Macherey-Nagel NucleoSpin Dx Blood, CE certified Mini kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Bioanalysis
Mode
d’emploi
User manual
ADN génomique sanguin
n NucleoSpin® Dx Blood
Dispositif médical de diagnostic in vitro
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
52355 Düren, Allemagne, Tél. : +49 24 21 969-0
Avril 2022/ Rév. 05
www.mn-net.com
www.mn-net.com
740899.50,
740899.250
50 / 250 prép.
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ADN génomique sanguin
Table des matières
1 Détail des composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, consommables et matériel à fournir par l’utilisateur
5
1.3 À propos de ce mode d’emploi
6
2 Description du produit
7
2.1 Usage prévu
7
2.2 Limites d’utilisation du produit
7
2.3 Contrôle qualité
7
2.4 Présentation du kit et de ses spécifications
8
2.5 Performances analytiques
9
2.6 Procédures d’élution
10
3 Conditions de conservation et préparation des solutions de travail
11
4 Consignes de sécurité
12
4.1 Élimination
12
®
5 Purification d’ADN génomique avec le kit NucleoSpin Dx Blood
13
5.1 Mode opératoire résumé
14
5.2 Mode opératoire détaillé
15
6 Annexe
17
6.1 Guide de résolution des problèmes
17
6.2 Exigence de notification
19
6.3 Bibliographie générale
19
6.4 Références
19
6.5 Explication des pictogrammes
19
6.6 Limites d’utilisation du produit et garantie
20
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
3
ADN génomique sanguin
1
Détail des composants
1.1
Contenu du kit
NucleoSpin® Dx Blood
RÉF
50 préparations
740899.50
250 préparations
740899.250
Buffer B3
BUF B3
15 mL
60 mL
Wash Buffer BW
BUF BW
30 mL
150 mL
Wash Buffer B5
(Concentrate)*
BUF B5 conc.
12 mL
50 mL
Elution Buffer BE**
BUF BE
13 mL
60 mL
Proteinase Buffer PB
BUF PB
1,8 mL
8 mL
Proteinase K
30 mg
2 × 75 mg
NucleoSpin® Dx Blood
Columns (red rings -plus
Collection Tubes)
Dx Blood Columns
50
250
Collection Tubes (2 mL)
Collection Tubes
3 × 50
3 × 250
Lysis Tubes (1.5 mL)
Lysis Tubes
50
5 × 50
Elution Tubes (1.5 mL)
Elution Tubes
50
5 × 50
1
1
Proteinase K
(lyophilized)*
User manual
* Pour la préparation des solutions de travail et les conditions de stockage, consultez le paragraphe 3.
** Composition du tampon d’élution BE : 5 mM Tris/HCl, pH 8,5
4
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
ADN génomique sanguin
1.2
Réactifs, consommables et matériel à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
•
Éthanol de 96 à 100 % (pour ajuster les conditions de fixation de l’ADN et préparer le
tampon de lavage B5)
Consommables
•
Embouts de pipette à usage unique (idéalement avec barrière contre les aérosols, pour
éviter les contaminations inter-échantillons)
Matériel
•
Pipeteurs manuels
•
Dispositif de centrifugation pour tubes de microcentrifugation
•
Mélangeur vortex
•
Bloc chauffant ou bain-marie (pour la lyse des échantillons à 70 °C)
•
Équipements de protection individuelle (par ex. : blouse de laboratoire, gants, lunettes de
sécurité)
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
5
ADN génomique sanguin
1.3
À propos de ce mode d’emploi
Il est fortement conseillé de lire les modes opératoires détaillés figurant dans le présent mode
d’emploi. La version résumée du mode opératoire est uniquement destinée à servir d’aidemémoire pendant la procédure de purification.
Les modes d’emploi MACHEREY‑NAGEL sont disponibles sur notre site Internet,
www.mn-net.com.
Veuillez contacter notre service d’assistance technique pour connaître les nouveautés du
présent mode d’emploi par rapport aux versions antérieures.
Coordonnées de contact
MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Valencienner Str. 11
52355 Duren, Allemagne
Tél. : +49 24 21 969‑0
Numéro vert : 0800 26 16 000 (depuis l’Allemagne uniquement)
E-mail : [email protected]
Assistance technique Bioanalyse
Tél. : +49 24 21 969‑270
E-mail : [email protected]
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verfügbar.
Les manuels d’utilisation dans d’autres langues sont disponibles dans la section Téléchargements
de la page du produit.
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6
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
ADN génomique sanguin
2
Description du produit
2.1
Usage prévu
NucleoSpin® Dx Blood est un kit destiné à l’extraction de l’ADN génomique à partir
d’échantillons de sang total humain frais et congelés, stabilisés à l’EDTA, au citrate ou à
l’héparine, recueillis avec les systèmes de prélèvement sanguin habituels, afin de procéder
ensuite à leur analyse in vitro. Le produit permet d’obtenir de l’ADN génomique purifié qui peut
être utilisé pour des applications aval telles que PCR, qPCR ou séquençage afin d’obtenir des
informations sur l’ADN génomique dans l’échantillon. Le produit est réservé aux utilisateurs
professionnels dans les laboratoires de diagnostic.
Le kit NucleoSpin® Dx Blood n’est pas destiné à être utilisé comme autotest ni pour les tests
au chevet du patient. L’utilisateur doit avoir une certaine expérience des techniques de biologie
moléculaire, notamment la manipulation d’échantillons de sang total, et d’autres échantillons
d’origine humaine potentiellement infectieux.
Il est recommandé d’utiliser les contrôles appropriés tels que des contrôles internes, des
témoins d’extraction, et des contrôles positifs/négatifs.
2.2
Limites d’utilisation du produit
Le kit NucleoSpin® Dx Blood ne doit pas être utilisé avec des échantillons de tissus ou
de selles, ni avec des fluides corporels acellulaires tels que l’urine, le sérum, le plasma ou le
liquide céphalorachidien. Les performances du kit n’ont pas été évaluées avec de la couche
leucocytaire, des cellules cultivées ou isolées, des frottis, des tâches de sang séché et de l’ADN
viral. Le kit n’est pas non plus indiqué pour isoler et purifier les acides nucléiques de bactéries,
de champignons ou de parasites.
2.3
Contrôle qualité
Conformément au système d’assurance qualité en vigueur chez MACHEREY‑NAGEL, chaque
lot de kit NucleoSpin® Dx Blood est testé par rapport à des spécifications prédéfinies, afin
d’assurer une qualité de produit constante.
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
7
ADN génomique sanguin
2.4
Présentation du kit et de ses spécifications
Le kit NucleoSpin® Dx Blood s’appuie sur la technologie éprouvée des membranes en silice
NucleoSpin®. Il permet d’isoler facilement l’ADN génomique à partir d’échantillons de sang total
de 200 µL. L’ADN purifié obtenu est prêt à l’emploi pour être amplifié par PCR.
La procédure NucleoSpin® Dx Blood repose sur une séquence d’étapes simples :
En premier lieu, les échantillons de sang sont lysés en présence de sels chaotropiques et de
protéinase K. L’ADN génomique contenu dans le lysat est ensuite piégé dans une colonne
NucleoSpin® Dx Blood. La membrane à laquelle est lié l’ADN est ensuite lavée et l’ADN
génomique de pureté élevé est alors récupéré par élution.
Échantillons
Ce kit peut être utilisé avec du sang total humain frais ou congelé, traité à l’EDTA, au citrate ou
à l’héparine, provenant de systèmes de prélèvement sanguin habituels.
Un volume de 200 μL de sang total humain produira généralement de 3 à 5 μg d’ADN
génomique, en fonction du nombre de leucocytes dans l’échantillon.
La liste ci-dessous présente des dispositifs de prélèvement sanguin appropriés :
Tableau 1: Liste de systèmes de prélèvement sanguin
appropriés
Système de prélèvement
Fabricant
S-Monovette® Li-Heparin
Sarstedt
S-Monovette® EDTA
Sarstedt
®
S-Monovette Citrat
Sarstedt
®
VACUETTE EDTA
GREINER BIO-ONE
BD VACUTAINER® K2E
BD
K3 EDTA
DELTA LAB
K2 EDTA
APTACA
Limites liées à l’échantillon
Les cryoprécipités formés pendant la décongélation des échantillons congelés peuvent obstruer
la colonne NucleoSpin® Dx Blood. Si des précipités sont visibles, évitez de les aspirer lors de
l’introduction du lysat dans la colonne de fixation.
De plus, les échantillons hémolysés et hyperlipidiques peuvent évidemment influer sur le
rendement et la pureté de l’ADN.
8
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
ADN génomique sanguin
Tableau 2: Résumé des spécifications du kit
Paramètre
NucleoSpin® Dx Blood
Matériau échantillonné
Sang total humain frais ou congelé, traité à l’EDTA, au
citrate ou à l’héparine, recueilli avec les systèmes de
prélèvement sanguin habituels.
Volume d’échantillon
200 µL
Rendement d’ADN généralement
constaté
3 à 5 μg en fonction de la numération leucocytaire
Qualité d’ADN généralement
constatée
Rapport A₂₆₀ / A₂₈₀ de 1,7 à 1,9
Rapport A₂₆₀ / A₂₃₀ de 1,8 à 2,3
Volume d’élution
50 à 200 μL
Concentration d’ADN généralement 40 à 60 ng/μL
constatée
Traitement
2.5
Centrifugation
Performances analytiques
La répétabilité intracycle a été calculée à partir de l’extraction parallèle de 12 aliquotes identiques.
Le rendement moyen en ADN était de 5,2 µg ± 0,3, soit un CV de 6 %. La répétabilité intercycles a été testée lors de 2 analyses indépendantes. Dans chaque analyse, l’ADN a été isolé
à partir d’un échantillon de sang, et chaque extrait a été répliqué 6 fois. La différence entre les
rendements moyens des deux analyses était de 0,2 µg d’ADN, soit 6 %. Pour la répétabilité
inter-lots, 3 Lots du kit NucleoSpin® Dx Blood ont été comparés côte à côte. Pour chaque lot,
l’ADNg a été isolé et répliqué 6 fois. Tous les réplicats ont été extraits d’un seul échantillon de
sang. Les rendements moyens en ADN des six préparations étaient de 5,2, 4,8 et 5,0 µg, avec
des écarts-types de 0,4, 0,5 et 0,5 µg, respectivement. Le CV des rendements moyens des
trois lots était de 4 %.
Pour l’évaluation de la reproductibilité, l’ADN a été extrait d’échantillons de sang total par deux
opérateurs côte à côte. Le rendement moyen (n = 6) était de 2,9 µg ± 0,3 µg et de 3,0 µg
± 0,2 µg, respectivement, ce qui correspond à un CV de 9 % et 7 % pour les six préparations.
La différence entre les rendements moyens des deux opérateurs était de 0,1 µg.
L’utilisation du kit NucleoSpin® Dx® Blood pour le diagnostic in vitro est illustrée dans les
publications suivantes :
Hadzsiev, K. et al. (2019) Rubinstein-Taybi syndrome 2 with cerebellar abnormality and neural
tube defect. Clin Dysmorphol., 28(3), 137 – 141.
Komlósi, K. et al. (2015) Phenotypic variability in a Hungarian patient with the 4q21 microdeletion
syndrome. Mol Cytogenet., 8, 16.
Czakó, M. et al. (2019) Possible Phenotypic Consequences of Structural Differences in Idic(15)
in a Small Cohort of Patients. Int J Mol Sci., 20(19), 4935.
Szabo, A. et al. (2015) Partial tetrasomy of the proximal long arm of chromosome 15 in two
patients : the significance of the gene dosage in terms of phenotype. Mol Cytogenet., 8, 41.
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
9
ADN génomique sanguin
2.6
Procédures d’élution
L’ADN est récupéré des colonnes NucleoSpin® Dx Blood par élution avec 50 à 200 μL de
tampon d’élution BE. Le rendement total d’ADN augmente avec le volume d’élution, tandis que
la concentration d’ADN diminue (voir la Figure 1).
Généralement, jusqu’à 10 μL d’éluat peuvent être utilisés à titre d’essai dans un mélange de
50 μL pour PCR, sans perte de performances de la réaction de PCR. Il est conseillé de conserver
à -20 °C l’ADN récupéré par élution. La répétition de cycles de congélation-décongélation est
sans effet sur la plupart des applications aval.
Conservation des acides nucléiques
Recommandation :Conservation à court terme (jusqu’à 24 h) : 2 à 8 °C
Conservation à long terme (plus de 24 h) : -20 °C.
6.0
80
DNA yield [µg]
5.5
60
5.0
40
DNA yield / µg
4.5
20
4.0
DNA concentration [ng/µL]
100
0
0
50
100
150
200
Elution volume [µL]
Figure 1 Effet du volume d’élution sur le rendement total d’ADN (pointillés) et la
concentration (trait plein). L’élution a été effectuée avec 50, 100 et 200 µL.
10
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
ADN génomique sanguin
3
Conditions de conservation et préparation des
solutions de travail
Attention :
•
Vérifiez l’état des différents composants du kit à la réception. Si les flacons de tampon ou
les sachets blister sont endommagés, contactez l’assistance technique et le service client
de MACHEREY‑NAGEL, ou votre revendeur habituel.
•
N’utilisez pas les composants du kit s’ils sont endommagés.
•
À l’arrivée, le kit NucleoSpin® Dx Blood doit être conservé entre 18 et 25 °C. Il n’est PAS
nécessaire d’ouvrir le kit dès réception et de retirer les différents composants pour les
stocker séparément.
•
Les colonnes NucleoSpin® Dx Blood peuvent être utilisées jusqu’à la date d’expiration
indiquée sur l’emballage du kit.
Avant de commencer le mode opératoire NucleoSpin® Dx Blood, préparez les éléments
suivants :
•
Tampon de lavage B5 : Ajoutez le volume indiqué (dans le tableau ci-dessous ou sur
le flacon) d’éthanol (96 à 100 %) au tampon de lavage B5 concentré. Indiquez sur
l’étiquette du flacon que de l’éthanol a été ajouté. Conservez le tampon de lavage B5
entre 18 et 25 °C jusqu’à la date d’expiration.
•
La protéinase K lyophilisée peut être conservée entre 18 et 25 °C jusqu’à la date
d’expiration, sans perte de performances. Avant d’utiliser le kit pour la première fois,
ajoutez le volume indiqué de tampon protéinase PB pour dissoudre la protéinase K
lyophilisée. La protéinase K reconstituée doit être stockée à -20 °C et elle peut être
conservée jusqu’à 6 mois, sans dépasser la date d’expiration.
•
Pendant le stockage, en particulier à basse température, un précipité blanc peut se former
dans les tampons B3 et BW. Ces précipités se dissolvent facilement par incubation du
flacon à 70 °C pendant 5 minutes avant l’utilisation.
NucleoSpin® Dx Blood
50 préparations
740899.50
250 préparations
740899.250
Tampon de lavage B5
(concentré)
12 mL
Ajouter 48 mL d’éthanol
50 mL
Ajouter 200 mL d’éthanol
Protéinase K
30 mg
Ajouter 1,35 mL
de tampon protéinase
2 × 75 mg
Ajouter 3,35 mL
de tampon protéinase
dans chaque flacon
RÉF
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
11
ADN génomique sanguin
4
Consignes de sécurité
Lors de l’utilisation du kit NucleoSpin® Dx Blood, portez des vêtements de protection
appropriés (blouse de laboratoire, gants à usage unique et lunettes de sécurité, par exemple).
Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité (FDS) des produits utilisés
qui sont disponibles en ligne (http ://www.mn-net.com/msds).
Attention : le chlorhydrate de guanidine contenu dans le tampon B3 et le tampon BW peuvent
former des composés fortement réactifs en présence d’eau de Javel. En conséquence, ne
versez pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement dans les déchets issus de la
préparation des échantillons.
Les déchets produits lors de l’utilisation du kit NucleoSpin® Dx Blood n’ont pas été testés
pour vérifier la présence de résidus de matières infectieuses. Une contamination des déchets
liquides par des matières infectieuses est fortement improbable en raison de l’action puissante
de dénaturation du tampon de lyse et du traitement par la protéinase K, mais on ne peut
totalement l’exclure. Les déchets liquides doivent donc être considérés comme infectieux et ils
doivent être manipulés et éliminés conformément aux règles de sécurité en vigueur localement.
4.1
Élimination
Éliminez les matériaux dangereux, infectieux ou contaminés par des agents biologiques d’une
manière sûre et acceptable et conformément à toutes les exigences locales et réglementaires.
12
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
NucleoSpin® Dx Blood
5
Purification d’ADN génomique avec le kit
NucleoSpin® Dx Blood
La procédure suivante décrit les instructions pour un seul échantillon de sang. Il est cependant
possible de traiter plusieurs échantillons simultanément ; le nombre dépend de la capacité de
la microcentrifugeuse utilisée.
Avant de commencer la procédure :
•
Vérifiez que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément aux
instructions de la section 3.
•
Vérifiez que de l’éthanol de 96 à 100 %, dénaturé ou non dénaturé, est disponible pour
ajuster les conditions de fixation de l’ADN.
•
Réglez un incubateur (par exemple, le bloc chauffant) ou un bain-marie à 70 °C.
•
Équilibrez les échantillons sanguins à la température ambiante. Assurez-vous de bien
mélanger les échantillons.
•
Si un précipité s’est formé dans le tampon de lyse B3 ou le tampon BW, incubez le
tampon à 70 °C jusqu’à la dissolution du précipité.
•
En règle générale, ne mélangez pas des réactifs et des colonnes de kits ou de lots
différents.
•
Équilibrez le tampon d’élution BE à la température ambiante.
•
N’ajoutez pas directement la solution de protéinase K au tampon de lyse B3. La
protéinase K doit être mélangée à l’échantillon de sang avant l’ajout du tampon B3.
•
Toutes les étapes de centrifugation doivent être effectuées à température ambiante.
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
13
NucleoSpin® Dx Blood
5.1
Mode opératoire résumé
En complément du mode opératoire résumé :
lisez attentivement le mode opératoire détaillé (section 5.2) avant de commencer la procédure.
Lyse des
échantillons
de sang
1
25 µL de protéinase K
2
200 µL de sang
3
200 μL de B3, mélanger
4
Laisser reposer 5 min
5
70 °C, 10 min, mélanger
6
2000 x g, 1 s
Ajustement
7
des conditions
de fixation de
l’ADN
8
210 μL d’éthanol, mélanger
Fixation de
l’ADN
9
Introduire le lysat
10
11 000 x g, 1 min
11
Transférer la colonne
NucleoSpin® Dx Blood
dans un nouveau tube de
collecte
12
500 µL de tampon BW
13
11 000 x g, 1 min
14
Transférer la colonne
NucleoSpin® Dx Blood
dans un nouveau tube de
collecte
15
600 µL de tampon B5
16
11 000 x g, 1 min
17
Transférer la colonne
NucleoSpin® Dx Blood
dans un nouveau tube de
collecte
18
11 000 x g, 1 min
Lavage de la
membrane en
silice
Séchage de la
membrane en
silice
14
2000 x g, 1 s
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
NucleoSpin® Dx Blood
Élution de
l’ADN
5.2
19
Transférer la colonne
NucleoSpin® Dx Blood
dans un tube d’élution
20
50 à 200 μL de tampon BE
21
11 000 x g, 1 min
Mode opératoire détaillé
1
Transférer à la pipette 25 μL de solution de protéinase K dans un tube de lyse (1,5 mL,
fourni).
2
Ajouter 200 μL d’échantillon de sang au tube de lyse. Mélanger.
3
Ajouter 200 μL de tampon B3 au tube de lyse, fermer le couvercle et mélanger
vigoureusement au vortex par impulsions successives pendant 10 s.
Ne pas mélanger à l’avance le tampon B3 et la protéine K !
4
Incuber à température ambiante pendant 5 min (± 1 min).
5
Incuber le tube de lyse à 70 °C (± 2 °C) pendant 10 min (± 1 min). Après incubation,
mélanger vigoureusement au vortex par impulsions successives pendant 5 s.
6
Centrifuger brièvement le tube de lyse (environ 1 s à 2000 x g) pour éliminer les
gouttelettes du couvercle (cycle court uniquement).
7
Ajouter 210 μL d’éthanol (96 à 100 %) à l’échantillon. Fermer le couvercle et mélanger
au vortex par impulsions successives pendant 5 s.
Vérifier que l’éthanol et le lysat sont intimement mélangés.
8
Centrifuger brièvement le tube de lyse (environ 1 s à 2000 x g) pour éliminer les
gouttelettes du couvercle (cycle court uniquement).
9
Introduire précautionneusement la totalité du lysat dans la colonne NucleoSpin®
Dx Blood placée dans un tube de collecte et fermer le couvercle.
10
Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g.
Si le lysat n’est pas totalement aspiré à travers la membrane, répéter la centrifugation à
une vitesse plus élevée : de 15 000 à 20 800 x g pendant 1 min. Si la totalité du lysat ne
traverse toujours pas la membrane, éliminer l’échantillon et recommencer la procédure
d’isolement avec un nouvel échantillon.
11
Placer la colonne NucleoSpin® Dx Blood dans un nouveau tube de collecte (2 mL,
fourni) et éliminer le tube de collecte de l’étape précédente, avec le liquide qu’il contient.
12
Ouvrir la colonne NucleoSpin® Dx Blood et ajouter 500 µL de tampon BW dans la
colonne. Fermer le couvercle.
Note : vérifier que le lysat résiduel est éliminé par rinçage avec le tampon BW.
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
15
ADN génomique sanguin
13
Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g.
14
Placer la colonne NucleoSpin® Dx Blood dans un nouveau tube de collecte (2 mL,
fourni) et éliminer le tube de collecte de l’étape précédente, avec le liquide qu’il contient.
15
Ouvrir la colonne NucleoSpin® Dx Blood et ajouter 600 µL de tampon B5 dans la
colonne. Fermer le couvercle.
Note : Vérifier que le tampon de lavage résiduel de l’étape précédente est éliminé par
rinçage avec le tampon B5.
16
Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g.
17
Placer la colonne NucleoSpin® Dx Blood dans un nouveau tube de collecte (2 mL,
fourni) et éliminer le tube de collecte de l’étape précédente, avec le liquide qu’il contient.
18
Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g.
L’éthanol résiduel est éliminé pendant cette étape.
19
Placer la colonne NucleoSpin® Dx Blood dans un tube d’élution propre (1,5 mL,
fourni) et éliminer le tube de collecte de l’étape précédente.
20
Ouvrir la colonne NucleoSpin® Dx Blood et ajouter 50 à 200 μL de tampon BE
directement sur le centre de la membrane.
21
Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g pour récupérer l’ADN de la colonne par
élution.
16
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
ADN génomique sanguin
6
Annexe
6.1
Guide de résolution des problèmes
Problème
Cause possible et suggestions
La concentration en leucocytes de l’échantillon est faible.
•
La quantité d’ADN récupérée dépend du nombre de leucocytes
dans l’échantillon. Les échantillons contenant un nombre réduit de
leucocytes produisent de faibles quantités d’ADN.
La lyse de l’échantillon est incomplète.
•
L’échantillon n’est pas homogène ou il contient des caillots sanguins.
Assurez-vous que les échantillons sont prélevés suivant les instructions
du fabricant du tube de prélèvement. Veillez à n’utiliser que du sang
qui peut être facilement transféré à la pipette. Homogénéisez si besoin
l’échantillon sanguin avant utilisation.
•
L’échantillon n’est pas mélangé de façon homogène avec la
protéinase K et le tampon de lyse. Le mélange doit être mélangé
vigoureusement au vortex immédiatement après l’ajout du tampon de
lyse B3.
La quantité
d’ADN
• La digestion par la protéinase K n’est pas optimale. N’ajoutez jamais
récupérée est
directement la protéinase K au tampon de lyse B3.
faible ou nulle.
Les réactifs ne sont pas utilisés correctement.
•
Préparez les tampons et la solution de protéinase K conformément
aux instructions de la section 3. Ajoutez de l’éthanol au lysat avant
d’introduire le lysat dans la colonne.
La centrifugation n’est pas correcte.
•
N’augmentez pas la vitesse et la durée de centrifugation indiquées aux
étapes 6 et 8. Utilisez un cycle court pour éliminer les gouttelettes du
couvercle.
L’élution de l’ADN hors de la colonne n’est pas optimale.
•
L’efficacité d’élution dépend du volume de tampon d’élution. Pour une
efficacité d’élution maximale, utilisez 200 μL de tampon d’élution ; pour
une concentration d’ADN maximale, utilisez 50 μL de tampon d’élution.
L’échantillon de sang n’est pas homogène.
•
La colonne de
fixation d’ADN
est obstruée.
Les cryoprécipités formés pendant la décongélation des échantillons
congelés peuvent obstruer la colonne NucleoSpin® Dx Blood. Si des
précipités sont visibles, évitez de les aspirer lors de l’introduction du
lysat dans la colonne de fixation. Des précipités peuvent également
se former dans les échantillons de sang frais. Assurez-vous de bien
mélanger les échantillons. Si la colonne se bouche pendant l’étape de
fixation de l’ADN, répétez la centrifugation à une vitesse plus élevée :
de 15 000 à 20 800 x g pendant 1 minute.
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
17
ADN génomique sanguin
Problème
Cause possible et suggestions
Les réactifs ne sont pas utilisés correctement.
•
Préparez les tampons et la solution de protéinase K conformément aux
instructions de la section 3. Ajoutez de l’éthanol au lysat et mélangez
avant de l’introduire dans la colonne.
La lyse de l’échantillon est incomplète.
L’ADN est
de mauvaise
qualité.
•
L’échantillon n’est pas mélangé de façon homogène avec la solution
de protéinase K et le tampon de lyse. Le mélange doit être mélangé
vigoureusement au vortex immédiatement après l’ajout du tampon de
lyse.
•
La digestion par la protéinase K n’est pas optimale. N’ajoutez pas
directement la protéinase K au tampon de lyse B3.
L’échantillon sanguin utilisé est ancien ou il contient des caillots.
•
Veillez à n’utiliser que du sang qui peut être facilement transféré à la
pipette. Homogénéisez si besoin l’échantillon sanguin avant utilisation.
Contamination par l’éthanol.
•
L’ADN
•
génomique
ne donne pas
les résultats
escomptés
lors des
réactions
enzy­matiques.
Assurez-vous d’avoir éliminé la totalité de tampon éthanolique B5
avant l’élution de l’ADN. Si le niveau de remplissage du tampon de
lavage B5 extrait de la colonne après le second lavage atteint la sortie
de la colonne, éliminez le tampon de lavage, remettez la colonne dans
le tube de collecte et centrifugez-la de nouveau.
Les éluats d’ADN peuvent contenir des traces d’éthanol. Toutefois,
aucune baisse des performances de PCR n’a été observée avec un
éluat d’ADN représentant jusqu’à 20 % du volume final de PCR comme
quantité d’essai (par exemple : utilisation de 4 μL d’un éluat de 100 μL
comme quantité d’essai dans une PCR de 20 μL). Le pourcentage
maximal de volume de modèle dans une amplification PCR peut
varier en fonction de la robustesse du système de PCR et il doit être
déterminé par l’utilisateur.
L’ADN est contaminé par des substances inhibitrices.
•
Si vous devez isoler l’ADN à partir d’échantillons sanguins anciens ou
contenant des caillots, veillez à n’utiliser que du sang qui peut être
facilement transféré à la pipette. Homogénéisez si besoin l’échantillon
sanguin avant utilisation.
Veuillez contacter :
MACHEREY‑NAGEL Allemagne
Tél. : +49 (0) 24 21 969 270
e-mail : TECH-BIO@mn‑net.com
18
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
ADN génomique sanguin
6.2
Exigence de notification
Veuillez noter que le fabricant et l’autorité compétente de l’État membre européen
dans lequel un incident sérieux en rapport avec le produit est survenu doivent en
être avisés immédiatement. Agences en charge de la matériovigilance en Europe :
https ://ec.europa.eu/health/md_sector/contact_en
6.3
Bibliographie générale
Thiemann F. et al. (2006) Leitfaden Molekulare Diagnostik -Grundlagen, Gesetze, Tipps und
Tricks, WILEY-VCH, ISBN 3‑527‑31471‑7.
Orzińska A. et al. (2015) 14 Years of Polish Experience in Non-Invasive Prenatal Blood Group
Diagnosis. Transfus Med Hemother, 42, 361 – 364.
Papadopoulou A. et al. (2014) Calcium sensing receptor in pregnancies complicated by
gestational diabetes mellitus. Placenta, 35, 632e638.
Bleda S. et al. (2012) Vascular endothelial growth factor polymorphisms are involved in the late
vascular complications in Type II diabetic patients. Diabetes & Vascular Disease Research, 9(1),
68 – 74.
6.4
Références
Produit
RÉF
Quantité
NucleoSpin® Dx Blood
740899.50 / .250
50 / 250
NucleoSpin® Dx Virus
740895.50
50
744215.4
384
®
NucleoMag Dx Pathogen
Pour des informations plus détaillées sur les produits, rendez-vous sur www.mn-net.com.
6.5
Explication des pictogrammes
Référence
Limites de température autorisées
pour le stockage
Identification du lot
Utiliser avant
Fabricant
Attention : pour plus d’informations,
se reporter au mode d’emploi.
Produits de diagnostic in vitro
Ne pas réutiliser
Consulter le mode d’emploi
Quantité suffisante pour < n> tests
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
19
ADN génomique sanguin
6.6
Limites d’utilisation du produit et garantie
Le kit NucleoSpin® Dx Blood est un système générique pour l’extraction et la purification
d’ADN génomique à partir d’échantillons de sang total humain, à des fins de diagnostic in vitro.
Le kit est conçu pour être utilisé avec toute application d’amplification enzymatique et de
détection d’ADN, par exemple l’amplification PCR. Les éventuels résultats diagnostiques obtenus
à partir des acides nucléiques isolés à l’aide du kit NucleoSpin® Dx Blood en association avec
une autre technique de dosage in vitro doivent être interprétés en tenant compte des autres
résultats cliniques ou de laboratoire. Le kit NucleoSpin® Dx Blood ne produit pas de résultats
diagnostiques. Il incombe à l’utilisateur d’utiliser et de valider le kit utilisé en association avec
un test de diagnostic in vitro en aval. SEULS les produits MACHEREY‑NAGEL spécifiquement
marqués IVD peuvent être employés pour un usage de diagnostic in vitro.
Pour plus d’informations sur la sécurité, consultez la section adéquate du présent mode
d’emploi. Le kit NucleoSpin® Dx Blood doit être utilisé exclusivement dans un environnement
de test approprié, par exemple un laboratoire prévu à cet effet.
L’utilisateur est responsable de tous les dommages résultant de l’emploi du kit NucleoSpin®
Dx Blood à des fins différentes de l’usage prévu décrit dans le présent mode d’emploi.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL est livré avec une documentation précisant les spécifications
et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit
aux spécifications déclarées. La seule obligation de MACHEREY‑NAGEL et le seul recours du
client se limitent au remplacement gratuit des produits qui n’offriraient pas les performances
garanties. Il est également fait référence aux conditions générales de MACHEREY‑NAGEL, qui
sont imprimées sur la liste tarifaire, et dont un exemplaire sera remis sur simple demande.
MACHEREY‑NAGEL ne saurait être tenue pour responsable des dommages ou des défauts se
produisant pendant le transport et la manipulation (hors assurance expédition au bénéfice du
client), ou par suite d’un accident ou d’une utilisation impropre ou anormale du présent produit,
ni des défauts des produits ou des composants non fabriqués par MACHEREY‑NAGEL,
ni des dommages résultant de tels produits et composants de fabricants autres que
MACHEREY‑NAGEL.
MACHEREY‑NAGEL n’accorde aucune autre garantie d’aucune sorte, et DÉCLINE ET EXCLUT
SPÉCIFIQUEMENT TOUTE AUTRE GARANTIE DE TOUTE SORTE OU NATURE QUE CE SOIT,
DIRECTEMENT OU INDIRECTEMENT, EXPLICITE OU IMPLICITE, Y COMPRIS, SANS S’Y
LIMITER, RELATIVE AU CARACTÈRE APPROPRIÉ, À LA REPRODUCTIBILITÉ, LA DURABILITÉ,
L’ADAPTATION À UN BUT OU UN USAGE PARTICULIER, LA QUALITÉ MARCHANDE, L’ÉTAT
OU TOUT AUTRE SUJET EN CE QUI CONCERNE LES PRODUITS MACHEREY‑NAGEL.
MACHEREY‑NAGEL ne saurait en aucun cas être tenue pour responsable en cas de
réclamations pour tout autre dommage, qu’il soit direct, indirect, fortuit, compensatoire,
prévisible, consécutif ou particulier (y compris, mais sans s’y limiter, la perte d’utilisation, de
revenus ou de profits), que ce soit sur la base d’une garantie, d’un contrat, d’un délit civil (y
compris la négligence) ou d’une responsabilité stricte découlant de la vente ou de la nonconformité d’un produit MACHEREY‑NAGEL aux spécifications énoncées. La garantie est
exclusive et MACHEREY‑NAGEL n’accorde aucune autre garantie explicite ou implicite.
La garantie fournie dans le présent document et les données, spécifications et descriptions de
ce produit MACHEREY‑NAGEL figurant dans les catalogues publiés et la documentation sur
le produit de MACHEREY‑NAGEL constituent les seuls engagements de MACHEREY‑NAGEL
concernant le produit et la garantie. Aucun autre engagement ou déclaration, écrit ou oral, par
des employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL, à l’exception des déclarations
20
MACHEREY-NAGEL – 04/2022, Rév. 05
écrites signées par un agent dûment agréé par MACHEREY‑NAGEL, n’est autorisé ; le client
ne doit pas se fier à de tels engagements ou déclarations, qui ne font pas partie du contrat de
vente ou de la présente garantie.
Les allégations relatives au produit sont susceptibles d’être modifiées. Nous vous invitons par
conséquent à contacter notre service d’assistance technique pour obtenir les informations
les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter
votre revendeur habituel, pour obtenir des informations scientifiques à caractère général.
Les applications mentionnées dans la documentation fournie par MACHEREY‑NAGEL
le sont uniquement à titre informatif. MACHEREY‑NAGEL ne garantit pas que toutes les
applications ont été testées dans les laboratoires de MACHEREY‑NAGEL, avec des produits
MACHEREY‑NAGEL. MACHEREY‑NAGEL ne garantit en aucun cas l’exactitude de ces
applications.
Dernière mise à jour : Avril 2022 / ​Rév. 05
Motif de la révision :
Ajout de données analytiques et cliniques sur le rendement au paragraphe 2.5. Référence aux
nouvelles langues du manuel d’utilisation (paragraphe 1.3).
Marques :
BD VACUETTE est une marque de BD.
NucleoSpin® est une marque de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG.
S-Monovette est une marque déposée de Sarstedt.
Vacuette est une marque de GREINER BIO-ONE.
Tous les noms et toutes les appellations employés peuvent être des marques, des noms commerciaux ou des
marques déposées appartenant à leurs propriétaires respectifs – y compris en l’absence d’une dénotation particulière.
Les produits et les marques cités le sont uniquement à titre informatif (c’est-à-dire sans volonté de nuire à la marque
ou à la marque déposée, ni intention de la recommander ou de l’évaluer). Nous n’accordons aucune garantie de
sélection, d’efficacité ou de fonctionnement de ces produits ou services.
Plasmid DNA
Clean up
RNA
DNA
Viral RNA and DNA
Protein
High throughput
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FR
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