cytiva ™ CD34 HSC LNP kit 100 μL Mode d'emploi

Cytiva™ CD34+ HSC LNP kit,
100 μL
Mode d’emploi
Traduit de l’anglais
Introduction
À lire avant de déballer ou d’utiliser le kit
Ces instructions contiennent des informations importantes pour la manipulation, le déballage et la
préparation en toute sécurité du Cytiva™ CD34+ HSC LNP kit, 100 μL.
Avant d’utiliser ce produit, tous les utilisateurs doivent lire le présent document ainsi que le NanoAssemblr® Spark™ User Guide.
Utilisation prévue
Le Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL est destiné à la délivrance d'ARN dans des cellules souches
hématopoïétiques humaines (CSH) stimulées.
Ce kit est fourni comme un produit autonome devant être utilisé uniquement en association avec
l’instrument Spark et les cartouches Spark.
Les produits sont uniquement destinés à la recherche et ne peuvent pas être utilisés dans le cadre de
procédures cliniques ou in vitro, ou à des fins diagnostiques ou thérapeutiques.
Sécurité
Pour une utilisation et une manipulation des produits en toute sécurité, se reporter à la fiche de
données de sécurité (FDS) de chaque produit chimique utilisé dans la procédure.
Scanner le code QR figurant sur l’emballage pour accéder à la FDS des composants.
precisionnanosystems.com
1002515 Rev 1
Généralités
Description
Le Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL est un mélange de réactifs à base de nanoparticules lipidiques
(NPL) qui est optimisé pour la délivrance d’ARN (tel que de l’ARNm de Cas9/ARNsg) dans des CSH
stimulées.
Les composants du kit Cytiva CD34+ HSC LNP sont utilisés avec l’instrument NanoAssemblrSpark
pour produire des NPL-ARN. Le kit est disponible en deux versions. Les deux versions incluent des
réactifs, mais une seule d’entre elles inclut des cartouches Spark. Voir Composants du kit,
à la page 3.
Cette méthode de délivrance non virale peut être intégrée à des flux de travail de culture de CSH
standard. Le kit Cytiva CD34+ HSC LNP permet aux chercheurs d'établir une méthode évolutive et
cliniquement pertinente pour la délivrance et l’édition de gènes ex vivo. Le kit est approprié pour être
utilisé dans la découverte de médicaments, le criblage, et le développement de thérapies à base de
CSH modifiées par un gène.
Applications typiques
• Délivrance d’ARN pour exprimer des protéines d’intérêt
• Délivrance d’ARNm de nucléase à des fins de manipulation génétique, par exemple une invalidation génique par CRISPR/Cas.
• Délivrance d’ARNsi pour une extinction génique transitoire
Produits associés
Les produits suivants peuvent être utilisés avec l’instrument NanoAssemblr Ignite™ ou Ignite+™ pour
des applications à l’échelle préclinique.
Produit
Code produit
Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 2 mL
1005000
Instrument NanoAssemblr Ignite
NIN0001
Instrument NanoAssemblr Ignite+
1001413
Documentation associée
Document
ID du document
NanoAssemblr Spark User Guide
sparksystem-UG-0420
Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 µL Workbook
hsckitmrnaspark-WB-1223
RiboGreen Assay Protocol to Determine RNA Encapsulation Efficiency
PNI-WB-S9-001-INT
Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1
2
Document
ID du document
Genome Editing of CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells
with Lipid Nanoparticles
HSC-AN-1123
Accès à la documentation utilisateur en ligne
Scanner le code QR ou consulter l’adresse precisionnanosystems.com/instructions.
Composants du kit
Introduction
Le kit est disponible en deux versions, une qui inclut des cartouches Spark, et une qui n’en inclut pas.
Les sections suivantes indiquent les noms des composants et les températures de stockage pour
chaque version du kit.
Kit Cytiva CD34+ HSC LNP (1003000)
Étiquette
Contenu
Taille
Stockage
Lipid mix
Mélange de lipides
100 µl
-80 °C
Formulation buffer type 1
Tampon de formulation
400 µl
2 °C à 8 °C
Dilution buffer type 1
Tampon de dilution
1500 µl
2 °C à 8 °C
Apolipoprotein-E3 (ApoE3)
Apolipoprotéine-E3 (ApoE3)
100 µg
-80 °C
Kit Cytiva CD34+ HSC LNP avec cartouches
(1004000)
Étiquette
Contenu
Taille
Stockage
Lipid mix
Mélange de lipides
100 µl
-80 °C
Formulation buffer type 1
Tampon de formulation
400 µl
2 °C à 8 °C
Dilution buffer type 1
Tampon de dilution
1500 µl
2 °C à 8 °C
Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1
3
Étiquette
Contenu
Taille
Stockage
Apolipoprotein-E3 (ApoE3)
Apolipoprotéine-E3 (ApoE3)
100 µg
-80 °C
5 unités
15 °C à 25 °C
Cartouches NanoAssemblrSpark
Date d’expiration
Se reporter à l’emballage des composants individuels.
Capacité du kit
Le kit contient du matériel suffisant pour la préparation d’au moins 5 formulations de nanoparticules
lipidiques, chacune contenant 10 µg d’ARN.
Matériel requis
Matériel requis fourni par Precision NanoSystems
Produit
Code produit
Instrument NanoAssemblrSpark
NIS0001
Cartouches NanoAssemblrSpark
Paquet de 20 : NIS0009
Paquet de 80 : NIS0013
Matériel requis fourni par l’utilisateur
Pour préparer les NPL-ARN avec le kit Cytiva CD34+ HSC LNP, l’équipement, les consommables et les
réactifs suivants sont requis.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Lecteur de plaques en fluorescence
Bloc chauffant ou étuve capable de chauffer à 55 °C
Étuve, capable de chauffer à 37 °C
Spectromètre UV
Agitateur vortex
Tubes de 0,5 à 2 ml avec capuchon à vis et joint torique
Micropipettes et cônes de pipette exempts de RNase - 10, 20 et 200 µl
Plaques à 96 puits à fond noir
Quant-iTRiboGreen Assay Kit
Triton X-100
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X, sans calcium et magnésium
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4
• Eau de qualité biologie moléculaire (exempte de RNase/DNase et d’endotoxines)
• Isopropanol à 70 %
• Solution de décontamination des RNases
Vue d’ensemble du flux de travail
Cette section décrit le flux de travail pour préparer des NPL-ARN sur l’instrument Spark, y compris la
préparation de la solution d’ARN, la manipulation de l’instrument et la préparation des NPL. Un flux
de travail typique utilisant un kit Cytiva CD34+ HSC LNP kit est indiqué dans le tableau ci-dessous.
Phase
Action
Description
1
Remplissage du Cytiva CD34+ HSC
LNP kit, 100 μL Workbook
Calculer la consommation en réactifs et préparer
le matériel
2
Préparation de l’espace de travail
et de l’instrument
Décongeler les réactifs et les matériels, étiqueter
les flacons et paramétrer l’instrument Spark
3
Préparation de la solution d’ARN
Préparer la solution de travail d’ARN en combinant
la charge utile d’ARN et le tampon de formulation
inclus
4
Formulation des NPL-ARN
Formuler les NPL sur l’instrument Spark
5
Quantification de l’ARN chargé
Quantifier l’ARN encapsulé à l’aide de l’essai RiboGreen
6
Traitement des CSH par les NPL
Ajouter les NPL-ARN aux cellules
Remplissage de la feuille de calcul
Le Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Workbook est un outil permettant de calculer les paramètres et
les volumes pour la formulation des NPL sur l’instrument Spark
Le Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Workbook est également appelé Feuille de calcul dans le
présent document. La Feuille de calcul est disponible sur Internet. Voir Accès à la documentation
utilisateur en ligne, à la page 3.
La feuille de calcul est divisée en deux sections pour tenir compte des deux applications indiquées cidessous, et l’utilisateur doit uniquement remplir les entrées sous l’en-tête de section pertinent :
1
2
1. Pour l’expression d’ARNm
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5
2. Pour l’édition par CRISPRCas9 (avec l’ARNm de Cas9 et un ARNsg)
À l’étape 1, l’utilisateur doit saisir les valeurs des paramètres indiqués ci-dessous. Les valeurs recommandées pour ces paramètres sont indiquées dans le tableau.
Paramètre
Description
Valeur recommandée
Stock mRNA
concentration (mg/
mL)1
Concentration de la solution mère d’ARNm
Déterminée par l’utilisateur
Stock Cas9 mRNA
concentration (mg/
mL)2
Concentration de la solution mère de Cas9
Déterminée par l’utilisateur
Stock sgRNA
concentration (mg/
mL)2
Concentration de la solution mère d’ARNsg
Déterminée par l’utilisateur
Cas9 to sgRNA ratio
(wt.)2
Rapport en poids de l’ARNm
de Cas9 sur l’ARNsg (X:1)
1
Samples (number of
replicate LNPs)
Nombre de réplicats
d’échantillons de NPL
Déterminée par l’utilisateur
Remarque :
Une concentration mère
d’ARNsg couramment utilisée
est de 100 µM ou approximativement 3,2 mg/ml pour les
produits de recombinaison de
synthèse.
1 Pour l’expression d’ARNm uniquement
2 Pour l'édition par CRISPRCas9 uniquement
Préparation de l’espace de travail et de
l’instrument
Il est important de maintenir la stérilité de l’ensemble du matériel et d’effectuer tous les travaux dans
l’enceinte de sécurité biologique (ESB). Les cellules souches hématopoïétiques sont particulièrement sensibles aux pyrogènes, tels que les endotoxines, et ce même à des taux minimalement
détectables.
Suivre les étapes ci-dessous pour préparer l’espace de travail et l’instrument Spark.
Étape
Action
1
Mettre sous tension et nettoyer l’enceinte de sécurité biologique (ESB) en l’essuyant
avec de l’isopropanol à 70 % et une solution de décontamination des RNases.
2
Paramétrer l’instrument Spark dans l’ESB. Pour obtenir des instructions détaillées sur
l’installation et l’utilisation, se reporter au NanoAssemblr Spark User Guide.
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6
Étape
Action
a. Essuyer l’instrument avec de l’isopropanol à 70 %.
b. Raccorder l’instrument à une prise électrique mise à la terre.
c. Mettre l’instrument sous tension.
3
Récupérer l’aliquote ou les aliquotes d’ARN congelée(s) puis la/les décongeler sur de la
glace. Toujours conserver l’ARN sur de la glace afin d’empêcher toute dégradation du
matériel.
4
Décongeler le mélange de lipides à 55 °C pendant 5 minutes dans un bain à billes ou un
bloc chauffant. Après la décongélation, conserver le mélange de lipides à température
ambiante. Conserver le flacon fermé pour empêcher toute évaporation.
5
Agiter le mélange de lipides au vortex pour garantir une parfaite homogénéité. Centrifuger dans une microcentrifugeuse pendant 3 à 5 secondes.
6
Placer les éléments suivants dans l’ESB :
Sur de la glace :
À température ambiante :
• Aliquote(s)
• Instrument Spark et cartouches
• Les composants du kit : mélange de lipides, tampon de
d’ARN
formulation et tampon de dilution
• Trois tubes de 0,5 ml pour chaque échantillon de NPL,
étiquetés de manière appropriée pour le matériel suivant :
- Solution d’ARN : un tube pour préparer la solution
aqueuse d’ARN
- Échantillon RiboGreen : un tube de collecte pour une
petite aliquote de NPL-ARN afin de réaliser l’essai RiboGreen (~20 à 25 μL)
- Échantillon final : un tube de collecte pour l’échantillon de
NPL-ARN, pour les NPL-ARN restantes pour la culture
cellulaire (~150 μL)
• Micropipettes de 20 μl et 200 µl et cônes de pipette stériles
7
Dans le menu de l’instrument, appuyer sur Purge, puis appuyer sur le bouton physique
de l’instrument Spark.
Résultat :
L’instrument est purgé pour éliminer l’air piégé.
8
Appuyer sur Formulation dans l’interface utilisateur.
9
À l’invite, paramétrer l’instrument avec le réglage de pression 3.
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7
Préparation de la solution d’ARN
Introduction
Cette section décrit la procédure de préparation de la solution d’ARN. Il existe deux procédures différentes en fonction du type d’ARN.
Avant de commencer, mesurer la concentration de la ou des solution(s) mère d’ARN par UV-Vis afin
de s’assurer que la concentration est bien celle prévue.
Préparation d’ARNm pour une délivrance à un seul
composant
Étape
Action
1
Pipeter les volumes de tampon de formulation (1) et d’eau de qualité biologie moléculaire (2) indiqués à l’étape 2 de la Feuille de calcul dans un tube pour la solution d’ARN.
1
2
3
2
Bien mélanger.
3
Pipeter les volumes d’ARNm (3) indiqués à l’étape 2 de la Feuille de calcul dans le tube de
solution d’ARN.
Conserver la solution mère d’ARN sur de la glace jusqu’à utilisation.
Préparation d’ARNm pour une délivrance à deux
composants
Étape
Action
1
Pipeter les volumes de tampon de formulation (1) et d’eau de qualité biologie moléculaire (2) indiqués à l’étape 2 de la Feuille de calcul dans un tube pour la solution d’ARN.
1
2
3
4
2
Bien mélanger.
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8
Étape
Action
3
Pipeter les volumes d’ARNm de Cas9 (3) et d’ARNsg (4) indiqués à l’étape 2 de la Feuille
de calcul dans le tube de solution d’ARN.
Conserver la solution mère d’ARN sur de la glace jusqu’à utilisation.
Formulation de NPL-ARN
Suivre les étapes ci-dessous pour formuler les NPL-ARN sur l’instrument Spark.
Étape
Action
1
Dans l’ESB, ouvrir le paquet contenant la cartouche Spark et le couvercle associé.
2
À l’aide d’une micropipette, remplir lentement le puits 1 de la cartouche Spark avec le
tampon de dilution.
Veiller à positionner la pipette conformément à la position de la pipette illustrée cidessous pour éviter toute formation de bulles à proximité de l’ouverture du canal.
3
Remplir le puits 2 de la cartouche avec la solution d’ARN précédemment préparée.
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Étape
Action
4
Remplir le puits 3 de la cartouche avec le mélange de lipides. Immédiatement après utilisation, veiller à bien reboucher le flacon de mélange de lipides pour réduire le risque
d'évaporation de cette solution à base d'éthanol.
5
Fermer la cartouche immédiatement pour éviter toute évaporation d’éthanol.
6
Insérer la cartouche fermée contenant les réactifs préparés dans l’instrument Spark.
7
Paramétrer et démarrer le cycle comme décrit dans le Spark User Guide.
8
Appuyer sur le bouton physique de l’instrument Spark pour formuler les NPL-ARN.
Collecte de l’échantillon de NPL-ARN
formulé
Suivre les étapes ci-dessous une fois l’étape de formulation terminée sur l’instrument Spark.
Étape
Action
1
À l’invite de l’instrument, retirer la cartouche Spark de l’instrument.
2
Soulever le couvercle de la cartouche avec précaution.
3
À l’aide d’une micropipette, prélever la solution de NPL-ARN dans le puits 1 de la
cartouche, puis l’ajouter au tube de microcentrifugation stérile de 0,5 ml pour l’échantillon final.
4
Ajouter 96 µl de tampon de dilution aux NPL-ARN formulées et pipeter de haut en bas
pour mélanger minutieusement.
Remarque :
Cette étape de dilution à 1:1 stabilise les NPL.
5
Aliquoter 25 µl de NPL-ARN dans le tube pour l’échantillon RiboGreen.
6
Déterminer la concentration en ARN des NPL à l’aide de l’essai RiboGreen. Se reporter au
RiboGreen Assay Protocol to Determine RNA Encapsulation Efficiency , disponible sur
Internet, pour obtenir des instructions détaillées. Voir Accès à la documentation utilisateur en ligne, à la page 3.
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Les NPL-ARN sont désormais prêtes à être utilisées. Conserver l’échantillon à 4 °C et l’utiliser pour le
traitement cellulaire dans un délai d’une (1) semaine au maximum.
Traitement des CSH par les NPL
Vue d’ensemble
L’illustration ci-dessous représente un schéma fonctionnel du flux de travail de la culture cellulaire
des CSH et du traitement par les NPL. Les moments temporels suggérés dans le flux de travail sont
basés sur des modèles expérimentaux d’invalidation de CD45 et CD33. Se reporter au document
Genome Editing of CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells with Lipid Nanoparticles pour
plus de détails.
Purification et stimulation
Traitement par
les NPL pour
l’édition
génique
Ensemencement d’UFC
Détection de
l’invalidation
Comptage des
UFC
Jour ~3-5
Jour 8
14 jours après
l’ensemencement
LNPs
CD34+ cells
Jour 0
Jour 1
Recommandations pour la culture cellulaire
Pour obtenir une efficacité de transfection optimale des NPL, tenir compte des paramètres essentiels suivants :
• Dosage des NPL-ARN : il est recommandé d’effectuer une titration complète de la dose pour
chaque charge utile afin d’identifier la dose optimale. Une charge utile peut être, par exemple, une
construction d’ARN guide unique différente. La plage recommandée pour la dose de titration peut
aller de 0,2 à 20 µg d’ARN total par million de cellules traitées.
• Pratique stérile : maintenir un environnement de travail stérile lors de la manipulation des
cellules et des NPL. Les opérateurs doivent être dûment formés à la technique stérile appropriée
avant de travailler dans l’enceinte de sécurité biologique.
• Décongélation et expansion des cellules : les CSH CD34+ cryoconservées doivent être stimulées pendant 24 heures après la décongélation (avant l’ajout des NPL).
• Densité cellulaire : une densité d’ensemencement de 0,1 à 0,5 million de cellules/ml est recommandée pour le traitement des NPL.
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• Temps de traitement des NPL : le temps d’incubation après la transfection des NPL dépend des
caractéristiques de la charge utile d’ARN, par exemple de la cinétique d’expression et de la stabilité. Un traitement de 24 à 96 heures est recommandé, avec une optimisation supplémentaire si
nécessaire.
• Milieux de culture cellulaire : le kit Cytiva CD34+ HSC LNP montre une performance optimale
dans des milieux exempts de sérum. Un milieu de culture cellulaire contenant une faible concentration de sérum (≤ 1 %) au moment de l'ajout des NPL peut être acceptable, mais doit être validé
de manière expérimentale. En outre, l’utilisation d'un milieu exempt de sérum est recommandée
pour une rétention optimale du caractère souche et d’un phénotype greffable (CD34+ CD38CD90+ CD133+).
Procédure de traitement par des NPL
Les étapes ci-dessous offrent une vue d’ensemble de la procédure de traitement par des NPL. Se
reporter au document Genome Editing of CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells with Lipid
Nanoparticles pour obtenir un exemple de flux de travail détaillé, qui a été optimisé pour le traitement de CSH par des NPL, ainsi que des conseils pour la résolution des problèmes. Voir la Documentation associée, à la page 2.
Étape
Action
1
Décongeler ou isoler les CSH CD34+.
2
Diluer les cellules à 0,1 à 0,5 million de cellules/ml dans un milieu de culture cellulaire.
3
Le jour suivant, juste avant le traitement par les NPL, ajouter de l’ApoE aux cellules de la
manière suivante :
a. Préparer une solution mère d’ApoE à 0,1 mg/ml en diluant les 100 µg d’ApoE inclus
avec 1 ml de PBS 1X sans calcium ou magnésium. Conserver en aliquotes à -80 °C
pendant 2 mois au maximum pour éviter les cycles de congélation/décongélation.
b. Ajouter la solution mère d’ApoE aux cellules pour obtenir une concentration finale de
1 µg/ml (dilution à 1:100 de la solution mère à 0,1 mg/ml).
c. Mélanger minutieusement par trituration.
4
Ensemencer les cellules dans un récipient de culture ou une plaque multipuits.
5
Ajouter les NPL formulées directement aux cellules ensemencées.
6
Incuber à 37 °C dans du CO2 à 5 %.
7
Effectuer une analyse en aval pour évaluer l’efficacité de la transfection, par exemple via
une cytométrie en flux ou un essai d’unités formant colonies.
Informations de commande
Pour obtenir les informations les plus récentes, consulter le site precisionnanosystems.com.
Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL Mode d’emploi 1002515 Rev 1
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Nom
Code produit
Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL
1003000
Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 100 μL avec cartouches
1004000
Instrument NanoAssemblr Spark
NIS0001
Cartouches NanoAssemblr Spark, paquet de 20
NIS0009
Cartouches NanoAssemblr Spark, paquet de 80
NIS0013
Cytiva CD34+ HSC LNP kit, 2 mL
1005000
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Page laissée intentionnellement vide
precisionnanosystems.com
Ignite, Ignite+, NanoAssemblr et Spark sont des marques de commerce de Precision NanoSystems.
Cytiva est une marque de commerce de Life Sciences IP Holdings Corporation ou de l’une de ses sociétés affiliées opérant sous le
nom de Cytiva.
Triton est une marque de commerce de Union Carbide Corporation. RiboGreen et Quant-iT sont des marques de commerce de
Thermo Fisher Scientific.
Toute autre marque commerciale tierce est la propriété de son détenteur respectif.
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