GUIDE COMPLEMENTAIRE VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Protocoles de purification d'acides nucléiques En association avec la Référence Catalogue PPRP50 Partie Nº 100021181 Pub. Nº MAN0008852 Rév. B.0 Espèce(s) Isolation des acides nucléiques à partir des matrices Test Petits ruminants (ovins et caprins) Sang Organes Ecouvillons oculaires et nasaux Individuel Sommaire Purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques ............................................................................... 2 Contenu de ce manuel.................................................................................................................................................................................. 2 Choix des échantillons ................................................................................................................................................................................. 2 Conservation des échantillons ..................................................................................................................................................................... 2 Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fournis dans le kit ............................................................................................................. 3 Protocoles d’extraction de l’ARN ................................................................................................................................................................. 3 Extraction de l’ARN ......................................................................................................................................................... 4 Préparation des échantillons avant extraction ........................................................................................................................................... 4 Extraction avec le QIAamp™ Viral RNA Mini Kit ........................................................................................................................................... 4 Extraction avec le kit NucleoSpin™ RNA Virus ............................................................................................................................................ 5 Extraction avec le RNeasy™ Mini Kit ............................................................................................................................................................ 6 Extraction avec le kit NucleoSpin™ RNA ...................................................................................................................................................... 7 Documentation et support ............................................................................................................................................... 8 Service clientèle et assistance technique ................................................................................................................................................... 8 Garantie produit limitée ............................................................................................................................................................................... 8 AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Pour usage en laboratoire. Purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques Contenu de ce manuel Ce manuel a pour objectif de présenter des protocoles de purification des ARN viraux du virus de la Peste des Petits Ruminants compatibles avec Applied Biosystems™ VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit. Choix des échantillons Matrice Type d’analyse Quantité requise et matériel de prélèvement Sang total Individuelle 100 µL de sang prélevé en tube EDTA Organe Individuelle 20 à 30 mg d’organe (poumon, rate, intestin, ganglions lymphatiques) Ecouvillon nasal et oculaire Individuelle Ecouvillon stérile Conservation des échantillons Il est nécessaire de s’assurer de la qualité des échantillons avant leur entrée dans le processus analytique. Sang total Le sang doit avoir été impérativement prélevé sur tube EDTA. Suite au prélèvement, maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation, dans un délai maximum de 4 jours après prélèvement. Après utilisation ou passé le délai de 4 jours, congeler en dessous de −16°C pour conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 an. Ecouvillons Suite au prélèvement, maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation, dans un délai maximum de 4 jours après prélèvement. Après élution de l’écouvillon, utiliser directement l’éluât pour réaliser la PCR. Congeler le reste d’éluât en dessous de −16°C pour conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 an. Organes Suite au prélèvement, selon le cas de figure : • Si l’analyse est effectuée dans les 24 heures suivant le prélèvement : maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation. • Si l’analyse est effectuée au-delà des 24 heures suivant le prélèvement : congeler en dessous de −16°C jusqu’à utilisation. Dans les deux cas, après utilisation ou passé le délai de 24 heures, congeler en dessous de −16°C pour conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 an. 2 VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Guide Complémentaire Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fournis dans le kit Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. Matériel et réactifs nécessaires à la préparation des échantillons pour analyse • Poste de sécurité microbiologique (PSM) de type II • Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre • Un vortex ou équivalent • Une centrifugeuse pour microtubes de 1.5 mL et 2 mL • Balance de précision • Microtubes DNase/RNase-free de 1.5 mL et 2 mL • Tampon PBS 1X • Eau DNase/RNase-free Kits, réactifs et matériels pour l’extraction et la purification des ARN des échantillons Tous les matériels et réactifs requis pour la préparation des échantillons pour analyse sont susceptibles d’être utilisés pour cette étape. S’assurer en plus de disposer des éléments suivants : • Ethanol 96–100% ou éthanol 70% selon l’extraction réalisée • Extraction manuelle sur colonnes de silice en format individuel : – QIAamp™ Viral RNA Mini Kit (QIAGEN™) ou NucleoSpin™ RNA Virus (MACHEREY-NAGEL) – RNeasy™ Mini Kit + QIAshredder Spin Column (QIAGEN™) ou NucleoSpin™ RNA (MACHEREY-NAGEL) – Une centrifugeuse pour microtubes Protocoles d’extraction de l’ARN Kits d’extraction recommandés Sang Ecouvillons oculaires et nasaux QIAamp™ Viral RNA Mini Kit Organes et tissus (poumon, rate, intestin, ganglions lymphatiques) RNeasy™ Mini Kit VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Guide Complémentaire NucleoSpin™ RNA Virus NucleoSpin™ RNA 3 Extraction de l’ARN Préparation des échantillons avant extraction Sang total prélevé en tube EDTA Le sang total prélevé sur tube EDTA est utilisable directement, sans préparation préalable à l’extraction. L’extraction nécessite 100 µL de sang pour l’extraction. Organes 1. Disséquer finement le morceau d'organe dans une boîte de Pétri stérile à l’aide de pinces et bistouri stériles. 2. Dans un microtube de 1.5 mL, peser 20 à 30 mg de l’organe préalablement disséqué à l’aide d’une balance de précision. 3. L’extraction sera directement réalisée à partir de 20 à 30 mg de l’organe finement disséqué. Ecouvillons 1. Eluer l’écouvillon avec du PBS 1X selon une des méthodes suivantes : – Soit déposer directement 1 mL de PBS 1X sur l’écouvillon placé dans son tube de transport. – Soit placer l’écouvillon dans un microtube (après en avoir coupe la tige pour permettre la fermeture du tube) et le recouvrir de 1 mL de PBS 1X. 2. Vortexer l’écouvillon dans le PBS 1X. 3. Enlever l’écouvillon en l’écrasant sur la paroi du tube pour bien l’essorer. L’extraction sera effectuée à partir de 200 µL d’éluât. Prélever le reste du volume disponible, le déposer dans un tube de stockage adéquat et stocker en dessous de −16°C. Extraction avec le QIAamp™ Viral RNA Mini Kit Avant de commencer • Reconstitution du Buffer AVL+Carrier : À réaliser selon les recommandations du fournisseur. • Reconstitution Buffer AW1 et AW2 : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la première utilisation. • Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins négatifs et positifs). Protocole 1. Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous : Solution de lyse Prise d’essai (1) Sang Ecouvillons NCS 560 µL d’AVL+Carrier 560 µL d’AVL+Carrier 560 µL d’AVL+Carrier 100 µL de sang 140 µL d’éluât d’écouvillon 100 ou 140 µL d’eau DNase/RNase-free(1) Ajuster le volume en fonction des échantillons traités en parallèle. 2. Vortexer immédiatement pendant 15 secondes. 3. Incuber 10 minutes à température ambiante. 4. Ajouter dans chaque tube 560 µL d’éthanol 96–100% - Homogénéiser par aspiration-refoulement (10 à 15 fois) - Centrifuger rapidement le tube avant ouverture. On obtient le lysat de l’échantillon. 5. Prendre une mini-colonne du QIAamp™ Viral RNA Mini Kit - Identifier la colonne. 6. Transférer 630 µL du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 10000 × g - Jeter le tube collecteur Conserver la colonne. 7. Transférer le reste du lysat de l’échantillon sur la même colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 10000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 8. Distribuer 700 µL de buffer AW1 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 15 secondes à 10000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 9. Distribuer 700 µL de buffer AW2 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 15 secondes à 10000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 10. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 1 minute à 13000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 11. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 60 µL de buffer AVE – Boucher. 12. Incuber 1 minute à température ambiante. 13. Centrifuger 1 minute à 8000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube. Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C. 4 VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Guide Complémentaire Extraction avec le kit NucleoSpin™ RNA Virus Avant de commencer • Reconstitution du Buffer RAV1+Carrier : A réaliser selon les recommandations du fournisseur. • Reconstitution Buffer RAV3 : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la première utilisation. • Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins négatifs et positifs). Protocole 1. Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous : Solution de lyse Prise d’essai (1) Sang Ecouvillons NCS 600 µL de RAV1+Carrier 600 µL de RAV1+Carrier 560 µL de RAV1+Carrier 100 µL de sang 140 µL d’éluât d’écouvillon 100 ou 140 µL d’eau DNase/RNase-free(1) Ajuster le volume en fonction des échantillons traités en parallèle. 2. Vortexer immédiatement pendant 15 secondes. 3. Incuber 10 minutes à température ambiante. 4. Ajouter dans chaque tube 600 µL d’éthanol 96–100% - Homogénéiser par aspiration-refoulement (10 à 15 fois) - Centrifuger rapidement le tube avant ouverture. On obtient le lysat de l’échantillon. 5. Prendre une mini-colonne du kit NucleoSpin™ RNA Virus - Identifier la colonne. 6. Transférer 650 µL du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 10000 × g - Jeter le tube collecteur Conserver la colonne. 7. Transférer le reste du lysat de l’échantillon sur la même colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 10000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 8. Distribuer 500 µL de buffer RAW dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 15 secondes à 10000 × g - Jeter le tube collecteur Conserver la colonne. 9. Distribuer 600 µL de buffer RAV3 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 15 secondes à 10000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 10. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 1 minute à 13000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 11. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 60 µL d’eau DNase/RNase-free - Boucher. 12. Incuber 1 minute à température ambiante. 13. Centrifuger 1 minute à 8000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube. Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C. VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Guide Complémentaire 5 Extraction avec le RNeasy™ Mini Kit Note Le protocole décrit ci-dessous est applicable sans utilisation de β-mercaptoethanol. Avant de commencer • Reconstitution Buffer RPE : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la première utilisation. • Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins négatifs et positifs). Protocole 1. Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous : Échantillon pour analyse NCS Solution de lyse 600 µL de RLT 600 µL de RLT Prise d’essai 20 à 30 mg d’organe 50 µL d’eau RNase/DNase-free 2. Vortexer immédiatement pendant 1 minute. 3. Transférer le contenu du microtube sur une colonne QIAshredder (QIAGEN™) - Centrifuger 2 minutes à 15000 × g - Jeter la colonne - Conserver le tube collecteur. 4. Ajouter dans chaque tube 600 µL d’éthanol 70% - Homogénéiser en pipetant 4 à 5 fois - Ne pas centrifuger. On obtient le lysat de l’échantillon. 5. Prendre une mini-colonne du RNeasy™ Mini Kit - Identifier la colonne. 6. Transférer 700 µL du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 10000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 7. Transférer le reste du lysat de l’échantillon sur la même colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 10000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 8. Distribuer 700 µL de buffer RW1 dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 10000 × g - Jeter le tube collecteur Conserver la colonne. 9. Distribuer 700 µL de buffer RPE (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 10000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 10. Distribuer 500 µL de buffer RPE (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 10000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 11. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 1 minute à 13000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 12. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 50 µL d’eau DNase/RNase-free - Boucher. 13. Incuber 1 minute à température ambiante. 14. Centrifuger 1 minute à 8000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube. Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C. 6 VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Guide Complémentaire Extraction avec le kit NucleoSpin™ RNA Note Le protocole décrit ci-dessous est applicable sans utilisation de β-mercaptoethanol. Avant de commencer • Reconstitution Buffer RA3 : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la première utilisation. • Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins négatifs et positifs). Protocole 1. Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous : Solution de lyse Prise d’essai Échantillon pour analyse NCS 350 µL de RA1 350 µL de RA1 20 à 30 mg d’organe 50 µL d’eau RNase/DNase-free 2. Vortexer immédiatement pendant 1 minute. 3. Transférer le contenu du microtube sur une colonne NucleoSpin™ Filter - Centrifuger 1 minute à 11000 × g - Jeter la colonne Conserver le tube collecteur. 4. Ajouter dans chaque tube 350 µL d’éthanol 70% - Homogénéiser en pipetant 4 à 5 fois - Ne pas centrifuger. On obtient le lysat de l’échantillon. 5. Prendre une mini-colonne du kit NucleoSpin™ RNA - Identifier la colonne. 6. Transférer 700 µL du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 11000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 7. Distribuer 200 µL de buffer RA2 dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 11000 × g - Jeter le tube collecteur Conserver la colonne. 8. Distribuer 600 µL de buffer RA3 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 30 secondes à 11000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 9. Distribuer 250 µL de buffer RA3 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 2 minutes à 11000 × g - Jeter le tube collecteur - Conserver la colonne. 10. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 50 µL d’eau DNase/RNase-free - Boucher. 11. Incuber 1 minute à température ambiante. 12. Centrifuger 1 minute à 8000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube. Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C. VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Guide Complémentaire 7 Documentation et support Service clientèle et assistance technique Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique, notamment : • Numéros de téléphone partout dans le monde • Commande et Support web • Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles • Certificats d’analyse • Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques)) Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant. Garantie produit limitée Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support. Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Historique des révisions : Pub. N° MAN0008852 (français) Révision Date B.0 23 mai 2017 A.0 31 mars 2014 Description Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos. Base de référence pour l’historique de révision Personne morale : Life Technologies Corporation | Carlsbad, CA 92008 États-Unis | Numéro gratuit aux États-Unis 1 800 955 6288 ©2017 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. 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