant jusqu’à 3 µg/µL (voir paragraphe 5.12,
Figure 4 et Figure 5 pour des détails concernant l’impact du volume d’élution sur la
concentration).
•
Tous les NucleoBond® Finalizers sont résistants aux solvants organiques comme les
alcools, le chloroforme, le phénol et sont exempts d’endotoxines.
•
Uniquement pour la recherche.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
7
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
3
A propos de ce manuel d’utilisation
Le chapitre 4 correspond à la description détaillée du système de purification NucleoBond® Xtra
EF et contient des informations importantes, relatives à la croissance bactérienne, la
lyse cellulaire et les différentes étapes de la procédure de purification. Les chapitres 6 et 7
mentionnent les conditions de stockage des réactifs, les instructions pour leur préparation et
les recommandations en terme de sécurité.
Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs de lire ces chapitres attentivement avant
l’utilisation du kit. Les utilisateurs expérimentés pourront, quant à eux, utiliser directement le
protocole de purification (chapitre 8) ou encore le résumé du protocole pour un suivi rapide de
l’enchaînement des différentes étapes de la procédure.
Chaque étape de la procédure de purification est présentée selon l’exemple, ci-dessous, issu
du paragraphe 8.1:
Midi
!
Maxi
Lyse cellulaire (Tampon LYS-EF)
Vérifier l’absence de précipité SDS dans le Tampon LYS-EF avant utilisation.
Si un précipité blanc est visible, réchauffer le tampon pendant plusieurs minutes à
30 – 40 °C jusqu’à sa complète dissolution. Laisser le tampon revenir à température
ambiante avant utilisation (15 – 25 °C).
Ajouter le Tampon LYS-EF à la suspension.
Mélanger doucement en retournant le tube 5 fois. Ne pas vortexer, au risque de
fragmenter et de contaminer la suspension par de l’ADN chromosomique contenu
dans les débris cellulaires.
Incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.
Attention : l’exposition prolongée à des conditions alcalines peut dénaturer et
dégrader de manière irréversible l’ADN plasmidique ainsi que libérer de l’ADN
chromosomique dans le lysat.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de Tampon LYS-EF si une masse
cellulaire supérieure aux recommandations est utilisée (voir paragraphe 5.7 pour des
informations détaillées sur les conditions optimales de lyse cellulaire).
8 mL
12 mL
Si vous effectuez une Midi prep pour purifier de l’ADN plasmidique, vous trouverez les volumes
de tampon ou durée d’incubation dans les cadres blancs. Pour une Maxi prep, merci de suivre
les indications mentionnées dans les cadres noirs.
Le nom du tampon, les volumes de tampon, les durées d’incubation, les répétitions ou toutes
autres étapes importantes de la procédure sont soulignés par l’utilisation de caractères gras.
Les notes complémentaires ou les étapes optionnelles apparaissent en italiques. Les points
d’exclamation indiquent des informations et conseils essentiels pour réussir l’extraction.
Dans l’exemple, ci-dessus, il vous est demandé de vérifier le Tampon de lyse LYS-EF avant
utilisation, puis de lyser le culot de cellules dans 8 mL de Tampon LYS-EF pour la Midi
prep et dans 12 mL pour la Maxi prep. Suivez scrupuleusement les instructions et prenez
connaissances des conseils mentionnés concernant les adaptations du protocole.
8
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Il est recommandé de lire attentivement les instructions de ce manuel d’utilisation avant de
l’utiliser. Toute la documentation technique de littérature technique est également disponible sur
Internet à l’adresse www.mn‑net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications du
manuel d’utilisation actuel par rapport aux révisions précédentes ou mises à jour.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
9
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
4
Endotoxines
4.1
Localisation, structure moléculaire et fonction des
endotoxines
Contrairement aux bactéries Gram-positives qui possèdent uniquement une membrane
constituée d’une bicouche lipidique, les bactéries Gram-négatives ont une seconde membrane
entourant la membrane interne et seulement une fine paroi cellulaire. La couche externe de cette
seconde membrane est constituée de lipopolysaccharides amphiphiliques (LPS), également
appelés endotoxines.
La structure des endotoxines peut être divisée en trois domaines :
1. La partie Lipide A hydrophobe permet la fixation des LPS à l’intérieur de la membrane et
confère la toxicité des endotoxines. Sa structure est très stable chez toutes les souches de
bactéries Gram-négatives.
2. La partie interne hydrophile de la partie polysaccharidique des LPS, l’antigène-R, est un
sucre à courte chaîne avec une séquence très stable. Il présente de nombreuses charges
négatives et on considère que sa fonction est d’être la barrière principale contre les
substances hydrophobes telles que les antibiotiques ou les détergents.
3. Le polysaccharide hydrophile externe, extrêmement variable, l’antigène-O, est impliqué,
par exemple dans l’adhérence cellulaire et dans les interactions avec le système immunitaire
de l’hôte, il est responsable des propriétés immunologiques et de virulence des bactéries.
4.2
Quantification des endotoxines
Les endotoxines peuvent être mesurées grâce à des tests photométriques très sensibles (par
ex. “Pyrochrome”, Associates of Cape Cod, Inc.) et s’expriment en unité d’endotoxines (UE).
Pour la préparation de l’ADN plasmidique, le taux d’endotoxines est exprimé en UE par µg de
plasmides. Une concentration de 0.1 EU/µg est habituellement considérée comme endotoxinefree.
4.3
Elimination des endotoxines
Les endotoxines sont libérées des cellules en petite quantité pendant la croissance bactérienne,
en très grande quantité pendant la mort et la lyse cellulaire et donc pendant la procédure
de purification de l’ADN plasmidique. Comme les cellules intactes, les molécules de LPS
libérées induisent des réactions inflammatoires du système immunitaire des mammifères. C’est
pourquoi elles doivent être éliminées quantitativement des préparations de plasmides afin de
garantir de forts taux de transfections et une bonne viabilité des cellules transfectées.
En raison de leur nature amphiphilique et de leur charge négative, les endotoxines se comportent
comme l’ADN et sont co-purifiées avec la plupart des systèmes de purification de plasmides.
Les kits courants à base de membrane de silice avec une procédure de purification utilisant des
sels chaotropiques donnent de l’ADN plasmidique contenant un taux d’endotoxines > 1000
EU/µg. Les échangeurs anioniques tel que NucleoBond® Xtra réduit le niveau d’endotoxines
à < 1 EU/µg. Cependant, étant donné que ceci peut être encore trop élevé pour des résultats
de transfections optimales dans des cellules très sensibles telles que des cellules primaires ou
neuronales, NucleoBond® Xtra EF a été développé pour réduire le taux d’endotoxines à un
niveau ≤ à 0.05 EU/µg d’ADN plasmidique grâce à une technologie brevetée.
10
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
5
Système de purification NucleoBond® Xtra EF
5.1
Principe général
Les cellules bactériennes sont lysées à l’aide d’une combinaison optimisée de tampons
nouvellement conçus et basés sur la méthode de lyse NaOH / SDS de Birnboim et Doly*.
Après équilibration de la colonne NucleoBond® Xtra et du filtre NucleoBond® Xtra, la totalité
du lysat est déposée sur le filtre et clarifié par gravité. Parallèlement, le chargement de la résine
de silice de la colonne débute.
L’ADN plasmidique est fixé à la résine de silice NucleoBond® Xtra.
Après deux étapes de lavage efficaces pour éliminer les endotoxines, l’ADN plasmidique est
finalement élué, précipité, dessalé et dissout dans du TE-EF, H2O-EF ou tout autre tampon
exempt d’endotoxines pour une utilisation ultérieure.
!
Les colonnes NucleoBond® Xtra ne sont pas compatibles avec les systèmes
d’aspiration. L’utilisation des colonnes NucleoBond® Xtra sur une chambre à
vide peut induire une perte totale de l’ADN plasmidique.
5.2
Colonnes échangeuses d’anions NucleoBond® Xtra
NucleoBond® Xtra est une résine de silice échangeuse d’anions brevetée, développée par
MACHEREY‑NAGEL. Elle est dédiée à la purification des différentes classes d’acides nucléiques
comme les oligonucléotides, l’ARN et les plasmides.
La résine de silice NucleoBond® Xtra est constituée de billes de silice macroporeuses,
hydrophiles, fonctionnalisées avec le groupement MAE (méthyl-amino-éthanol). La densité
élevée de ces groupes fonctionnels procure une charge positive globale de densité élevée dans
des conditions de pH acide permettant aux groupements phosphate de l’ADN plasmidique,
chargés négativement, de se fixer avec une grande spécificité (Figure 1).
CH 3
Si
spacer
échangeuse d’anion
groupement MAE
NH
O
OH
CH 2
lia
is
on
O
O
P
O
Squelette d’ADN
O
Figure 1 Interaction ionique entre le groupe fonctionnel méthyl-hydroxyéthyl-amino chargé
positivement et les groupements phosphate oxygène chargés négativement du
squelette de l’ADN.
Contrairement au groupe DEAE (diéthylaminoéthyl) couramment utilisé, le groupe hydroxyl
du méthyl-hydroxyéthyl-amino peut être impliqué dans des interactions supplémentaires,
de type liaison hydrogène de l’ADN.
* Birnboim, H. C. and Doly, J., (1979) Nucl. Acids Res. 7, 1513 – 1523
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
11
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Tous les contaminants, comme les protéines et les ARNs, sont lavés et éliminés de la colonne.
La charge positive de la résine est neutralisée par un passage du pH à des conditions
légèrement alcalines et l’ADN plasmidique pur est élué en présence d’un tampon fortement
concentré en sel.
Les acides nucléiques purifiés peuvent être utilisés pour des applications de biologie moléculaire
les plus exigeantes, comme la transfection, la transcription in vitro, le séquençage automatique
ou manuel, le clonage, l’hybridation et la PCR.
Classe des composés
ADN plasmidique;
constructions de grande taille
ADN simple brin,
ADN double brin
ARNm, ARNr 16S/23S
ARNr 5S
ARNt
ARNt
Absorbance à 260 nm
ARNr
ADN plasmidique,
constructions de
grande taille
Protéines, marquages,
polysaccharides, métabolites,
trinucléotides
0
0.5
1
1.5
2
Concentration en sel pour l’élution [M (KCl)]
Figure 2 Profil d’élution de la résine de silice NucleoBond® Xtra à pH 7.0
Plus le nombre d’interactions entre le squelette d’un acide nucléique et la résine chargée
positivement est élevé, plus l’élution est tardive en présence de concentrations en sel
croissant. Les acides nucléiques de grande taille sont porteurs de plus de charges
négatives que les plus petits fragments ainsi que l’ADN double brin plus que l’ARN simple
brin.
12
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
5.3
Croissance des cultures bactériennes
Le rendement et la qualité de l’ADN plasmidique dépend fortement du type de milieu de
culture et des antibiotiques utilisés, de la souche bactérienne, du type de plasmide, de sa taille
et du nombre de copies par cellules mais aussi des conditions de culture.
Pour des plasmides high copy standards, le milieu LB (Luria-Bertani) est recommandé. La
culture bactérienne doit être incubé à 37 °C sous agitation constante (200 – 250 rpm), de
préférence pendant 12 – 16 h (une nuit). Utiliser des Erlens d’un volume au moins trois ou quatre
fois supérieur au volume de la culture pour obtenir un milieu de culture saturé en oxygène.
De plus, des milieux riches comme le 2 xYT (Yeast / Tryptone), le TB (Terrific Broth) ou le milieu
CircleGrow peuvent être utilisés. Dans ce cas, les bactéries se multiplient plus vite, la phase
stationnaire est atteinte plus rapidement que dans le milieu LB (≤ 2 h) et une masse cellulaire
plus importante peut être obtenue. Cependant, ceci n’implique pas forcément un rendement
d’ADN plasmidique plus élevé. Une culture dont la croissance a été excessivement prolongée
peut contenir une plus grande proportion de cellules mortes ou mourantes, et l’ADN plasmidique
résultant peut être partiellement dégradé ou contaminé avec de l’ADN chromosomique. Pour
déterminer les conditions de culture optimales, le milieu et la durée d’incubation doivent être
adaptés pour chaque combinaison souche bactérienne / ​plasmide.
Les cultures doivent être soumises à une pression de sélection constante grâce à un
antibiotique pour garantir la propagation des plasmides. Sans cette pression de sélection,
les cellules tendent à perdre leur plasmide pendant la division cellulaire. Les bactéries, sans
cette charge de plasmides high copy, ont une croissance plus rapide et envahissent la culture
impliquant un rendement en ADN plasmidique faible et indépendant de la croissance cellulaire.
Le Tableau 1 donne des informations sur les concentrations d’antibiotiques couramment
utilisées.
Tableau 1: Informations à propos des antibiotiques selon Maniatis*
Antibiotique
Solution stock
(concentration)
Stockage
Concentration utile
Ampicilline
50 mg/mL in H2O
-20 °C
20 – 50 µg/mL
Chloramphénicol
34 mg/mL in EtOH
-20 °C
25 – 170 µg/mL
Kanamycine
10 mg/mL in H2O
-20 °C
10 – 50 µg/mL
Streptomycine
10 mg/mL in H2O
-20 °C
10 – 50 µg/mL
Tétracycline
5 mg/mL in EtOH
-20 °C
10 – 50 µg/mL
Carbénicilline
50 mg/mL in H2O
-20 °C
20 – 60 µg/mL
* Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J: Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring, New
York 1982.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
La souche d’E. coli influence grandement la qualité de l’ADN plasmidique. Les souches comme
DH5α® ou XL1-Blue produisent habituellement des plasmides surenroulés de haute qualité.
D’autres souches, comme par exemple HB101, avec un contenu élevé en endonucléases,
peuvent induire une qualité moindre de l’ADN plasmidique et donc impacter les performances
pour les réactions ultérieures comme les restrictions enzymatiques ou le séquençage.
Le type de plasmide, en particulier en termes de taille et d’origine de réplication (ori) a
une importance cruciale sur le rendement en ADN. En général, plus le plasmide ou son insert
est grand, moins le rendement attendu est important en raison d’un nombre de copie par
cellule généralement plus faible. Même un plasmide high copy basé sur une ori ColE1 peut se
comporter comme un vecteur low copy s’il contient un insert de grande taille ou défavorable.
De plus, l’ori elle-même influence le rendement d’un facteur 10 – 100. Ainsi, les plasmides
basés sur par exemple pBR322 ou pACYC, les cosmides ou les BACs sont maintenus à un
nombre de copie par cellule < 20 et même parfois réduit à 1 copie, tandis que les vecteurs
basés sur le pUC, pBluescript ou pGEM peuvent être représentés par plusieurs centaines de
copies par cellule.
Par conséquent, tous les facteurs mentionnés, ci-dessus, doivent être considérés, en particulier
si un objectif de rendement d’ADN est fixé. Le volume de culture et la procédure de lyse doivent
être ajustés conjointement.
5.4
Amplification des plasmides low copy au moyen du
chloramphénicol
Pour accroître drastiquement le nombre de copie par cellule pour les plasmides low copy
dérivés de pMB1 / colE1, cultiver les cellules jusqu’au milieu ou jusqu’à la fin de la phase
logarithmique (OD600 ≈ 0.6 – 2.0) sous pression sélective avec l’antibiotique approprié. Ajouter
ensuite 170 µg/mL de chloramphénicol et poursuivre l’incubation pendant encore 8 – 12 heures.
Le chloramphénicol inhibe la synthèse des protéines de l’hôte et empêche ainsi la réplication
du chromosome de l’hôte. La réplication des plasmides, cependant, est indépendante des
protéines néo-synthétisées et se poursuit pendant plusieurs heures et ils s’accumulent jusqu’à
atteindre 2000 – 3000 copies par cellule*.
Alternativement, la culture bactérienne peut être soumise à une inhibition partielle de la synthèse
des protéines en utilisant de faibles concentrations (10 – 20 µg/mL) de chloramphénicol,
induisant une augmentation du rendement ADN d’un facteur 5 – 10 **.
Les deux méthodes ont l’avantage d’augmenter la quantité de plasmides par rapport à
la quantité d’ADN génomique, mais ne fonctionnent évidemment qu’avec les plasmides ne
portant pas de gène de résistance au chloramphénicol. De plus, la méthode n’est efficace que
pour des plasmides low copy soumis à un contrôle rigoureux (ex : pBR322). Tous les plasmides
récents high copy (ex : pUC) sont déjà sous contrôle relâché en raison de mutations dans les
gènes de contrôle du nombre de copies et donc le traitement chloramphénicol n’améliore pas
significativement le nombre de copies par cellule.
* Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J: Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring, New
York 1982.
**
Frenkel L, Bremer H: Increased amplification of plasmids pBR322 and pBR327 by low concentrations of
chloramphenicol, DNA (5), 539 – 544, 1986..
14
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
5.5
Volume de culture pour les plasmides high copy
En raison de l’influence des milieux de culture (TB, CircleGrow, 2 xYT), les conditions de
croissance (agitation, température), la souche bactérienne, le type de plasmide et d’insert etc…
la quantité finale de cellules dans les cultures bactériennes peut grandement varier. En règle
générale, une culture de E.coli avec un litre de LB et une DO600 de 1 contient 1 × 1012 cellules
et correspond à une masse de culot frais 1.5 – 1.8 g. Les cultures overnight en milieu LB,
en Erlens vigoureusement agitées, atteignent en général une DO600 de 3 – 6. Les cultures en
fermenteur peuvent même atteindre une DO600 de 10 et plus. Le rendement d’ADN attendu
pour un plasmide high copy est d’environ 1 mg par gramme de culot bactérien frais.
Il est donc important d’ajuster la quantité de masse cellulaire plutôt que le volume de
culture pour optimiser les résultats des purifications. Il est particulièrement important de
déterminer la masse cellulaire pour les milieux de croissance riches (par ex., PLASMID+®,
CirclegrowTM, Terrific Broth). Les milieux de croissance riches peuvent contenir 5 à
10 fois plus de cellules par mL que les milieux de croissance ordinaires (par ex. LB).
L’utilisation de milieux de croissance riches sans vérifier les quantités de cellules peut
facilement conduire à une surcharge du kit et à une perte de rendement. Mais, tandis que
la masse de cellules ou de culot cellulaire est fastidieuse à mesurer, cette valeur est remplacée
dans ce manuel par le produit mathématique de la densité optique à 600 nm (DO600) et du
volume de culture (Vol) – deux variables beaucoup plus faciles à mesurer.
DOV = DO600 x Vol [ mL]
Noter que pour une détermination correcte de la DO des cultures bactériennes, les échantillons
doivent être dilués si la DO600 excède 0,5 afin que la mesure soit dans la zone linéaire où
la DO600 croît proportionnellement à la masse cellulaire. Pour une culture correcte de E.coli,
une dilution au 1:10 dans du milieu de culture est recommandé. La DO600 mesuré est ensuite
multipliée par le facteur de dilution (dans le cas décrit par 10) pour obtenir la valeur théorique
DO600. Cette valeur est utilisée dans le Tableau 2 pour déterminer le volume de culture le plus
approprié. Le Tableau 2 mentionne les valeurs de DOV et les couples de valeurs DO600 / ​volume
de culture correspondants et pouvant être facilement mis en œuvre avec le protocole et les
volumes de réactifs de lyse standards. Par exemple, pour une DO600 de 6 de culture d’E. coli,
utiliser 66 mL de culture bactérienne pour une Midi prep ou 200 mL de cette même culture
pour une Maxi prep.
Tableau 2: Volumes de culture recommandés pour des plasmides high copy
NucleoBond®
Xtra
Masse
de culot
frais
DOV
rec.
DO600 =
2
DO600 =
4
DO600 =
6
DO600 =
8
DO600 =
10
Midi
0.75 g
400
200 mL
100 mL
66 mL
50 mL
40 mL
Maxi
2.25 g
1200 600 mL
300 mL
200 mL
150 mL
120 mL
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
15
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
5.6
Volume de culture pour les plasmides low copy
Les kits NucleoBond® Xtra sont conçus pour l’extraction de plasmides high copy (parfois
plusieurs centaines de copies/cellule) ainsi que pour les plasmides low copy (< 20 copies /
cellule). Cependant, lors de la purification de plasmides low copy, la masse cellulaire et les
volumes de tampons de lyse doivent être augmentés, au moins doublés pour produire assez
d’ADN afin d’utiliser la capacité de fixation des colonnes. Le Tableau 3 présente les valeurs DOV
et les couples DO600 / ​volume de culture correspondant pour les cultures de bactéries dédiées
à la purification de plasmides low copy (pour des informations détaillées sur le calcul DOV
= DO600 x Vol., voir le paragraphe 5.5). Par exemple, pour une DO600 de 6, collecter 133 mL de
culture bactérienne pour une Midi prep et 400 mL pour une Maxi prep.
Tableau 3: Volumes de culture recommandés pour les plasmides low copy
NucleoBond®
Xtra
Masse
de culot
frais
DOV
rec.
DO600 =
2
DO600 =
4
DO600 =
6
DO600 =
8
DO600 =
10
Midi
1.5 g
800
400 mL
200 mL
133 mL
100 mL
80 mL
Maxi
4.5 g
2400 1200 mL
600 mL
400 mL
300 mL
240 mL
Pour optimiser les rendements, il est possible d’augmenter le volume de culture et des tampons
de lyse, par exemple d’un facteur 3 – 5. Dans ce cas, des tampons de lyse supplémentaires
peuvent être commandés séparément (voir ’Informations de commande’). De plus, la
clarification du lysat peut nécessiter une étape de centrifugation plutôt que l’utilisation des filtres
NucleoBond® Xtra seules, leur capacité volumique pour recevoir le précipité étant limitée.
Noter que l’amplification au moyen du chloramphénicol peut être envisagée pour augmenter le
nombre de copies de plasmides par cellule (voir paragraphe 5.4).
5.7
Neutralisation du lysat et intérêt du réactif LyseControl
Un mélange complet du lysat avec le Tampon de neutralisation NEU-EF est d’une importance
primordiale pour une précipitation totale du SDS, des protéines et de l’ADN génomique. Une
neutralisation incomplète induit des rendements plus faibles, un écoulement gravitaire ralenti et
un colmatage possible du filtre NucleoBond® Xtra. Cependant, l’ADN plasmidique, en solution
à cette étape, est très vulnérable et une agitation excessive ou trop violente endommagerait
l’ADN.
Par conséquent, ne pas vortexer ou agiter mais retourner le mélange très doucement
jusqu’à la formation d’un précipité floconneux blanchâtre et d’une décoloration totale du réactif
LyseControl, sans aucune trace résiduelle de bleu.
16
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
5.8
Lyse des cellules
Les bactéries sous forme de culot sont resuspendues dans le Tampon RES-EF et lysées lors
d’un traitement NaOH/SDS avec le Tampon LYS-EF. Dans ces conditions, les protéines ainsi
que l’ADN chromosomique et plasmidique sont dénaturées. L’ARN est dégradé par la RNase
A (exempte de DNase) préalablement ajoutée au Tampon RES-EF. Le Tampon de neutralisation
NEU-EF, contenant de l’acétate de potassium, est ensuite ajouté au lysat, provoquant la
précipitation du SDS sous forme de KDS (dodécyl sulfate de potassium), entraînant les
protéines, l’ADN chromosomique et autres débris cellulaires. Le tampon contenant l’acétate
de potassium neutralise également les conditions alcalines suite à l’addition de solution NaOH
et contribue à la renaturation de l’ADN plasmidique sous sa forme native surenroulée tout en le
conservant en solution.
Les volumes de tampons NucleoBond® Xtra EF (selon le protocole standard) sont ajustés pour
permettre la lyse optimale des volumes de culture recommandés pour les plasmides high copy
selon les recommandations du paragraphe 5.5, Tableau 2 Utiliser une quantité de cellules trop
importante peut impacter de manière négative l’efficacité de la lyse, de la précipitation, induire
une diminution du rendement et de la pureté. Par conséquent, les volumes de tampons de lyse
doivent être adaptés lors de l’utilisation de volumes de culture supérieurs, par exemple, lors de
la purification de vecteurs low copy (voir paragraphe 5.6, Tableau 3).
En règle générale, calculer les volumes de réactifs de lyse RES-EF, LYS-EF et NEU-EF
nécessaires de la manière suivante :
Vol. [mL] = Volume de culture [mL] x OD600 / ​50
Par exemple, pour un culot bactérien de 200 mL, issu d’une culture de DO600 = 4 et destinée
à la purification de plasmides low copy, les volumes adéquats de Tampons RES-EF, LYSEF et NEU-EF sont de 16 mL pour chacun. Si des Tampons de lyse supplémentaires sont
nécessaires, un set de tampons complémentaires incluant les Tampons RES-EF, LYS-EF, NEUEF, et la RNase A peut être commandé séparément (voir ’Informations de commande’).
En utilisant des volumes adéquats de tampons de lyse, la durée de lyse peut être limitée à
3 – 4 minutes et ne doit pas excéder 5 minutes. Une exposition prolongée aux conditions
alcalines peut dénaturer et dégrader irréversiblement l’ADN plasmidique et conduire au
relargage d’ADN chromosomique dans le lysat.
5.9
Souches difficiles à lyser
Pour la purification de plasmides à partir de bactéries Gram-positives ou de souches disposant
des parois cellulaires plus résistantes, un traitement initial à la lysozyme peut s’avérer bénéfique.
Pour cela, suspendre le culot cellulaire dans le Tampon RES-EF contenant 2 mg/mL de
lysozyme et incuber à 37 °C pendant 30 minutes. Poursuivre avec la procédure de lyse selon
le protocole standard NucleoBond® Xtra EF.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
17
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
5.10 Mise en place des colonnes NucleoBond® Xtra
Idéalement, les colonnes NucleoBond® Xtra Midi ou Maxi seront placées sur un portoir
NucleoBond® Xtra Combi Rack (voir ’Informations de commande’). Elles sont maintenues
soient par le col de la colonne ou en utilisant les adaptateurs circulaires en plastique
(réutilisables) inclus dans les kits, permettant d’ajuster la hauteur des colonnes (voir Figure 3).
Ces adaptateurs peuvent aussi servir à maintenir les colonnes positionnées sur des tubes ou
des Erlens. Le support NucleoBond® Xtra Combi Rack peut également être utilisé avec les
kits NucleoBond® PC 100, 500 et 2000. Noter que les colonnes NucleoBond® Xtra Midi sont
aussi compatibles avec le support NucleoBond® Rack Large (REF 740563).
A
B
Figure 3 Montage des colonnes NucleoBond® Xtra Midi / ​Maxi sur le support NucleoBond®
Xtra Combi Rack
A : Montage pour les étapes de clarification, de chargement et de lavages.
B : montage pour l’élution.
18
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
5.11 Filtration et chargement du lysat
Après la lyse alcaline, l’échantillon doit être débarrassé des débris cellulaires et des précipités
pour garantir une pureté et un débit élevés. Ceci est possible en filtrant le lysat sur les filtres
NucleoBond® Xtra, déjà insérées dans les colonnes NucleoBond® Xtra.
NucleoBond® Xtra
Midi
NucleoBond® Xtra
Maxi
Filtre
NucleoBond® XTRA
Colonne
NucleoBond® XTRA
Les filtres NucleoBond® Xtra sont conçus pour éliminer l’étape de centrifugation après la lyse
alcaline. Ces filtres sont pré-imbibés pendant l’équilibration et permettent un gain de temps en
effectuant la clarification du lysat bactérien et le chargement de la colonne NucleoBond® Xtra
simultanément.
En comparaison avec la clarification par centrifugation ou au moyen de filtres seringues, les
filtres NucleoBond® Xtra empêchent la dégradation des constructions d’ADN de grande taille
comme les PACs ou BACs grâce à une filtration douce en profondeur (la filtration intervient
aussi bien à la surface comme dans la matrice interne du filtre). Le filtre est conçu à partir d’un
matériel spécial permettant une filtration très rapide du lysat. De plus, de très grands volumes
de culture peuvent être appliqués sans risque de colmatage. Cet aspect est particulièrement
important lors de la purification de plasmides low copy. Cependant, pour une lyse de culot
bactérien supérieur aux recommandations (voir paragraphe 5.5, Tableau 2, et paragraphe 5.6,
Tableau 3), il peut s’avérer bénéfique de clarifier le lysat par centrifugation plutôt qu’avec les
filtres fournis avec les colonnes, en raison de leur capacité limitée en volume.
5.12 Lavage de la colonne
La concentration élevée en sels du lysat prévient la fixation des protéines et de l’ARN sur la
colonne NucleoBond® Xtra (voir paragraphe 5.2, Figure 2). Cependant, pour éliminer toute
trace de contaminants et purger le volume mort des filtres NucleoBond® Xtra, il est important
de laver la colonne et le filtre en deux étapes consécutives.
Appliquer d’abord le Tampon de lavage FIL-EF sur les bords supérieurs évasés du filtre pour
laver tout lysat résiduel du filtre sur la colonne. Ne déposer pas seulement le tampon dans le
centre du filtre ! Retirer et jeter ensuite le filtre de la colonne ou le faire tomber en retournant la
colonne.
Il est essentiel de laver la colonne NucleoBond® Xtra sans le filtre lors des deux étapes
supplémentaires avec les Tampons de lavage ENDO-EF et WASH-EF pour éliminer toute
trace d’endotoxine. Ceci permet d’assurer un rendement et une pureté plus élevés.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
19
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
5.13 Elution et concentration de l’ADN plasmidique
L’élution est menée en condition de forte concentration saline et grâce à un saut de pH de 7.0
à 9.0. Dans ces conditions alcalines, la charge positive de la résine échangeuse d’anions est
neutralisée et l’ADN plasmidique est relargué. Pour toutes applications, il est nécessaire de
précipiter l’ADN, de le dessaler et d’éliminer toute trace d’éthanol, potentiellement inhibiteur de
l’activité enzymatique lors des réactions de restrictions ou de séquençage.
Tous les éluats NucleoBond® Xtra EF contiennent déjà assez de sels pour une précipitation à
l’isopropanol de l’ADN. Par conséquent, la précipitation se réalise avec l’ajout de 0,7 volumes
d’isopropanol. Pour éviter la co-précipitation de sels, utiliser uniquement de l’isopropanol
à température ambiante et ne laisser pas l’éluat d’ADN s’écouler dans l’isopropanol mais
ajouter l’isopropanol à l’éluat final et mélanger immédiatement.
Ensuite, suivre au choix, soit le protocole de précipitation par centrifugation décrit à la suite du
protocole NucleoBond® Xtra EF ou suivre le protocole additionnel mentionné au paragraphe
8.3 concernant l’utilisation des NucleoBond® Finalizers, outils éliminant les longues étapes de
précipitation par centrifugation (les NucleoBond® Finalizers ne sont recommandés que pour
des vecteurs de taille inférieure à 50 kpb).
Les NucleoBond® Finalizers sont dédiés à la concentration et au dessalage rapide des
plasmides et cosmides contenus dans les éluats obtenus avec les systèmes de purification
utilisant la technologie de chromatographie échangeuse d’anions. L’échantillon est précipité
à l’isopropanol comme mentionné ci-dessus et déposé sur une membrane de silice spéciale
au moyen d’une seringue. Après une étape de lavage à l’éthanol de la membrane, celle-ci est
séchée par le passage d’air au travers du filtre. L’élution de l’ADN purifié est menée avec de
l’H2O-EF ou un tampon légèrement alcalin comme le TE-EF (10 mM Tris/HCl, pH 7.5, 1 mM
EDTA).
Pour optimiser le rendement, il est recommandé d’effectuer l’étape d’élution deux fois.
La première élution est effectuée avec le tampon frais tandis que la seconde est menée en
redéposant la première élution sur le NucleoBond® Finalizer afin de permettre une solubilisation
complète de l’ADN plasmidique.
Le rendement d’ADN dépend du volume de tampon d’élution utilisé. Les volumes élevés
permettent un rendement élevé, jusqu’à 90 % mais une concentration plus faible. Les petits
volumes d’élution, d’autre part, favorise la concentration au détriment du rendement d’ADN.
Si un petit volume est choisi, veiller à récupérer le maximum du liquide contenu dans la seringue
et le NucleoBond® Finalizer en pressant fortement de l’air à travers le filtre NucleoBond®
Finalizer à plusieurs reprises de manière à collecter toutes les gouttelettes et minimiser le
volume mort.
Figure 4 et Figure 5 illustrent, à titre d’exemple, comment le rendement et la concentration
de l’ADN final sont dépendant du volume de tampon d’élution utilisé avec les NucleoBond®
Finalizer et les NucleoBond® Finalizer Large, respectivement.
20
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
100
2.0
90
1.8
80
1.6
70
1.4
60
1.2
50
1.0
40
0.8
30
0.6
20
0.4
10
0.2
Concentration [µg/µL]
Rendement [%]
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
Rendement
Concentration
Concentration [µg/µl]
0.0
0
0
200
400
600
800
1000
Volume d’élution [µL]
Figure 4 Rendement et concentration finaux d’ADN après utilisation de NucleoBond®
Finalizer
Un éluat issu d’une préparation NucleoBond® Xtra Midi EF et contenant 250 µg d’ADN
plasmidique (8 kpb) a été déposé sur un NucleoBond® Finalizer et élué deux fois avec des
volumes croissants de Tampon TE-EF.
Le NucleoBond® Finalizer est conçu pour retenir un maximum de 500 µg d’ADN et il est,
par conséquent, idéal en combinaison avec NucleoBond® Xtra Midi EF. Le rendement
maximal est obtenu en utilisant un volume > à 600 µL de tampon d’élution. Pour augmenter la
concentration, les utilisateurs expérimentés pourront diminuer le volume de tampon d’élution
à 400 – 200 µL.
Le Tableau 4 présente les rendements et les concentrations attendus pour différentes quantités
d’ADN déposées sur le NucleoBond® Finalizer. L’ADN a été élué en deux étapes successives
avec des volumes croissants de TE-EF. Merci de consulter ce tableau pour sélectionner un
volume de tampon d’élution approprié en fonction de vos besoins et de vos contraintes.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
21
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
Tableau 4: Rendement et concentration d’ADN avec NucleoBond® Finalizer
Volume d’élution
Quantité d’ADN déposée
500 µg
250 µg
100 µg
50 µg
100 µL
200 µL
400 µL
600 µL
800 µL
1000 µL
35 %
60 %
70 %
75 %
75 %
75 %
2.5 µg/µL
2.3 µg/µL
1.2 µg/µL
0.8 µg/µL
0.6 µg/µL
0.5 µg/µL
40 %
65 %
75 %
80 %
80 %
80 %
1.9 µg/µL
1.1 µg/µL
0.6 µg/µL
0.4 µg/µL
0.3 µg/µL
0.2 µg/µL
45 %
70 %
80 %
85 %
85 %
85 %
0.7 µg/µL
0.4 µg/µL
0.2 µg/µL
0.1 µg/µL
0.1 µg/µL
0.1 µg/µL
30 %
75 %
85 %
90 %
90 %
90 %
0.1 µg/µL
< 0.1 µg/
µL
0.3 µg/µL
0.2 µg/µL
0.1 µg/µL
0.1 µg/µL
Rendement d’ADN
Concentration d’ADN
Rendement [%]
90
2.5
80
70
2.0
60
1.5
50
40
1.0
30
20
0.5
10
Concentration [µg/µL]
3.0
100
Rendement
Concentration
Concentration [µg/µl]
0.0
0
0
200
400
600
800
1000
Volume d’élution [µL]
Figure 5 Rendement et concentration finaux d’ADN après utilisation de NucleoBond®
Finalizer Large.
Un éluat issu d’une préparation NucleoBond® Xtra Maxi EF et contenant 1000 µg d’ADN
plasmidique (8 kpb) a été déposé sur un NucleoBond® Finalizer Large et élué en deux fois
avec des volumes croissants de Tampon TE-EF.
22
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Les éluats issus des préparations NucleoBond® Xtra Maxi EF sont facilement concentrés
avec les NucleoBond® Finalizer Large capables de fixer jusqu’à 2000 µg d’ADN plasmidique.
Le rendement maximal est obtenu en utilisant un volume > à 800 µL de tampon d’élution. Pour
augmenter la concentration, les utilisateurs expérimentés pourront réduire le volume d’élution
à 600 – 400 µL.
Le Tableau 5 présente les rendements et concentrations attendus pour différentes quantités
d’ADN déposées sur le NucleoBond® Finalizer Large. L’ADN a été élué en deux étapes
successives avec des volumes croissants de TE-EF. Merci de consulter ce tableau pour
sélectionner un volume de tampon d’élution approprié en fonction de vos besoins et de vos
contraintes.
Tableau 5: Rendement et concentration d’ADN avec NucleoBond® Finalizer Large
Elution volume
Quantité d’ADN déposée
1500 µg
1000 µg
500 µg
100 µg
100 µL
200 µL
400 µL
600 µL
800 µL
1000 µL
5%
30 %
65 %
80 %
85 %
90 %
1.9 µg/µL
3.2 µg/µL
2.9 µg/µL
2.2 µg/µL
1.7 µg/µL
1.4 µg/µL
5%
35 %
70 %
85 %
90 %
90 %
1.3 µg/µL
2.5 µg/µL
2.1 µg/µL
1.6 µg/µL
1.2 µg/µL
1.0 µg/µL
10 %
40 %
70 %
85 %
90 %
90 %
1.3 µg/µL
1.4 µg/µL
1.0 µg/µL
0.8 µg/µL
0.6 µg/µL
0.5 µg/µL
15 %
45 %
70 %
80 %
85 %
90 %
0.4 µg/µL
0.3 µg/µL
0.2 µg/µL
0.1 µg/µL
0.1 µg/µL
0.1 µg/µL
Rendement d’ADN
Concentration d’ADN
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
23
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
5.14 Détermination du rendement et de la qualité de l’ADN
Le rendement d’une préparation de plasmides doit être estimé avant et après la précipitation
à l’isopropanol afin de mesurer l’efficacité de la procédure de précipitation et de déterminer le
volume le plus approprié pour la solubilisation finale du culot d’ADN. Utiliser le tampon d’élution
ELU-EF du kit NucleoBond® Xtra EF comme blanc pour la mesure spectrophotométrique de la
quantité d’ADN contenue dans l’éluat.
La concentration en acides nucléiques de l’échantillon est calculée à partir de l’absorption
à 260 nm, 1 unité (1 cm de trajet optique) équivaut à une concentration de 50 µg d’ADN / mL.
Noter que la mesure absolue de l’absorbance doit se situer entre 0,1 et 0,7 pour demeurer dans
la partie linéaire de la loi de Beer-Lambert et en déduire une valeur fiable de la concentration
d’ADN. Diluer l’échantillon si nécessaire.
La pureté de l’ADN plasmidique peut également être vérifiée par spectrophotométrie UV. Un
ratio A260 / ​A280 de 1,80 – 1,90 et un ratio A260 / ​A230 autour de 2,0 indiquent un ADN plasmidique
pur. Un ratio A260 / ​A280 au-delà de 2.0 est signe d’une contamination excessive par de l’ARN,
tandis qu’un ratio A260 / ​A280 inférieur à 1,8 indique une contamination par des protéines.
Le niveau d’endotoxines peut être mesuré avec des kits commerciaux comme par exemple le
kit “Pyrochrome”, Associates of Cape Cod, Inc.
La qualité de l’ADN plasmidique peut être vérifiée en effectuant une migration sur gel à 1 %
d’agarose. Cela procure des informations quant à la conformation et l’intégrité structurale de
l’ADN plasmidique purifié, par exemple, en offrant la possibilité de vérifier que les prédominances
conformationnelles : surenroulée (forme ’ccc’, habituellement la bande de migration la plus
rapide), en cercle ouvert (oc) ou même sous forme linéaire (paragraphe 9.1, Figure 6).
5.15 Etapes de pause possible
Les culots bactériens peuvent aisément être stockés plusieurs mois à -20 °C.
Les lysats clarifiés peuvent être conservés sur la glace ou à 4 °C pendant plusieurs jours.
Pour une performance optimale, la procédure de purification sur colonne ne doit pas être
interrompue. Cependant, les colonnes peuvent être laissées sans surveillance pendant plusieurs
heures du fait qu’elle ne sèche pas. Cependant, une faible perte de rendement pourrait être
observée.
Les éluats peuvent être stockés pendant plusieurs jours à 4 °C. Noter qu’ils devront être
équilibrés à température ambiante avant de procéder à la précipitation à l’isopropanol pour
éviter la co-précipitation des sels.
24
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
6
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Tous les composants du kit peuvent être conservés à température ambiante (15 – 25 °C) et sont
ainsi stables jusqu’à : voir l’étiquette sur le kit.
Le stockage du Tampon LYS-EF en deçà de 20 °C peut conduire à la précipitation du SDS
contenu. Le cas échéant, incuber le Tampon LYS-EF à 30 – 40 °C pendant plusieurs minutes et
mélanger efficacement jusqu’à complète dissolution du précipité. Laisser le tampon revenir à
température ambiante avant utilisation.
Avant toute première utilisation d’un kit NucleoBond® Xtra Midi / ​Maxi EF, préparer les réactifs
suivants :
•
Dissoudre la RNase A lyophilisée* avec 1 mL de Tampon RES-EF. Le port de gants
est recommandé. Mélanger en pipetant plusieurs fois jusqu’à ce que la RNase A soit
parfaitement dissoute. Transférer la solution de RNase A dans le flacon contenant le
Tampon RES-EF et mélanger précautionneusement. Noter sur le flacon la date d’ajout
de la RNase A. La concentration finale de RNase A est de 60 µg/mL de Tampon RES-EF.
Stocker le Tampon RES-EF contenant la RNase A à 4 °C. La solution est stable à cette
température pendant au moins 12 mois.
•
Ajoutez le volume indiqué d’éthanol 96 – 100 % dans l’eau endotoxin-free contenu dans le
flacon libellé «70 % EtOH ».
NucleoBond® Xtra Midi/Maxi EF
Référence
70 % l’éthanol
(concentré)
740420.10
740422.10
740424.10
740426.10
740420.50
740422.50
740424.50
740426.50
9 mL
Ajouter 21 mL
d’éthanol
35 mL
Ajouter 80 mL
d’éthanol
35 mL
Ajouter 80 mL
d’éthanol
2 × 35 mL
Ajouter 80 mL
d’éthanol
dans chaque
flacon
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
25
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
7
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoBond® Xtra EF, portez des vêtements de protection
appropriés (par exemple: une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de
protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées
(les FDS sont disponibles en ligne sur www.mn‑net.com/msds).
Les déchets générés par le kit NucleoBond® Xtra EF n’ont pas été testés pour la présence de
matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux
résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement dénaturant et du
traitement à la Protéinase K mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les
déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés
conformément aux réglementations de sécurité locales.
7.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
26
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
8
Purification de l’ADN plasmidique avec le
NucleoBond® Xtra EF
Le paragraphe suivant décrit les protocoles pour la purification de plasmides high copy et
low copy ainsi que la procédure pour concentrer les éluats NucleoBond® Xtra EF avec les
NucleoBond® Finalizers.
8.1
Purification de plasmides High copy (Midi, Maxi)
Midi
1
Maxi
Préparation d’une préculture
Inoculer une préculture de 3 – 5 mL de milieu LB avec une seule colonie prélevée sur
une boîte de culture fraîchement striée. Veiller à ce que la boîte et le milieu de culture
contiennent bien l’antibiotique approprié pour la pression de sélection nécessaire à
la propagation du plasmide d’intérêt (voir paragraphe 5.3 pour plus d’informations).
Agiter à 37 °C et ~ 300 rpm pendant ~ 8 h.
2
!
Préparation d’une culture overnight
Note : Pour utiliser la totalité de la capacité de fixation des colonnes NucleoBond® Xtra
il est important de produire suffisamment d’ADN plasmidique. Si la culture est connue
pour sa faible croissance, ou si le plasmide ne se comporte pas comme un plasmide
high copy, merci de consulter la section 5.6 pour l’utilisation de volumes de culture
plus importants. Si vous n’êtes pas certains du nombre de copies du plasmide et du
comportement de la souche utilisée au niveau croissance bactérienne, augmenter le
volume de culture et décider plus tard, à l’étape 3, combien de cellules devront être
utilisées pour la préparation. Les volumes de culture recommandés pour une culture
sur la nuit suggérés ci-dessous sont calculés pour une DO600 finale d’environ 4 (voir
section 5.5).
Inoculer une culture pendant la nuit en diluant la préculture au 1/1000 dans les
volumes mentionnés de milieu LB contenant également l’antibiotique de sélection
adéquat. Faire pousser la culture toute la nuit à 37 °C et ~ 300 rpm pendant 12 – 16 h.
100 mL
300 mL
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
27
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Midi
3
Maxi
Collecter les bactéries
Mesurer la DO600 de la culture et déterminer le volume de culture recommandé.
V [mL] = 400 / ​DO600
!
V [mL] = 1200 / ​DO600
Récolter les cellules par centrifugation à 4,500 – 6,000 x g pendant ≥ 10 min à 4 °C
et jeter la totalité du surnageant.
Note : Il est particulièrement important de déterminer la masse cellulaire pour les
milieux de croissance riches (par ex. PLASMID+®, CirclegrowTM, Terrific Broth). Les
milieux de croissance riches peuvent contenir de 5 à 10 fois plus de cellules par
mL que les milieux de croissance ordinaires (p. ex. LB). L’utilisation d’un milieu de
croissance riche sans vérifier la quantité de cellules peut facilement entraîner une
surcharge de la colonne et une perte de rendement.
Note : Il est possible d’utiliser des volumes de culture plus importants, par ex. si le
plasmide ne se comporte pas comme un vecteur high copy (voir section 5.6 pour
plus d’informations). Dans ce cas, augmentez les volumes de Tampons RES-EF, LYSEF et NEU-EF proportionnellement aux étapes 4, 5 et 7. Des flacons de tampons
supplémentaires peuvent être nécessaires et commander séparément (voir section
9.2 pour commander le lot de tampons supplémentaires NucleoBond® Xtra Buffer
Set EF). Si le volume de culture est plus du double de celui recommandé, il est
plus judicieux de centrifuger pour clarifier le lysat à l’étape 8 plutôt que d’utiliser les
colonnes filtres inclues avec les colonnes NucleoBond® Xtra.
4
Resuspension (Tampon RES-EF)
Resuspendre complètement le culot bactérien dans le Tampon de resuspension
RES-EF +RNase A en pipetant les cellules plusieurs fois ou en vortexant.
Pour une lyse efficace, il est important qu’aucun agrégat de cellules ne subsiste dans
la suspension.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de Tampon RES-EF si une masse
cellulaire supérieure aux recommandations est utilisée (voir le paragraphe 5.7 pour
des informations sur les conditions optimales de lyse et le paragraphe 5.8 pour les
souches difficiles à lyser).
8 mL
28
12 mL
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
Midi
Maxi
5
Lyse cellulaire (Tampon LYS-EF)
!
Vérifier l’absence de précipité de SDS dans le Tampon LYS-EF avant utilisation.
Si un précipité blanc est visible, réchauffer le tampon pendant plusieurs minutes à
30 – 40 °C jusqu’à sa complète dissolution. Laisser le tampon revenir à température
ambiante avant utilisation.
Ajouter le Tampon LYS-EF à la suspension.
Mélanger doucement en retournant le tube 5 fois. Ne pas vortexer, au risque de
fragmenter et de contaminer la suspension par de l’ADN chromosomique contenu
dans les débris cellulaires.
Incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.
Attention : une exposition prolongée aux conditions alcalines peut dénaturer et
dégrader irréversiblement l’ADN plasmidique et libérer de l’ADN chromosomique
contaminant dans le lysat.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de Tampon LYS-EF si une masse
cellulaire supérieure aux recommandations est utilisée (voir paragraphe 5.7 pour des
informations sur les conditions optimales de lyse).
8 mL
6
12 mL
Equilibration (Tampon EQU-EF)
Equilibrer la colonne NucleoBond®
Xtra avec son filtre avec le Tampon
d’équilibration EQU-EF.
Déposer le tampon sur les bords
supérieurs évasés du filtre comme
indiqué sur le schéma et veiller à
imprégner la totalité du filtre.
Laisser la colonne se vider par gravité. La
colonne ne sèche pas.
15 mL
35 mL
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
29
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
Midi
Maxi
7
Neutralisation (Tampon NEU-EF)
!
Ajouter le Tampon de neutralisation NEU-EF à la suspension et mélanger
immédiatement le lysat en retournant doucement le tube jusqu’à disparition
complète de la coloration bleue ! Ne pas vortexer.
La flasque ou le tube utilisé pour cette étape ne doit pas être rempli à plus de deux
tiers pour permettre un mélange homogène. Veiller à neutraliser la totalité du lysat
pour précipiter toutes les protéines et l’ADN chromosomique. La consistance du
lysat doit passer de visqueuse à une suspension plus fluide, homogène de floculat
blanchâtre. De plus, le réactif LyseControl doit être totalement décoloré sans aucune
trace résiduelle de bleu.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de Tampon NEU-EF si une masse
cellulaire supérieure aux recommandations est utilisée (voir paragraphe 5.7 pour des
informations sur les conditions optimales de lyse).
!
8 mL
12 mL
Incubation du lysat sur la glace
5 min
5 min
8
Clarification et chargement du lysat
!
Veiller à déposer une suspension homogène du précipité en retournant le tube 3
fois avant le chargement sur le filtre NucleoBond® Xtra préalablement équilibré pour
éviter le colmatage du filtre.
Le lysat est simultanément clarifié et chargé sur la résine. Recharger le lysat si un
volume supérieur à la capacité volumique du filtre est à procéder. Permettre à la
colonne de se vider par écoulement gravitaire.
Note : Le lysat est trouble en sortant du filtre. Cette turbidité n’est pas causée par un
passage de précipité à travers le filtre, cela n’entraîne pas de colmatage de la colonne
et indique plutôt que la procédure se passe normalement.
Alternative : le précipité peut être éliminé par centrifugation à ≥ 5,000 x g pendant
au moins 10 min, par exemple si la masse cellulaire utilisée est plus du double de la
quantité recommandée. Si le surnageant contient encore des matières en suspension,
transférer le dans un nouveau tube et répéter la centrifugation, de préférence à vitesse
supérieure ou bien déposer le lysat sur le filtre NucleoBond® Xtra équilibrée.
Cette étape de clarification est extrêmement importante car des résidus de précipité
pourrait induire le colmatage de la colonne NucleoBond® Xtra. Pour charger la
colonne, déposer le lysat clair sur le filtre équilibré ou enlever le filtre inutilisé au
préalable. Laisser la colonne se vider par écoulement gravitaire.
Note : Vous pouvez conserver tout ou partie des filtrats pour des analyses ultérieures
(voir paragraphe 9.1).
30
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
Midi
9
!
Maxi
er
1 lavage : Filtre et colonne (Tampon
FIL-EF)
Laver le filtre NucleoBond® Xtra et la
colonne NucleoBond® Xtra avec le
Tampon de lavage FIL-EF. Laissez la
colonne se vider par gravité.
Déposer le tampon sur les bords
supérieurs évasés du filtre et veiller à
l’imprégner complètement pour que
le lysat contenu dans le filtre s’écoule
dans la colonne. Omettre cette étape ou
déposer le tampon directement au centre
du filtre peut réduire le rendement d’ADN
plasmidique.
5 mL
10
10 mL
Elimination du filtre
Retirer le filtre NucleoBond® Xtra ou
éliminer le en retournant la colonne.
11
!
2ème lavage : Colonne uniquement
(Tampon ENDO-EF)
Laver la colonne NucleoBond® Xtra
avec le Tampon de lavage ENDO-EF.
Il est important d’enlever le filtre avant
de déposer le tampon de lavage pour
optimiser la pureté de l’ADN. Laissez la
colonne se vider par gravité.
35 mL
12
90 mL
3ème lavage : Colonne uniquement
(Tampon WASH-EF)
Laver la colonne NucleoBond® Xtra
avec le Tampon de lavage WASH-EF.
Laissez la colonne se vider par gravité.
15 mL
45 mL
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
31
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
Midi
13
Maxi
Elution (Tampon ELU-EF)
Eluer l’ADN plasmidique avec le Tampon d’élution ELU-EF. Collecter l’éluat dans un
tube à centrifuger 15 mL ou 50 mL (non fourni).
Note : Préchauffer le Tampon ELU-EF à 50 °C avant de procéder à l’élution peut
améliorer le rendement pour les constructions de grande taille comme les BACs.
Optionnel : Déterminer le rendement en ADN plasmidique par spectrophotométrie
UV afin d’ajuster la concentration d’ADN à l’étape 16 et évaluer le rendement de
l’étape de précipitation.
5 mL
!
14
15 mL
NucleoBond® Xtra Midi / ​Maxi Plus EF :
Poursuivre avec l’étape 14 pour le protocole de centrifugation après la précipitation
à l’isopropanol ou continuer avec le paragraphe 8.3 pour la concentration et
le dessalage avec NucleoBond® Finalizer (NucleoBond® Xtra Midi Plus EF) ou
NucleoBond® Finalizer Large (NucleoBond® Xtra Maxi Plus EF).
Précipitation
Note : Il est recommandé de déterminer le rendement en ADN plasmidique en
mesurant l’A260 avant de précipiter l’ADN (voir section 5.13). Ceci permet par la suite
de choisir le meilleur volume de dissolution de l’ADN après la précipitation.
Ajouter l’isopropanol à température ambiante pour précipiter l’ADN plasmidique
élué.
Vortexer efficacement !
Centrifuger à ≥ 4,500 x g pendant ≥ 15 min à ≤ température ambiante, de
préférence à 15,000 x g pendant 30 min et à 4 °C. Jeter précautionneusement le
surnageant.
3.5 mL
15
10.5 mL
Lavage et séchage du culot d’ADN (EtOH 70 % endotoxine-free)
Ajouter de l’éthanol 70 % endotoxine-free sur le culot.
2 mL
5 mL
Centrifuger à ≥ 4,500 x g, de préférence ≥ 15,000 x g pendant 5 min à température
ambiante.
Eliminer complètement l’éthanol avec un cône. Laisser sécher le culot à l’air libre à
température ambiante.
Note : L’ADN plasmidique peut être difficile à solubiliser en cas de séchage excessif.
10 – 15 min
32
15 – 30 min
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
Midi
16
Maxi
Solubilisation de l’ADN (Tampon TE-EF ou H2O-EF)
Dissoudre le culot d’ADN dans le volume adéquat de Tampon TE-EF ou d’H2O-EF.
Selon le type de tube à centrifuger utilisé, dissoudre en pipetant de manière répéter
ou en faisant tourner le tube pendant 10 – 60 min (agitateur 3D) contenant un volume
suffisant de tampon.
Déterminer le rendement d’ADN plasmidique par spectrophotométrie UV. Vérifier
l’intégrité de l’ADN plasmidique par électrophorèse sur gel d’agarose (voir paragraphe
5.13).
8.2
Purification de plasmides Low copy (Midi, Maxi)
Les volumes de tampons de lyse fournis dans le kit sont calculés pour la purification de
plasmides high copy. Par conséquent, des tampons supplémentaires doivent être commandés
séparément en cas de purifications répétées de plasmides low copy (voir ’Informations de
commande’).
Midi
1
Maxi
Préparation d’une préculture
Inoculer une préculture de 3 – 5 mL de milieu LB avec une seule colonie prélevée sur
une boîte de culture fraîchement striée. Veiller à ce que la boîte et le milieu de culture
contiennent bien l’antibiotique approprié pour la pression de sélection nécessaire à la
propagation du plasmide d’intérêt (voir paragraphe 4.3 pour plus d’informations). Agiter
à 37 °C et ~ 300 rpm pendant ~ 8 h.
2
Préparation d’une culture overnight
!
Note : Pour utiliser la capacité de liaison des colonnes NucleoBond® Xtra, il est important
de fournir suffisamment d’ADN plasmidique. Pour la procédure standard low copy, les
volumes de culture ont été doublés par rapport au protocole high copy. Cependant, en
raison d’un contenu plasmidique 10 à 100 fois inférieur, cela peut s’avérer insuffisant.
Si vous avez besoin de grandes quantités de plasmides avec un faible nombre de
copies, augmenter le volume de culture d’un facteur 3 à 5 et déterminer à l’étape 3 de
la quantité de cellules à utiliser pour l’extraction. Les volumes de culture recommandés
ci-dessous sont calculés pour une OD600 finale d’environ 4 (voir paragraphe 5.6 pour
plus d’informations).
Inoculer une culture overnight en diluant la préculture au 1/1000 dans les volumes
mentionnés de milieu LB contenant également l’antibiotique de sélection adéquat. Faire
pousser la culture pendant une nuit à 37 °C et ~ 300 rpm pendant 12 – 16 h.
200 mL
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
600 mL
33
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
Midi
3
Maxi
Récolter des bactéries
Mesurer la DO600 nm de la culture bactérienne et déterminer le volume de culture
recommandé.
V [mL] = 800 / ​DO600
V [mL] = 2400 / ​DO600
Récolter les cellules par centrifugation à 4,500 – 6,000 x g pendant ≥ 10 min à 4 °C et
jeter la totalité du surnageant.
Note : Il est particulièrement important de déterminer la masse cellulaire pour les milieux
de croissance riches (par ex. PLASMID+®, CirclegrowTM, Terrific Broth). Les milieux
de croissance riches peuvent contenir 5 à 10 fois fois plus de cellules par mL que les
milieux de croissance ordinaires (par ex. LB). L’utilisation de milieux de croissance riches
sans vérifier les quantités de cellules peut facilement conduire à une surcharge de la
colonne et à une perte de rendement.
Note : Il est possible d’utiliser des volumes de culture supérieurs, par exemple afin
d’obtenir un rendement plus élevé de plasmides low copy (voir paragraphe 5.6 pour
plus d’informations). Dans ce cas, augmenter proportionnellement les volumes de
tampons RES-EF, LYS-EF et NEU-EF aux étapes 4, 5 et 7. Des tampons de lyse
complémentaires peuvent être commandés séparément (voir ’Informations de
commande’ pour le set de tampons NucleoBond® Xtra Buffer Set I, au paragraphe
9.2). Utiliser la centrifugation pour la clarification plutôt que les filtres NucleoBond® Xtra.
4
Resuspension (Tampon RES-EF)
Resuspendre complétement le culot cellulaire dans le Tampon de resuspension RESEF +RNase A en pipetant les cellules de manière répétée ou en vortexant.
Pour une lyse efficace, il est important qu’aucun agrégat de bactéries ne subsiste dans
la suspension.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de Tampon RES-EF si une masse
cellulaire supérieure aux recommandations est utilisée (voir paragraphe 5.7 pour des
informations sur les conditions optimales de lyse et le paragraphe 5.8 concernant les
souches difficiles à lyser).
16 mL
24 mL
5
Lyse cellulaire (Tampon LYS-EF)
!
Vérifier l’absence de précipité de SDS dans le Tampon LYS-EF avant utilisation. Si
un précipité blanc est visible, réchauffer le Tampon LYS-EF pendant plusieurs minutes
à 30 – 40 °C jusqu’à sa complète dissolution. Laisser le tampon revenir à température
ambiante avant utilisation.
Ajouter le Tampon LYS-EF à la suspension.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de Tampon LYS-EF si une masse
cellulaire supérieure aux recommandations est utilisée (voir paragraphe 5.7 pour des
informations sur les conditions optimales de lyse).
16 mL
34
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
24 mL
NucleoBond® Xtra Midi EF / Maxi EF
Midi
Maxi
Mélanger doucement en retournant le tube 5 fois. Ne pas vortexer, ceci induirait une
fragmentation et un relarguage de l’ADN chromosomique depuis les débris cellulaires
qui contaminerait la suspension.
Incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.
Attention : une exposition prolongée aux conditions alcalines peut dénaturer et dégrader
irréversiblement l’ADN plasmidique et libérer de l’ADN chromosomique contaminant
dans le lysat.
6
Equilibration (Tampon EQU-EF)
Equilibrer la colonne NucleoBond®
Xtra et son filtre avec le Tampon
d’équilibration EQU-EF.
Déposer le tampon sur les bords
supérieurs évasés du filtre comme
indiquer sur le schéma et veiller à
imprégner la totalité du filtre.
Laisser la colonne se vider par gravité.
La colonne ne sèche pas.
15 mL
35 mL
7
Neutralisation (Tampon NEU-EF)
!
Ajouter le Tampon de neutralisation NEU-EF à la suspension et mélanger
immédiatement le lysat en retournant doucement le tube jusqu’à disparition complète
de la coloration bleue ! Ne pas vortexer.
La flasque ou le tube utilisé pour cette étape ne doit être rempli à plus de deux tiers pour
permettre un mélange homogène. Veiller à neutraliser la totalité du lysat pour précipiter
toutes les protéines et l’ADN chromosomique. La consistance du lysat doit passer de
visqueuse à une suspension plus fluide, homogène de floculat blanchâtre. De plus, le
réactif LyseControl doit être totalement décoloré sans aucune trace résiduelle de bleu.
Note : Augmenter proportionnellement le volume de Tampon NEU-EF si la masse
cellulaire utilisée est supérieure aux recommandations du protocole standard (voir
paragraphe 5.7 pour des informations sur les conditions optimales de lyse).
!
16 mL
24 mL
Incubation du lysat sur la glace.
5 min
5 min
Poursuivre avec l’étape 8 du protocole standard pour la purification des plasmides high
copy (paragraphe 8.1) si les volumes de tampons de lyse n’ont pas été significativement
augmentés.
Autrement, il est préférable de centrifuger d’abord le précipité afin d’éviter le colmatage
du filtre NucleoBond® Xtra.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
35
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
8.3
Concentration des éluats NucleoBond® Xtra EF avec les
NucleoBond® Finalizers
Note : L’utilisation des NucleoBond® Finalizers est recommandée uniquement pour les
vecteurs de taille inférieure à 50 kpb.
Midi – NucleoBond®
Finalizer
1
Maxi – NucleoBond®
Finalizer Large
Précipitation
Note : Vérifier par spectrophotométrie la concentration de l’ADN dans les éluats avant
la précipitation. Ceci permet de choisir ensuite le volume d’élution le plus approprié à
l’étape 5 et permet d’évaluer le rendement de l’étape de concentration.
Ajouter 0,7 volumes d’isopropanol à température ambiante (non fourni). Vortexer
efficacement et laisser le mélange incuber pendant 2 minutes.
(Exemple : pour 5 mL d’éluat NucleoBond® Xtra Midi ajouter 3.5 mL d’isopropanol,
pour 15 mL d’éluat NucleoBond® Xtra Maxi, ajouter 10.5 mL d’isopropanol)
3.5 mL pour
5 mL d’éluat
2
10.5 mL pour
15 mL d’éluat
Chargement du filtre seringue
Enlever le piston d’une seringue 30 mL et connecter un NucleoBond® Finalizer en
sortie. Déposer le mélange de précipitation dans la seringue, insérer le piston, maintenir
en position verticale et presser le mélange doucement à travers le NucleoBond®
Finalizer (le mélange doit traverser le NucleoBond® Finalizer au goutte à goutte). Jeter
le filtrat.
3
Lavage (EtOH 70 % endotoxine-free)
Déconnecter le NucleoBond® Finalizer de la seringue, retirer le piston et reconnecter le
NucleoBond® Finalizer.
Déposer l’éthanol 70 % endotoxine-free (non fourni) dans la seringue, insérer le
piston, maintenir la seringue en position verticale et presser doucement l’éthanol à
travers le NucleoBond® Finalizer. Jeter le filtrat.
2 mL
36
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
4 mL
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Midi – NucleoBond®
Finalizer
4
Maxi – NucleoBond®
Finalizer Large
Séchage
Déconnecter le NucleoBond® Finalizer de la seringue, retirer le piston et reconnecter le
NucleoBond® Finalizer. Presser l’air à travers le NucleoBond® Finalizer aussi fortement
que possible tout en touchant un papier absorbant avec l’embout du NucleoBond®
Finalizer pour absorber l’éthanol.
Répéter cette étape le nombre de fois mentionnées ci-dessous jusqu’à ce que plus
d’éthanol ne sorte plus du NucleoBond® Finalizer.
Note : Une nouvelle seringue peut être utilisée pour accélérer la procédure de séchage
(non incluse).
≥ 6 fois, jusqu’au séchage total
≥ 6 fois, jusqu’au séchage total
Optionnel : vous pouvez incuber le NucleoBond® Finalizer pendant 10 minutes à 80 °C
pour minimiser la contamination en éthanol. Cependant, le rendement final peut s’avérer
négativement impacté par un séchage excessif de l’ADN.
5
Elution (Tampon TE-EF ou H2O-EF)
Enlever le NucleoBond® Finalizer de la seringue 30 mL, retirer le piston d’une seringue
1 mL et y connecter le NucleoBond® Finalizer.
Note : Voir le paragraphe 5.12, Tableau 4 (Midi) ou Tableau 5 (Maxi) pour déterminer le
volume de tampon d’élution le plus approprié.
Déposer le volume adéquat de Tampon de dissolution TE-EF ou H2O-EF dans la
seringue (voir paragraphe 5.12). Ne pas utiliser d’eau purifier à moins que son pH soit
au-delà de pH 7.0. Placer la sortie du NucleoBond® Finalizer verticalement au-dessus
d’un tube neuf (non fourni) éluer l’ADN plasmidique très doucement, goutte après
goutte, en insérant le piston.
200 – 800 µL
!
400 – 1000 µL
®
Déconnecter le NucleoBond Finalizer de la seringue, retirer le piston et reconnecter le
NucleoBond® Finalizer.
Transférer le premier éluat dans la seringue et éluer une seconde fois dans le
même tube collecteur.
Déposer la totalité
du premier éluat
Déposer la totalité
du premier éluat
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
37
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Midi – NucleoBond®
Finalizer
Maxi – NucleoBond®
Finalizer Large
En cas de rendement attendu très élevé (> 400 µg pour NucleoBond® Xtra Midi EF ;
> 1000 µg pour NucleoBond® Xtra Maxi EF), le rendement final peut être amélioré par
une troisième élution.
Déconnecter le NucleoBond® Finalizer de la seringue, retirer le piston pour aspirer de
l’air, reconnecter le NucleoBond® Finalizer et presser de l’air pour forcer le maximum
d’éluat à sortir du filtre.
Déterminer le rendement d’ADN plasmidique par spectrophotométrie UV et confirmer
l’intégrité de l’ADN plasmidique par électrophorèse sur gel d’agarose (voir paragraphe
5.13).
38
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
9
Annexes
9.1
Guide de résolution des problèmes
Si vous rencontrez des problèmes de rendement ou de pureté de l’ADN plasmidique obtenu, il
est recommandé de vérifier quelle étape de la procédure peut être en cause.
Premièrement, vérifier la croissance de la culture bactérienne (DO600) et la présence d’un
antibiotique approprié (Tableau 1, paragraphe 5.3). Deuxièmement, des aliquotes de lysat
clarifié, de filtrat, des lavages (Tampon FIL-EF, ENDO-EF et WASH-EF) et des éluats peuvent
être conservés pour une analyse ultérieure par électrophorèse sur gel d’agarose.
Voir le Tableau 6 pour connaître les volumes à prélever pour chaque fraction, de manière à
obtenir environ 5 µg d’ADN plasmidique, en considérant que 250 et 1000 µg d’ADN ont été
déposés respectivement sur une colonne NucleoBond® Xtra Midi ou Maxi. Précipiter les
acides nucléiques en ajoutant 0,7 volumes d’isopropanol, centrifuger, laver le culot à l’éthanol
70 %, centrifuger à nouveau, éliminer le surnageant, sécher à l’air pendant 10 minutes,
dissoudre l’ADN dans 100 µL de Tampon TE (pH 8.0) et déposer 20 µL sur un gel d’agarose
à 1 %.
Tableau 6: Volumes des fractions NucleoBond® Xtra EF à conserver pour analyse
Volume nécessaire [µL]
Echantillon
Etape de la purification
Midi
Maxi
I
Lysat clarifié
(issu de l’étape 8)
500
200
II
Filtrat
(après l’étape 8)
500
200
III
Filtrat des lavages
(après les étapes 9, 11 et 12)
500
400
IV
Eluat
(après l’étape 13)
100
100
Les exemples de gel (Figure 6) vous aideront à cibler votre problématique et à répondre aux
questions du paragraphe suivant plus rapidement et efficacement.
Ce gel est un exemple montrant les bandes dominantes d’ADN plasmidique qui ne doivent être
présentes que dans l’éluat final et le lysat clarifié, prouvant la production de plasmides dans
votre culture (ligne 1). Cependant, de l’ADN plasmidique retrouvé dans la fraction de filtrat issue
des lavages signifierait un problème d’utilisation du mauvais tampon ou d’un tampon altéré
(exemple : problème de pH, composants précipités, évaporation de liquide lié à un mauvais
stockage).
L’ARN peut être visualisé sous forme de bande diffuse en bas du gel dans les fractions de
lysat et de filtrat obtenu à l’issue de l’étape de fixation de l’ADN (lignes 1 et 2). Il peut aussi se
retrouver dans la fraction correspondant aux lavages mais il doit être absent de l’éluat final.
L’ADN génomique ne devrait pas être visible. Dans le cas contraire, il apparaîtrait dans les puits
du gel ou juste en dessous et serait symptomatique de conditions de lyse trop drastiques.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
39
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
M
1
2
3
4
5
M:
Marqueur λ HindIII
1: I, lysat clarifié, structures
ccc, linéaire et oc de l’ADN
plasmidique, ARN dégradé
2: II, filtrat issu de l’étape de fixation,
pas d’ADN plasmidique mais de
l’ARN dégradé
3:III, filtrat des lavages, pas d’ADN
plasmidique ni d’ARN résiduel
4:
IV, éluat, ADN plasmidique pur
5: Restriction EcoRI, forme linéarisée
du plasmide
Figure 6 Exemple de contrôle analytique des différentes fractions issues de la procédure
NucleoBond® Xtra Midi
Plasmide: pUC18, souche bactérienne: E. coli DH5α®. Après précipitation, 20 µL de
chaque fraction ont été analysés sur gel d’agarose à 1 %. Des quantités équivalentes
d’ADN plasmidique sont visibles avant (ligne 1) et après la purification avec NucleoBond®
Xtra Midi (ligne 4), démontrant un rendement > 90 %.
40
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Problème
Causes possibles et suggestions
Pas d’amplification du plasmide
•
Vérifier le contenu en plasmide du lysat clarifié (voir Figure 6). Utiliser
des colonies fraîches pour inoculer le milieu et ajouter un antibiotique
de sélection frais sur les boîtes et milieux de culture.
•
Estimer le contenu en plasmide avant d’effectuer la purification d’une
culture overnight au moyen de minipreps rapides avec par exemple le
kit NucleoSpin® Plasmid ou NucleoSpin® Plasmid EasyPure.
Lyse alcaline inefficace
Rendement
faible ou nul
•
Quantité de masse cellulaire excessive. Voir les paragraphes 5.5 – 5.7
à propos des volumes de culture et de réactifs de lyse recommandés.
Vérifier la quantité de plasmides présents dans le lysat clarifié (voir
Figure 6).
•
Vérifier l’absence de précipité de SDS dans le Tampon LYS-EF avant
utilisation, en particulier en cas de stockage en deçà de 20 °C.
Si nécessaire, incuber le flacon plusieurs minutes à 30 – 40 °C et
mélanger bien jusqu’à complète dissolution du SDS.
Présence de SDS ou autres précipités dans l’échantillon
•
Déposer le lysat sur le filtre NucleoBond® Xtra inséré dans la colonne
NucleoBond® Xtra. Cette filtration permet d’éliminer totalement les
précipités de SDS. L’incubation des lysats clarifiés pendant une
période plus longue peut induire la formation de nouveaux précipités.
Si des précipités sont visibles, il est recommandé de filtrer et
centrifuger de nouveau le lysat avant de le déposer sur la colonne
NucleoBond® Xtra.
Échantillon / ​lysat trop visqueux
•
Masse cellulaire utilisée excessive. Voir les paragraphes 5.5 – 5.7 à
propos des volumes de culture et de réactifs de lyse recommandés.
•
Veiller à mélanger efficacement après la neutralisation pour précipiter
totalement le SDS et l’ADN chromosomique. Sinon, l’efficacité de la
filtration et le débit d’écoulement diminueront, ainsi que le rendement
car le SDS empêche l’ADN de se fixer sur la colonne.
pH ou concentration en sel des tampons trop élevés
•
Vérifier le contenu en ADN plasmidique dans les fractions de lavage
(voir Figure 6). Conserver tous les flacons bien clos. Vérifier et ajuster
le pH des Tampons FIL-EF (pH6.5), EQU-EF (pH 6.5), ENDO-EF (6.5)
et WASH-EF (pH 7.0) et ajuster avec HCl ou NaOH si nécessaire.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
41
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Problème
Causes possibles et suggestions
Volume de culture trop élevé
•
Filtre
NucleoBond®
Xtra colmaté
au cours de la
filtration
Voir les paragraphe 5.5 – 5.7 à propos des volumes de culture et de
l’utilisation de grands volumes de tampon de lyse.
Précipité insuffisamment resuspendu avant l’étape de fixation de l’ADN.
•
Retourner le tube contenant le lysat au moins 3 fois avant de le
déposer dans le filtre.
Précipitation incomplète
•
Veiller à bien mélanger après la neutralisation pour précipiter la totalité
du SDS et de l’ADN chromosomique.
Echantillon trop visqueux
Colonne
NucleoBond®
Xtra colmatée
ou écoulement
très lent
•
Ne PAS tenter de purifier un lysat préparé à partir d’un volume de
culture supérieur au volume recommandé pour chaque taille de
colonne avec les volumes de tampons de lyse standards. Une lyse
incomplète peut non seulement colmater les colonnes, mais aussi
induire des rendements significativement réduits. Voir les paragraphes
5.5 et 5.6 pour des recommandations à propos des volumes de
culture et le paragraphe 5.7 pour l’ajustement des volumes de
tampons de lyse.
•
Veiller à bien mélanger après la neutralisation pour précipiter la totalité
du SDS et de l’ADN chromosomique.
Clarification incomplète du lysat
•
Utiliser le filtre NucleoBond® Xtra ou centrifuger à plus haute vitesse
ou pendant plus longtemps.
•
Précipité formé pendant le stockage. Clarifier de nouveau le lysat
avant le dépôt sur la colonne.
Lyse trop drastique
•
Contamination
par de l’ADN
génomique
42
Veiller à ne pas prolonger la lyse avec le Tampon LYS-EF au-delà de
5 min.
Lysat mélangé trop violemment ou vortexé après la lyse
•
Retourner le tube seulement 5 fois. Ne pas vortexer après ajout du
Tampon LYS-EF.
•
Utiliser des tubes de plus grand volume ou réduire le volume de
culture afin de permettre un mélange plus efficace et aisé.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Problème
Causes possibles et suggestions
Inefficacité de la digestion par la RNase
•
La RNase n’a pas été ajoutée dans le Tampon RES-EF ou le tampon
a été mal conservé. Ajouter à nouveau de la RNase A dans le Tampon
RES-EF. Voir le paragraphe 9.2 pour les ’informations de commande’
pH ou concentration en sel trop faible du tampon de lavage
Contamination
de l’ADN
plasmidique
par l’ARN
•
Vérifier la présence d’ARN dans les fractions de lavage (voir Figure 6).
Conserver tous les flacons bien clos. Vérifier le pH des Tampons FILEF (pH6.5), EQU-EF (pH 6.5), ENDO-EF (6.5) et WASH-EF (pH 7.0) et
ajuster avec HCl ou NaOH si nécessaire.
•
Augmenter la stringence du Tampon de lavage WASH-EF en ajustant
son pH à 7.5.
Etape de lavage avec le Tampon WASH-EF insuffisante
•
Doubler ou tripler le lavage avec le Tampon WASH-EF. Le Tampon
WASH_EF est disponible séparément (voir ’Informations de
commande’).
Le filtre NucleoBond® Xtra n’a pas été éliminé avant le second lavage
•
Pureté faible
(A260/A280
< 1.8)
Le contenu en protéines est trop élevé en raison de l’inefficacité du
lavage. Enlever le filtre NucleoBond® Xtra avant d’effectuer le second
lavage avec le Tampon ENDO-EF.
Le Tampon ENDO-EF ou WASH-EF a été utilisé à la place du Tampon FILEF pour le premier lavage
•
Le Tampon FIL-EF doit être utilisé pour laver le filtre NucleoBond® Xtra
pour éviter le relarguage de SDS.
Quantité minime d’ADN chargée sur la colonne
•
Un excès de sites de fixation libres nécessite des lavages plus
importants -doubler l’étape de lavage avec le Tampon ENDO-EF.
•
Réduire le temps de lyse à < 5 min.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
43
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Problème
Causes possibles et suggestions
Perte du culot
•
Absence de
culot d’acides
nucléiques
après la
précipitation
Manipuler le précipité avec soin. Décanter la solution
précautionneusement. Déterminer le rendement dans le Tampon ELUEF afin de déterminer la quantité d’ADN plasmidique attendue après
la précipitation.
L’ADN Plasmidique est étalé sur les parois du tube
•
Dissoudre l’ADN dans un volume suffisant de tampon en faisant
tourner le tube sur lui-même pendant au moins 30 min.
Problème de précipitation des acides nucléiques
•
Vérifier la nature et le volume de solvant utilisé. Veiller à utiliser au
moins 0.7 volume d’isopropanol et mélanger efficacement.
•
Centrifuger à une vitesse supérieure et pendant plus longtemps.
Co-précipitation de sel
Culot d’acides
nucléiques
opaque ou
blanc plutôt
que clair et
vitreux
•
Vérifier la pureté de l’isopropanol et effectuer la précipitation à
température ambiante mais centrifuger à 4 °C. Ne laisser pas l’éluat
tomber directement de la colonne dans l’isopropanol mais ajouter le à
l’éluat et mélanger immédiatement.
•
Essayer de resuspendre le culot dans le Tampon ENDO-EF et
recharger la même colonne NucleoBond® Xtra. Laver la colonne
plusieurs fois avec le Tampon WASH-EF avant de charger.
Séchage excessif du culot
•
Le culot
d’acides
nucléiques ne
se resuspend
pas dans le
tampon
44
Essayer de le dissoudre à température supérieure pendant plus
longtemps (ex: 2 h à 37 °C ou une nuit TA), de préférence sous
agitation constante (agitateur 3 D).
Co-précipitation de sels ou résidus d’alcool
•
Laver de nouveau le culot avec de l’éthanol 70 % ou augmenter le
volume de tampon de dissolution.
Particules insolubles dans l’ADN dissout
•
Centrifuger la solution d’ADN pour culotter les particules insolubles
et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Les particules
insolubles n’affectent pas la qualité de l’ADN. Sinon les particules
insolubles peuvent facilement être éliminées avec les NucleoBond®
Finalizer (NucleoBond® Xtra Midi EF) ou les NucleoBond® Finalizer
Large (NucleoBond® Xtra Maxi EF).
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Problème
Causes possibles et suggestions
Rendement déjà faible dans la fraction éluée de la colonne NucleoBond®
Xtra
•
Voir le chapitre ’Guide de résolution des problèmes’ “rendement faible
ou nul”.
Volume mort trop important
•
Si la concentration d’ADN plasmidique est la priorité, l’élution peut
devoir être effectuée dans un petit volume. Naturellement, une
partie de l’éluat est perdue dans la seringue et le filtre seringue
NucleoBond® Finalizer. Pour minimiser ces pertes lors de la
seconde élution, essayer de récupérer la moindre goutte sortant du
NucleoBond® Finalizer, par exemple en tapotant le NucleoBond®
Finalizer et la seringue sur la paillasse. Ensuite, remplir la seringue
d’air et presser fortement pour expulser les gouttelettes résiduelles
du NucleoBond® Finalizer. Répéter plusieurs fois cette étape. Cette
procédure peut demander un certain entrainement. Le volume mort
considéré comme acceptable pour les NucleoBond® Finalizer est de
30 µL et de 60 µL pour les NucleoBond® Finalizer Large.
Volume d’élution trop faible
Rendement
faible ou
nul après
utilisation du
NucleoBond®
Finalizer
•
Comme les volumes morts sont de l’ordre de 30 µL (NucleoBond®
Finalizer) et 60 µL (NucleoBond® Finalizer Large), les volumes
d’élution minimaux sont de l’ordre de 200 µL (NucleoBond® Finalizer)
et 400 µL (NucleoBond® Finalizer Large). Par ailleurs, des volumes
inférieurs sont insuffisant pour imprégner la totalité de la membrane
et induisent une perte de rendement significative. Voir le paragraphe
5.12, Tableau 4 et Tableau 5 pour estimer le rendement attendu en
fonction du volume de tampon d’élution utilisé.
Elution trop rapide
•
L’ADN plasmidique nécessite un certain temps pour se dissoudre.
Eluer très doucement, au goutte à goutte. Répéter l’étape d’élution en
redéposant le premier éluat.
Omission de la seconde élution
•
Répéter la procédure d’élution une fois avec le premier éluat est
crucial pour des rendements optimaux. Eluer une troisième fois ne
présente pas d’avantage.
Taille des plasmides
•
L’efficacité de précipitation est quasiment indépendante de la taille
des plasmides, mais l’élution à partir des NucleoBond® Finalizers est
d’autant plus difficile que les vecteurs sont de grande taille. Si vous
vous confrontez à de faibles rendements avec des constructions
de grande taille comme des cosmides, essayer de chauffer le
NucleoBond® Finalizer, les seringues et le tampon d’élution à 70 °C.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
45
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Problème
Causes possibles et suggestions
Faible rendement global
•
Voir le chapitre ’Guide de résolution des problèmes “Rendement
d’ADN plasmidique faible ou nul” et réduire le volume de tampon
d’élution. Voir le paragraphe 5.12, Tableau 4 et Tableau 5 pour
estimer les concentrations d’ADN attendues.
Tampon d’élution frais utilisé pour la seconde étape d’élution
•
La seconde étape d’élution est cruciale pour optimiser la
concentration d’ADN, mais doit s’effectuer avec l’éluat issue de la
première étape d’élution.
Temps de dissolution trop court
•
Faible
concentration
d’ADN après
utilisation du
NucleoBond®
Finalizer
Selon la quantité totale de plasmide précipité, le temps de remise
complète en suspension peut prendre un certain temps. Ce temps de
remise en suspension pour une récupération optimale peut s’avérer
trop court, si le tampon de dissolution est passé trop rapidement sur
la membrane du Finalizer. Si une récupération élevée est nécessaire,
il est recommandé d’incuber le plasmide précipité avec le tampon de
dissolution durant l’étape d’élution.
Par conséquent, éviter de faire passer le tampon d’élution à travers
le Finalizer en une seule fois, et privilégier une incubation du tampon
de dissolution de 5 min à température ambiante sur la membrane
dès l’apparition de la première goutte et avant de terminer l’étape
d’élution.
Rechargez l’éluat sur le Finalizer et répétez la procédure au moins une
fois. Les recommandations générales doivent être appliquées : faire
passer lentement le tampon de dissolution à travers la membrane,
augmenter le volume d’élution pour obtenir une récupération plus
élevée et minimiser le volume mort en faisant passer de l’air à travers
le Finalizer.
Quantité d’ADN chargée insuffisante
•
46
Etant donné le volume minimal d’élution de 200 µL (NucleoBond®
Finalizer) ou 400 µL (NucleoBond® Finalizer Large) lié au format de
la membrane et à la nécessité d’imprégner la totalité de celle-ci, une
quantité minimale d’ADN déposée est nécessaire pour obtenir la
concentration souhaitée. Si possible, combiner plusieurs précipités
sur le même filtre, le rendement d’élution et la concentration de l’ADN
augmentant significativement avec la quantité d’ADN déposée.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
Problème
Causes possibles et suggestions
ADN plasmidique contaminé avec de l’ADN chromosomique ou de l’ARN
•
Voir les conseils ci-dessus.
ADN plasmidique contaminé avec de l’éthanol
•
L’ADN
plasmidique
n’est pas
performant
dans les
applications
ultérieures
L’ADN plasmidique n’a pas été séché complètement avant
dissolution. Précipiter à nouveau l’ADN avec 1 / 10ième volume
de NaAc 3M, pH 5.0 et 0.7 volumes d’isopropanol. Effectuer la
procédure de précipitation indiquée dans ce manuel et sécher le culot
d’ADN totalement.
ADN dégradé
•
Veiller à ce que tout l’équipement du laboratoire (pipettes,
centrifugeuse, tubes, etc.) soit propre et exempt de nucléases.
•
Ne pas lyser l’échantillon dans le Tampon LYS-EF pendant plus de
5 minutes.
L’ADN est irréversiblement dénaturé
•
Un plasmide dénaturé peut être visualiser par une bande migrant sur
le gel d’agarose légèrement plus vite que la forme surenroulée. Ne
pas prolongée la lyse au-delà de 5 minutes avant ajout du Tampon
NEU-EF.
Taux d’endotoxines trop élevé
•
Voir la section détaillée ci-dessous.
Trop de cellules utilisées
•
Diminuer la masse de cellules ou mieux, augmenter les volumes de
tampons de lyse.
Elimination inefficace des endotoxines
•
Taux
d’endotoxines
trop élevé
Utilisez tous les Tampons de lavage dans l’ordre indiqué : FIL-EF,
ENDO-EF, WASH-EF.
Contamination de l’ADN après la purification
•
Utiliser uniquement des plastiques pyrogène-free ou endotoxine-free
de même que les cônes. Les endotoxines ont tendance à adhérer au
contenant en verre et sont difficiles à éliminer. Si des contenants en
verre sont utilisés, chauffer les toute la nuit à 180 °C pour détruire les
endotoxines. L’autoclavage ne détruit pas les endotoxines et n’est
pas recommandé si l’autoclave est aussi utilisé pour l’inactivation des
cultures bactériennes.
•
Utiliser uniquement les tampons testés endotoxine-free inclus dans
les kits, particulièrement pour la préparation de l’éthanol 70 % et la
reconstitution de l’ADN.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
47
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
9.2
Informations de commande
Produit
Référence MN
Conditionnement
NucleoBond Xtra Midi EF
740420.10 / .50
10 / 50
NucleoBond® Xtra Midi Plus EF
(NucleoBond® Finalizers inclus)
740422.10 / .50
10 / 50
NucleoBond® Xtra Maxi EF
740424.10 / .50
10 / 50
®
NucleoBond Xtra Maxi Plus EF
(NucleoBond® Finalizers Large inclus)
740426.10 / .50
10 / 50
Support NucleoBond® Xtra Combi
740415
1
Support NucleoBond Xtra Smart
740413
1
NucleoBond® Xtra EF Buffer Set I
740427
1
740392.1000
1000 mL
740519.20
20 filtres
2 jeux de seringues
740520.20
20 filtres
20 jeux de seringues
740418.20
20 filtres ’Large’
2 jeux de seringues
740419.20
20 filtres ’Large’
20 jeux de seringues
740505.50
740505
50 mg
100 mg
®
®
(Tampons RES -EF, LYS-EF, NEU-EF, RNase
A)
Tampon WASH-EF
®
NucleoBond Finalizer
®
(pour les kits NucleoBond Xtra Midi, Midi EF,
NucleoBond® PC 100, PC 500, PC 500 EF)
NucleoBond® Finalizer Plus
®
(pour les kits NucleoBond Xtra Midi, Midi EF,
NucleoBond® PC 100, PC 500, PC 500 EF)
NucleoBond® Finalizer Large
®
(pour les kits NucleoBond Xtra Maxi, Maxi
EF, NucleoBond® PC 2000, PC 2000 EF)
NucleoBond® Finalizer Large Plus
(pour les kits NucleoBond® Xtra Maxi, Maxi
EF, NucleoBond® PC 2000, PC 2000 EF)
RNase A (lyophilisée)
Visitez www.mn‑net.com pour plus d’informations concernant nos produits.
48
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
Purification de l’ADN plasmidique endotoxine-free
9.3
Restrictions d’utilisation / garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
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font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
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Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
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NucleoSpin® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG.
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fonctionnement.
MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 13
49
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