GUIDE COMPLÉMENTAIRE VetMAX™ PRRSV EU & NA 3.0 Kit Protocoles de purification d’ARN à utiliser avec le kit (Réf. A57016) Référence catalogue A57016 Pub. nº MAN0029414 Rév. A.0 AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de protection, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse suivante : thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité concernant les risques biologiques sur la page du produit à l’adresse thermofisher.com. Porter des gants, des vêtements et des lunettes de protection appropriés. Espèces Matrices Type de test • Sérum • Sang total Porc • Semences • Tissu Individuel ou en mélange[1] • Fluides oraux • Fluides de soins [1] ■ ■ ■ ■ ■ ■ Mélanger jusqu’à cinq échantillons pour les matrices d’échantillons de sérum, de sang total ou de semences. Objectif de ce guide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Choix de l’échantillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Stockage des échantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Matériels requis non fournis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Purification de l’ARN avec le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Annexe A Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL ■ ■ Matériels requis non fournis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Procédure de purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Annexe B Documentation et support ■ ■ Assistance à la clientèle et support technique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Garantie limitée du produit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Pour usage en laboratoire. Objectif de ce guide Ce guide décrit les méthodes de purification d’ARN à partir d’échantillons (sérum, sang total, semences, tissu, fluides oraux et fluide ™ de soins) à l’aide du MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit. Les méthodes ont été validées et optimisées pour une utilisation ™ ultérieure avec le VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit (N° Cat. A57016). Choix de l’échantillon Matrice d’échantillons Type d’analyse Quantité requise et matériel de prélèvement Sérum ou sang total Individuel ou en mélange 200 µl Semences Individuel ou en mélange 300 µl Individuel 20 à 30 mg Fluides oraux N/A[1] 300 µl Fluides de soins N/A[1] 200 µl Tissu [1] Un mélange d’animaux ou d’échantillons différents est utilisé pour cette matrice d’échantillons. Stockage des échantillons Matrice d’échantillons Conservation Sérum (dans un tube sec) Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours maximum). Sang total (dans un tube EDTA) Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours maximum). Semences Conserver les échantillons selon le type de semences à tester : • pour les semences fraîches, conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours maximum) ; Après utilisation ou expiration du délai de 8 jours, conserver les échantillons en dessous de -16°C pendant 1 an au maximum ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Après utilisation ou expiration du délai de 8 jours, conserver les échantillons en dessous de -16°C pendant 1 an au maximum ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. • pour les semences commerciales, conserver les échantillons selon les recommandations du fournisseur. Tissu Après l’échantillonnage, conserver les échantillons de tissu entre 2°C et 8°C si l’analyse est effectuée dans les 24 heures suivant le prélèvement. Après utilisation ou à expiration du délai de 24 heures, conserver les échantillons en dessous de -16°C pour une conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Fluides oraux Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 7 jours maximum). Après utilisation ou expiration du délai de 7 jours, conserver les échantillons en dessous de -16°C pendant 1 an au maximum ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Fluides de soins Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours maximum). Après utilisation ou expiration du délai de 8 jours, conserver les échantillons en dessous de -16°C pendant 1 an au maximum ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. 2 ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit Matériels requis non fournis Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. Tableau 1 Matériels requis pour toutes les méthodes de préparation des échantillons Article Source Instrument et équipement L’un des instruments suivants : • KingFisher™ Flex Purification System • MagMAX™ Express‑96 Magnetic Particle Processor Contacter un représentant commercial local. Voir page 11 pour découvrir les autres instruments compatibles. Micropipettes de précision (gamme de 1 µl à 1 000 µl) avec embouts à filtre sans DNase / RNase PFL Agitateur de laboratoire, vortex ou équivalent PFL Centrifugeuse de paillasse pouvant atteindre 15 000 × g PFL Balance de précision PFL Consommables Microtubes sans DNase / RNase de 1,5 ml et 2 ml PFL Kits et réactifs MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit A32700 ou A32702 5 – IPC PRRS Provenant du VetMAX™ PRRSV EU & NA 3.0 Kit Eau stérile – Eau sans DNase / RNase (pour les échantillons de contrôle négatif [NCS]) PFL Tableau 2 Équipement en option Source Article Biotang Inc Microplate Shaker, ou agitateur de plaques équivalent (pour mélanger les billes avec les échantillons ; toutes les méthodes) Fisher Scientific™ 50-751-4965 Centrifugeuse de paillasse avec adaptateurs pour plaques (pour la préparation du lysat dans les plaques ; méthode Complexe) PFL Tableau 3 Matériel supplémentaire requis pour la méthode Simple (échantillons de tissu uniquement) Article Broyeur à billes parmi les modèles suivants ou équivalents : • Fisherbrand™ Bead Mill 24 Homogenizer (recommandé) • Mixer Mill MM 400 (Verder 207450001) PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) Source • Fisher Scientific™ 15-340-163 • Fisher Scientific™ 08418241 Fisher Scientific™ 11-312-10A Purification de l’ARN avec le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) Suivre cette procédure si les instruments suivants sont utilisés : ™ • KingFisher Flex ™ • MagMAX Express-96 Suivre l’Annexe A, “Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL” si les instruments suivants sont utilisés : ™ • KingFisher Duo Prime ™ • KingFisher mL ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 3 Méthode Suivre la méthode appropriée en fonction de votre type d’échantillon. • Purification de l’ARN à partir de sérum, de sang total, de tissu ou de fluides de soins (méthode Simple) (page 6) • Purification de l’ARN à partir de fluides oraux (méthode Complexe) (page 8) • Purification de l’ARN à partir de semences (page 10) Purification de l’ARN à partir de sérum, de sang total, de tissu ou de fluides de soins (méthode Simple) Préparation des plaques (page 6) Préparation du mélange Beads / PK (page 6) Préparation de la solution Lysis / Binding / IPC (page 7) Préparation de l’échantillon (page 7) Mélange de l’échantillon avec le mélange Beads / PK et la solution Lysis / Binding / IPC (page 7) Traitement des échantillons dans l’instrument (page 8) Purification de l’ARN à partir de fluides oraux (méthode Complexe) Préparation des plaques (page 8) Préparation du mélange Beads / PK (page 8) Préparation de la solution Lysis / IPC (page 9) Préparation du lysat clarifié (page 9) ™ Combinaison du lysat clarifié avec le mélange Beads / PK et MagMAX CORE Binding Solution (page 9) Traitement des échantillons dans l’instrument (page 9) 4 ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit Purification de l’ARN à partir de semences Préparation des plaques (page 10) Préparation du mélange PK (page 10) Traitement des échantillons avec le mélange PK (page 10) Combinaison des échantillons avec le mélange Binding / Beads / IPC (page 11) Traitement des échantillons dans l’instrument (page 11) Instructions • Avant utilisation, retourner les bouteilles de solutions et de tampons pour bien les mélanger. • Mélanger les échantillons avec les réactifs en utilisant un agitateur de plaques ou par aspiration-refoulement. ™ Remarque : Ne pas utiliser d’agitateur de plaques avec les barrettes de tubes requises par l’instrument KingFisher mL. • Pour éviter toute contamination croisée : – Couvrir la plaque ou la barrette de tubes pendant les étapes d’incubation et d’agitation, pour éviter tout débordement. – Pipetter avec précaution les réactifs et les échantillons pour éviter les éclaboussures. • Pour éviter toute contamination par les nucléases : – Porter des gants de laboratoire pendant les procédures. Les gants vous protègent des réactifs, et ils protègent l’acide nucléique des nucléases présentes sur la peau. – Utiliser des embouts de pipettes exempts d’acide nucléique pour manipuler les réactifs, et éviter de mettre des embouts utilisés dans les récipients de réactifs. – Décontaminer les paillasses de laboratoire et les pipettes avant de commencer. Avant la première utilisation du kit (Optionnel) Déterminer les paramètres optimaux du broyeur à billes ™ Nous recommandons l’utilisation de Fisherbrand Bead Mill 24 Homogenizer pour un rendement maximal en acides nucléiques. Si un autre instrument est utilisé, suivre les directives du fournisseur pour déterminer les paramètres de vitesse et de temps pour obtenir une lyse de cellules suffisante. Déterminer le réglage maximal de l’agitateur de plaques Si un agitateur de plaques est utilisé, suivre les étapes suivantes pour déterminer le réglage maximal. 1. Vérifier que la plaque est bien fixée sur l’agitateur. 2. Ajouter 1 ml d’eau dans chaque puits de la plaque, puis couvrir avec une feuille adhésive. 3. Déterminer le réglage maximal qu’il est possible d’utiliser avec l’agitateur afin d'éviter les projections d'eau sur la feuille adhésive. Téléchargement et installation du script ™ Le script adapté au MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit doit être installé sur l’instrument avant sa première utilisation. ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 5 ™ 1. Sur la page produit du MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit sur internet (sur thermofisher.com, effectuer une recherche à partir de la référence catalogue), faire défiler jusqu’à la section Product Literature (Documentation produit). 2. Faire un clic droit sur le fichier approprié pour télécharger la dernière version du script MagMAX_CORE pour votre instrument. Tableau 4 Scripts recommandés Nom du script Instrument KingFisher™ Flex Script express[1] Script standard MagMAX_CORE_Flex.bdz MagMAX_CORE_Flex_Express.bdz MagMAX_CORE_KF-96.bdz MMC_KF96_Express.kf2 KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO.bdz MagMAX_CORE_DUO_Express.bdz KingFisher™ mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz MagMAX_CORE_mL_Express.bdz KingFisher™ 96 MagMAX™ Express-96 [1] Les scripts express ne comprennent pas d’étape de chauffage. Si requis par votre laboratoire, utiliser l’un des scripts suivants, qui ne chauffe pas le liquide lors de l’étape d’élution. Tableau 5 Scripts alternatifs sans étape d’élution chauffée Nom du script Instrument Script standard Script express KingFisher™ Flex MagMAX_CORE_Flex_no_heat.bdz MagMAX_CORE_Flex_Express.bdz KingFisher™ 96 MagMAX_CORE_KF-96_no_heat.bdz MMC_KF96_Express.kf2 KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO_no_heat.bdz MagMAX_CORE_DUO_Express.bdz KingFisher™ mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz MagMAX_CORE_mL_Express.bdz MagMAX Express-96 ™ 3. Consulter le guide d’utilisation de votre instrument ou contacter le support technique pour obtenir les instructions d’installation du script. Purification de l’ARN à partir de sérum, de sang total, de tissu ou de fluides de soins (méthode Simple) 1 Préparation des plaques ™ ™ 1. Préparer les plaques sur l’instrument KingFisher Flex ou MagMAX Express-96. Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Volume par puits Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque. ID de la plaque [1] Position sur l’instrument. Remarque : Pour configurer les plaques ou les barrettes de tubes pour le traitement pour ™ ™ l’instrument KingFisher Duo Prime ou KingFisher mL, voir page 11. 2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées pour le traitement avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. 2 6 Préparation du mélange Bead/PK Nous vous recommandons de préparer un nouveau mélange Bead/PK à chaque série. Si nécessaire, vous pouvez stocker le mélange Bead/PK à 4°C pendant un maximum de 1 semaine. ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 2 ™ Préparation du mélange Bead/PK (suite) 1. Vortexer vigoureusement les MagMAX CORE Magnetic Beads pour s’assurer que les billes sont complètement resuspendues. 2. Mélanger les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons plus 10 % d’excédent. Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 µl MagMAX CORE Proteinase K 10 µl Mélange Bead/PK total 30 µl ™ 3 1. Combiner les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons plus 10 % d’excédent. Préparation de la solution Lysis / Binding / IPC Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Lysis Solution 350 µl MagMAX™ CORE Binding Solution 350 µl 5 – IPC PRRS[1] 2 µl Volume total de la solution Lysis / Binding / IPC [1] 702 µl Fourni avec le VetMAX™ PRRSV EU & NA 3.0 Kit. 2. Mélanger en retournant le tube ou la bouteille au moins 10 fois. (Facultatif) Conserver la solution Lysis / Binding / IPC à température ambiante pendant 24 heures maximum. 4 Préparer les échantillons selon le type d’échantillon. Préparation de l’échantillon Type d’échantillon • Sérum Action Procéder avec 200 µl d’échantillon. • Sang total • Fluides de soins a. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml : • tissu : 20 à 30 mg Tissu • PBS (1X), pH 7,4 : 1 ml ™ • PYREX Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) : 2 billes b. Broyer (les agiter avec les billes) les échantillons. ™ • Fisherbrand Bead Mill 24 Homogenizer : 6 m/s pendant 45 secondes • Mixer Mill MM 400 : 30 Hz pendant 5 minutes Remarque : Si un autre broyeur à billes est utilisé, voir “(Optionnel) Déterminer les paramètres optimaux du broyeur à billes” en page 5. c. Centrifuger à 1 000 x g pendant 1 minute. d. Procéder avec 100 μl de surnageant. 5 1. Retourner plusieurs fois le tube de mélange Beads / PK pour resuspendre les billes, puis ajouter 30 µl de mélange Beads / PK dans les puits appropriés de la plaque ou de la barrette de tubes. Combinaison de l’échantillon avec le mélange Beads / PK et la solution Lysis / Binding / IPC 2. Transférer le volume adéquat de chaque échantillon préparé dans un puits contenant le mélange Beads / PK. Type d’échantillon ™ Quantité Sérum, sang total ou fluides de soins 200 µl d’échantillon Tissu 100 µl de surnageant Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 7 5 Combinaison de l’échantillon avec le mélange Beads / PK et la solution Lysis / Binding / IPC (suite) 3. Mélanger l’échantillon avec le mélange Bead/PK pendant 2 minutes à température ambiante selon la méthode de votre choix. • Utilisation d’un agitateur de plaques : agiter vigoureusement pendant 2 minutes (voir “Déterminer le réglage maximal de l’agitateur de plaques” en page 5). • Par pipetage : homogénéiser par plusieurs aspiration-refoulement, puis incuber 2 minutes ™ à température ambiante. (Pour le traitement en aval sur l’instrument KingFisher mL, vous devez mélanger en pipetant.) 4. Ajouter 700 µl de solution Lysis / Binding / IPC dans chaque puits ou tube contenant un échantillon. 5. Procéder immédiatement au traitement des échantillons dans l’instrument (section suivante). 6 Traitement des échantillons dans l’instrument 1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 5). 2. Démarrer le test, puis placer les plaques ou barrettes de tubes préparées sur leur position lorsque l’instrument le demande. Conserver l’acide nucléique purifié sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Purification de l’ARN à partir de fluides oraux (méthode Complexe) 1 Préparation des plaques ™ ™ 1. Préparer les plaques sur l’instrument KingFisher Flex ou MagMAX Express-96. Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Volume par puits Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque. ID de la plaque [1] Position sur l’instrument. Remarque : Pour configurer les plaques ou les barrettes de tubes pour le traitement pour ™ ™ l’instrument KingFisher Duo Prime ou KingFisher mL, voir page 11. 2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées pour le traitement avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. 2 Préparation du mélange Bead/PK Nous vous recommandons de préparer un nouveau mélange Bead/PK à chaque série. Si nécessaire, vous pouvez stocker le mélange Bead/PK à 4°C pendant un maximum de 1 semaine. ™ 1. Vortexer vigoureusement les MagMAX CORE Magnetic Beads pour s’assurer que les billes sont complètement resuspendues. 2. Mélanger les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons plus 10 % d’excédent. Composant 8 Volume par échantillon MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 µl MagMAX™ CORE Proteinase K 10 µl Mélange Bead/PK total 30 µl ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 3 1. Combiner les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons plus 10 % d’excédent. Préparation de la solution Lysis / IPC Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Lysis Solution 450 µl 5 – IPC PRRS[1] 2 µl Volume total de la solution Lysis / IPC [1] 452 µl Fourni avec le VetMAX™ PRRSV EU & NA 3.0 Kit. 2. Mélanger en retournant le tube ou la bouteille au moins 10 fois. (Facultatif) Conserver la solution Lysis / IPC à température ambiante pendant 24 heures maximum. 4 1. Mélanger brièvement l’échantillon de fluides oraux, puis procéder avec 300 µl d’échantillon. Préparation du lysat clarifié 2. Ajouter la solution Lysis / IPC, puis clarifier le lysat. Équipement de traitement Traitement dans des tubes Action a. Pour chaque échantillon, ajouter 450 µl de solution Lysis / IPC dans un nouveau tube de 2 ml. b. Ajouter 300 µl d’échantillon à la solution Lysis / IPC. c. Vortexer vigoureusement pendant 3 minutes. d. Centrifuger à 15 000 × g pendant 2 minutes. e. Procéder avec 600 μl de surnageant (lysat clarifié). Attention à ne pas perturber le culot. Traitement sur des plaques a. Pour chaque échantillon, ajouter 450 µl de solution Lysis / IPC dans les puits adéquats d’une plaque deep well. b. Ajouter 300 µl d’échantillon à la solution Lysis / IPC. c. Sceller la plaque avec une feuille adhésive. d. Agiter la plaque à une vitesse modérée pendant 5 minutes. e. Centrifuger à 3 000 × g pendant 5 minutes. f. Procéder avec 600 μl de surnageant (lysat clarifié). Attention à ne pas perturber le culot. 5 1. Retourner plusieurs fois le tube de mélange Bead/PK pour resuspendre les billes, puis ajouter 30 µl de mélange Bead/PK dans les puits requis de la plaque ou de la barrette de tubes. Mélange du lysat clarifié avec le mélange Bead/PK et MagMAX™ CORE Binding Solution 2. Transférer 600 µl de chaque échantillon de lysat clarifié (voir “Préparation du lysat clarifié” en page 9) dans un puits contenant le mélange Bead/PK. 3. Mélanger l’échantillon avec le mélange Bead/PK pendant 2 minutes à température ambiante selon la méthode de votre choix. • Utilisation d’un agitateur de plaques : agiter vigoureusement pendant 2 minutes (voir “Déterminer le réglage maximal de l’agitateur de plaques” en page 5). • Par pipetage : homogénéiser par plusieurs aspiration-refoulement, puis incuber 2 minutes ™ à température ambiante. (Pour le traitement en aval sur l’instrument KingFisher mL, vous devez mélanger en pipetant.) ™ 4. Ajouter 350 µl de MagMAX CORE Binding Solution. 5. Procéder immédiatement au placement des échantillons dans l’instrument (section suivante). 6 1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 5). Traitement des échantillons dans l’instrument 2. Démarrer le test, puis placer les plaques ou barrettes de tubes préparées sur leur position lorsque l’instrument le demande. ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 9 6 Traitement des échantillons dans l’instrument (suite) Conserver l’acide nucléique purifié sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Purification de l’ARN à partir de semences 1 Préparation des plaques ™ ™ 1. Préparer les plaques sur l’instrument KingFisher Flex ou MagMAX Express-96. Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Volume par puits Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque. ID de la plaque [1] Position sur l’instrument. Remarque : Pour configurer les plaques ou les barrettes de tubes pour le traitement pour ™ ™ l’instrument KingFisher Duo Prime ou KingFisher mL, voir page 11. 2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées pour le traitement avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. 2 Préparation du mélange PK Remarque : Préparer le mélange PK immédiatement avant utilisation. 1. Combiner les composants suivants (dans l’ordre indiqué) pour le nombre requis d’échantillons, plus 10 % d’excédent (recommandé). Composant Volume par échantillon PBS (1X), pH 7,4 200 μl MagMAX™ CORE Proteinase K 10 μl Mélange PK total 210 μl 2. Retourner plusieurs fois le tube pour mélanger, puis centrifuger brièvement pour recueillir le contenu. 3 Préparation de l’échantillon ™ 1. Ajouter un volume de semences (voir tableau ci-dessous) et 400 µl de MagMAX CORE Lysis Solution dans un microtube propre de 2 ml. Type d’échantillon Quantité Semences fraîches ou congelées 300 µl d’échantillon Semences commerciales Volume recommandé par le fournisseur 2. Vortexer vigoureusement pendant 1 minute. 3. Passer immédiatement à l’étape suivante. 4 10 Traitement des échantillons avec le mélange PK Suivre cette procédure dans des tubes individuels pour éviter la contamination. Ne pas utiliser de plaques. ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 4 Traitement des échantillons avec le mélange PK (suite) 1. Ajouter 210 µl de mélange PK directement au lysat. 2. Vortexer vigoureusement pendant 1 minute puis centrifuger brièvement pour recueillir le contenu. 3. Incuber l’échantillon pendant 30 minutes à 70°C. 4. Centrifuger à 15 000 × g pendant 2 minutes. 5 1. Transférer 600 μl de chaque lysat d’échantillon dans les puits appropriés de la plaque d’échantillons ou la barrette de tubes. Combiner les échantillons avec le mélange Binding / Beads / IPC ™ 2. Bien vortexer les MagMAX CORE Magnetic Beads afin que toutes les billes soient remises en suspension. 3. Préparer le mélange Binding / Beads / IPC : combiner les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons, plus 10 % d’excédent (recommandé). Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Binding Solution 400 µl MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 μl 5 - IPC PRRS[1] 2 μl Mélange de Binding / Beads / IPC total [1] 422 µl Inclus dans le VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit. ™ 4. Homogénéiser le mélange Binding / Beads / IPC par retournement jusqu’à ce que la solution soit homogène, puis ajouter 420 μl du mélange Binding / Beads / IPC dans chaque échantillon. 5. Procéder immédiatement au traitement des échantillons dans l’instrument (section suivante). 6 1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 5). Traitement des échantillons dans l’instrument 2. Démarrer le test, puis placer les plaques ou barrettes de tubes préparées sur leur position lorsque l’instrument le demande. Conserver l’acide nucléique purifié sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR • Porter des gants et une blouse de laboratoire propres. – Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux précédemment portés pour manipuler des produits amplifiés ou préparer des échantillons. • Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à leur contamination possible. • Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des fournitures dédiés pour les étapes suivantes : – Préparation des échantillons et configuration de la réaction. – Amplification et analyse des produits. • Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone pré-PCR de la réaction. • Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute projection ou création d’aérosols. • Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure du possible. • Utiliser une pipette à piston ou des embouts de pipette résistant aux aérosols. • Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une solution de décontamination ADN. ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 11 Annexe A Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL Matériels requis non fournis Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. Tableau 6 Matériels requis pour le traitement dans l’instrument KingFisher™ Duo Prime Article Source KingFisher™ Duo Prime Purification System 5400110 Pack KingFisher™ Combi pour plaque de microtitration deep well 96 (comprend 8 plaques, 8 peignes et 8 barrettes d’élution et bouchons) 97003530 (pour Duo Prime uniquement) Barrette d’élution KingFisher™ pour aimant à 12 positions (pour Duo Prime uniquement) (40 pièces)[1] Peigne à 12 pointes KingFisher pour plaque deep well 96 (pour Duo Prime uniquement) (50 ™ 97003520 pièces)[1] 97003500 Plaque deep well 96 KingFisher™, stérile (pour Duo Prime, Flex et Presto)[1] [1] 95040460 Inclus dans le pack KingFisher Combi (N° Cat. 97003530). ™ Tableau 7 Matériels requis pour le traitement avec l’instrument KingFisher™ mL Source Article KingFisher™ mL Purification System 5400050 KingFisher mL Tubes et peignes (pour 240 échantillons) 97002141 KingFisher™ mL Peigne (800 unités) 97002111 KingFisher mL Tube (20 x 45 unités) 97002121 ™ ™ Procédure de purification ™ Remarque : Pour la réalisation de cette procédure pour un traitement sur l’instrument KingFisher mL, mélanger les échantillons par aspiration-refoulement. Ne pas utiliser d’agitateur de plaques avec les barrettes de tubes requises par l’instrument. 1. Suivre la méthode adaptée à votre type d’échantillon, de la préparation du lysat d’échantillon au mélange des échantillons avec les billes et la solution de lyse. Remarque : Ne pas préparer les plaques ou les tubes pour le traitement avant d’avoir préparé les échantillons. 12 ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit ™ ™ 2. Ajouter les MagMAX CORE Wash Solutions et MagMAX CORE Elution Buffer aux positions indiquées, selon votre instrument. Placer le peigne et toutes les plaques ou les barrettes de tubes au même moment. L’instrument ne vous invite pas à placer les éléments individuellement. Tableau 8 Plan de plaque : Instrument KingFisher™ Duo Prime ID de la ligne Ligne sur la plaque Type de plaque Réactif Volume par puits Échantillon A Deep Well Lysat d’échantillon / mélange Beads Varie selon l’échantillon Lavage 1 B MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 C MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution[1] Barrette de tubes séparée[2] Barrette d’élution MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne H Deep Well [1] [2] Placer un peigne protecteur dans la plaque. S’assurer que la barrette d’élution est placée dans le bon sens dans le bloc d’élution. Placée sur l’élément chauffant. Tableau 9 Configuration de la barrette de tubes : Instrument KingFisher™ mL ID de la position Position de la barrette de tubes Tube Réactif Volume par puits Échantillon 1 Standard Lysat d’échantillon / mélange Beads Varie selon l’échantillon Lavage 1 2 MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 3 MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne N/A N/A Glisser le peigne dans le support pour peigne. 3. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 5). 4. Démarrer le test, puis placer les plaques ou barrettes de tubes préparées sur leur position lorsque l’instrument le demande. Conserver l’acide nucléique purifié sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Annexe B Documentation et support Assistance à la clientèle et support technique Visiter thermofisher.com/support pour obtenir les informations les plus récentes sur les services et le support. • Numéros de téléphone de contact internationaux • Informations sur le support produit – FAQ relatives aux produits – Logiciels, correctifs et mises à jour – Formations sur de nombreux instruments et applications • Commandes et assistance en ligne • Documentation produit – Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles – Certificats d’analyse – Fiches de données de sécurité (FDS) Remarque : Pour obtenir les FDS relatives aux réactifs et produits chimiques d’autres fabricants, contacter ces derniers. Garantie limitée du produit Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l’adresse web suivante : www.thermofisher.com/support. ™ Guide complémentaire du VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit 13 Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils – Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – France Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition. Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN0029145 A.0 . Historique des révisions : Pub. nº MAN0029145 A.0 Révision A.0 Date 13 septembre 2023 Description ™ Nouveau document pour VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit. Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2023-2024 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 4 janvier 2024 ">
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