GUIDE COMPLÉMENTAIRE VetMAX™ Porcine Parvovirus Kit Protocoles de purification de l’acide nucléique pour une utilisation avec le kit (Réf. PPVP50) Pub. nº MAN0008856 Rév. C Espèces Type d’échantillon Type de test Sérum, plasma Liquides amniotiques Porcins Organes Individuel Semences Cultures cellulaires AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de protection, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse suivante : thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUE BIOLOGIQUE. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit disponibles sur thermofisher.com. Suivre toutes les réglementations du travail avec des échantillons biologiques locales, nationales et/ou communautaires en vigueur. ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ Objectif de ce guide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Sélection de l’échantillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Conservation des échantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Matériel requis, mais non fourni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Instructions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Choix du mode opératoire approprié . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Purifier de l’ADN avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Purification de l’ADN avec le QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Purification de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Annexe A Purification de l’acide nucléique avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL ■ ■ Matériels requis non fournis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Procédure de purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Annexe B Documentation et support ■ ■ Assistance à la clientèle et support technique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Garantie limitée du produit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Pour usage en laboratoire. Objectif de ce guide Ce guide décrit les protocoles de purification de l’acide nucléique s’appliquant aux échantillons (sérum, plasma, liquides amniotiques, ™ organes, semences et cultures cellulaires). Les méthodes ont été validées et optimisées pour une utilisation avec le Applied Biosystems ™ VetMAX Porcine Parvovirus Kit (réf. PPVP50). ™ ™ • La purification automatisée de l’acide nucléique est réalisée à l’aide de l’un des instruments suivants : KingFisher Flex, MagMAX ™ ™ Express-96, KingFisher mL ou KingFisher Duo Prime. • La purification manuelle de l’acide nucléique utilise des colonnes de centrifugation à base de silice. Sélection de l’échantillon Type d’échantillon Type d’analyse Quantité requise Individuel 100–200 μl[1] Liquide amniotique Individuel 140 µl Organes Individuel 20–25 mg Semences Individuel 140–300 µl Cultures cellulaires Individuel 140 μl Sérum (dans des tubes secs) Plasma [1] La quantité requise dépend du mode opératoire de purification utilisé. Conservation des échantillons Type d’échantillon Sérum (dans un tube sec) Plasma Semences Conservation Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours maximum). Après utilisation ou expiration du délai de 8 jours, conserver les échantillons en dessous de −16°C pendant 1 an au maximum ou en dessous de −70°C pour une conservation à long terme. Conserver les échantillons selon le type de semences à tester : • Pour les semences fraîches, conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours maximum). • Pour les semences commerciales, conserver les échantillons selon les recommandations du fournisseur. Organes Après l’échantillonnage, conserver les échantillons entre 2°C et 8°C si l’analyse est effectuée dans les 24 heures suivant le prélèvement. Après utilisation ou à expiration du délai de 24 heures, conserver les échantillons en dessous de −16°C pour une conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de −70°C pour une conservation à long terme. Liquide amniotique Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 7 jours maximum). Après utilisation ou expiration du délai de 7 jours, conserver les échantillons en dessous de −16°C pendant 1 an au maximum ou en dessous de −70°C pour une conservation à long terme. Cultures cellulaires Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours maximum). Après utilisation ou expiration du délai de 8 jours, conserver les échantillons en dessous de −16°C pendant 1 an au maximum ou en dessous de −70°C pour une conservation à long terme. 2 ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit Matériel requis, mais non fourni Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. "PFL" indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. Les références catalogue qui s’affichent sous forme de liens ouvrent les pages Web de ces produits. Tableau 1 Matériel requis pour la préparation et la purification des échantillons Article Source Instrument, l’un des suivants : KingFisher™ Flex Purification System Contacter votre représentant commercial. KingFisher™ Apex Purification System MagMAX™ Express‑96 Magnetic Particle Processor KingFisher™ Duo Prime Purification System KingFisher™ mL Purification System Équipement Poste de sécurité microbiologique de type II (PSMII) PFL Centrifugeuse de paillasse pouvant atteindre 15 000 × g (pour tubes de 1,5 ml et 2 ml) PFL Agitateur de laboratoire, vortex ou équivalent PFL Bloc chauffant jusqu’à 70°C PFL Micropipettes de précision ajustables (gamme de 1 µl à 1 000 µl) PFL Consommables Consommables pour les instruments KingFisher™ Flex et MagMAX™ Express-96 : • KingFisher™ 96 Deep-Well Plate • 95040450 • KingFisher 96 KF microplates • 97002540 • KingFisher™ 96 tip comb for deep-well magnets • 97002534 Consommables pour l’instrument KingFisher™ Apex : • Peigne 96 PCR KingFisher™ Apex • 97002560 ™ • KingFisher Apex 96 Combi tip comb • 97002570 • Plaque deep well à 96 puits KingFisher™ • 95040450B ™ Consommables pour les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL Voir Tableau 8 en page 15. Embouts de pipettes résistant aux aérosols, sans nucléase PFL Tubes sans nucléase de 1,5 ml et 2,0 ml PFL Réservoir de réactifs PFL (Facultatif)Adhesive PCR Plate Foils, ou équivalent AB0626 Kits et réactifs MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit Eau exempte de nucléases (pour les échantillons de contrôle négatif d’extraction) Solution saline tamponnée au phosphate (PBS (1X), pH 7.4) ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit A32700 ou A32702 AM9932 PFL 3 Tableau 2 Matériel supplémentaire nécessaire pour la purification manuelle de l’acide nucléique Article Source Kits et réactifs L’un des kits suivants : • QIAamp™ DNA Mini Kit • Qiagen 51304 • Kit NucleoSpin™ Tissue • Macherey Nagel 740952 Éthanol à 96–100 % MLS Tableau 3 Matériel supplémentaire requis pour la préparation des échantillons d’organes Article Source Équipement Balance de précision PFL Scalpels et pinces métalliques (stériles) PFL Consommables Boîte de Petri (stérile) PFL Instructions • Préparer au moins un contrôle négatif d’extraction (NEC). Utiliser du PBS ou de l’eau exempte de nucléases à la place de l’échantillon testé, sauf indication contraire. Traiter le NEC en même temps que les échantillons testés, en utilisant le même protocole de purification de l’acide nucléique. • Du matériel provenant d’un autre fournisseur de matériel de laboratoire peut être utilisé. Choix du mode opératoire approprié Tableau 4 Modes opératoires de purification par type d’échantillon et par kit de purification Type d’échantillon Sérum Plasma MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle) Kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle) Mode opératoire Simple (sans incubation thermique) Mode opératoire pour le type d’échantillon liquide Mode opératoire pour le type d’échantillon liquide Mode opératoire Incubation–Plus Organes Mode opératoire Incubation–Plus Mode opératoire pour les organes Mode opératoire pour les organes Semences Mode opératoire Incubation–Plus Mode opératoire pour le type d’échantillon liquide Mode opératoire pour le type d’échantillon liquide Liquide amniotique Non testé[1] Mode opératoire pour le type d’échantillon liquide Mode opératoire pour le type d’échantillon liquide Cultures cellulaires Non testé[1] Mode opératoire pour le type d’échantillon liquide Mode opératoire pour le type d’échantillon liquide [1] Contacter le service d’assistance local ou envoyer un e-mail à l’adresse [email protected] pour obtenir plus d’informations sur ce type d’échantillon spécifique et l’application pour les agents pathogènes. Purifier de l’ADN avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) Suivre cette procédure si les instruments suivants sont utilisés : ™ • KingFisher Flex ™ • KingFisher Apex ™ • MagMAX Express-96 Suivre l’Annexe A, “Purification de l’acide nucléique avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL” en cas d’utilisation des instruments suivants : ™ • KingFisher Duo Prime 4 ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit ™ • KingFisher mL Instructions • Avant utilisation, retourner les bouteilles de solutions et de tampons pour bien les mélanger. • Pour éviter toute contamination croisée : – Couvrir la plaque ou la barrette de tubes pendant les étapes d’incubation et d’agitation, pour éviter tout débordement. – Pipetter avec précaution les réactifs et les échantillons pour éviter les éclaboussures. • Pour éviter toute contamination par les nucléases : – Porter des gants de laboratoire pendant les procédures. Les gants vous protègent des réactifs, et ils protègent les acides nucléiques des nucléases présentes sur la peau. – Utiliser des embouts de pipettes exempts des acides nucléiques pour manipuler les réactifs, et éviter de mettre des embouts utilisés dans les récipients de réactifs. – Décontaminer les paillasses de laboratoire et les pipettes avant de commencer. Avant la première utilisation du kit (Optionnel) Déterminer les paramètres optimaux du broyeur à billes ™ Nous recommandons l’utilisation de Fisherbrand Bead Mill 24 Homogenizer pour un rendement maximal en acides nucléiques. Si un autre instrument est utilisé, suivre les directives du fournisseur pour déterminer les paramètres de vitesse et de temps pour obtenir une lyse de cellules suffisante. 1 Si un agitateur de plaques est utilisé, suivre les étapes suivantes pour déterminer le réglage maximal. Déterminer le réglage maximal de l’agitateur de plaques 1. Vérifier que la plaque est bien fixée sur l’agitateur. 2. Ajouter 1 ml d’eau dans chaque puits de la plaque, puis couvrir avec une feuille adhésive. 3. Déterminer le réglage maximal qu’il est possible d’utiliser avec l’agitateur afin d'éviter les projections d'eau sur la feuille adhésive. 2 Utiliser le tableau suivant pour sélectionner le script approprié. Choix du script approprié Tableau 5 Scripts recommandés et alternatifs par type d’échantillon Nom du script Type d’échantillon Sérum Script standard Script standard Script express (avec étape d’élution chauffée) (sans étape d’élution chauffée) (sans étape d’élution chauffée) Recommandé Recommandé Organes Recommandé Autre possibilité Semences Autre possibilité Recommandé Plasma ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit 5 3 Téléchargement et installation du script ™ Le script approprié au MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit doit être installé sur l’instrument avant sa première utilisation. ™ IMPORTANT ! En cas d’utilisation de l’instrument KingFisher Apex, contacter le support technique pour télécharger le script. ™ 1. Sur la page produit du MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit sur Internet (sur thermofisher.com, effectuer une recherche à partir de la référence catalogue), aller dans la section Documents. 2. Trouver et télécharger la dernière version du script MagMAX_CORE pour votre instrument. Tableau 6 Scripts pour l’instrument Nom du script Script standard Script standard Script express (avec étape d’élution chauffée) (sans étape d’élution chauffée) (sans étape d’élution chauffée) MagMAX_CORE_Heated_v1. kfx MagMAX_CORE_non_Heated_ v1.kfx MagMAX_CORE_Apex_Expres s.kfx MagMAX_CORE_Flex.bdz MagMAX_CORE_Flex_no_hea t.bdz MagMAX_CORE_Flex_Expres s.bdz MagMAX_CORE_KF-96.bkf2 MagMAX_CORE_KF-96_no_he at.kf2 MMC_KF96_Express.kf2 KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO.bdz MagMAX_CORE_DUO_no_heat .bdz MagMAX_CORE_DUO_Express .bdz KingFisher™ mL N/A MagMAX_CORE_mL_no_heat. bdz MagMAX_CORE_mL_Express. bdz Instrument KingFisher™ Apex KingFisher™ Flex KingFisher™ 96 MagMAX™ Express-96 3. Consulter le guide de l’utilisateur de votre instrument ou contacter le support technique pour obtenir les instructions sur l’installation du script. 4 Préparation de l’échantillon Préparer les échantillons selon le type d’échantillon et le mode opératoire recommandé. Type d’échantillon Sérum Plasma Méthode recommandée Mode opératoire Simple (sans incubation thermique) Procéder avec 200 µl d’échantillon. Mode opératoire Incubation–Plus Procéder avec 100 µl d’échantillon. Mode opératoire Incubation–Plus Hacher finement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide d’une pince et d’un scalpel stériles. Procéder avec 20–25 mg d’échantillon. Mode opératoire Incubation–Plus Procéder avec 300 µl d’échantillon. Organes Semences Liquide amniotique Non testé[1] Cultures cellulaires Non testé[1] [1] 6 Action Contacter le service d’assistance local ou envoyer un e-mail à l’adresse [email protected] pour obtenir plus d’informations sur ce type d’échantillon spécifique et l’application pour les agents pathogènes. ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit Purification de l’ADN à partir de sérum et de plasma (mode opératoire Simple) 1 ™ ™ 1. Préparer les plaques sur l’instrument KingFisher Flex ou MagMAX Express-96. Préparation des plaques de traitement Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Volume par puits Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque. ID de la plaque [1] Position sur l’instrument. Remarque : Pour configurer les plaques ou les barrettes de tubes pour le traitement pour ™ ™ l’instrument KingFisher Duo Prime ou KingFisher mL, voir page 15. 2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées pour le traitement avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. 2 Préparation du mélange Beads/PK Nous vous recommandons de préparer un nouveau mélange Beads/PK à chaque série. Si nécessaire, vous pouvez stocker le mélange Beads/PK à 4°C pendant un maximum de 1 semaine. ™ 1. Vortexer soigneusement les MagMAX CORE Magnetic Beads afin que toutes les billes soient resuspendues. 2. Combiner les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons, plus jusqu’à 10 % d’excédent (recommandés). Composant 3 Volume par échantillon MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 µl MagMAX™ CORE Proteinase K 10 µl Mélange Beads/PK total 30 µl 1. Combiner les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons, plus jusqu’à 10 % d’excédent (recommandé). Préparation de la solution Lysis/Binding Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Lysis Solution 350 µl MagMAX™ CORE Binding Solution 350 µl Solution Lysis/Binding totale 700 µl 2. Mélanger en retournant le tube ou la bouteille au moins 10 fois. 4 1. Retourner plusieurs fois le tube de mélange Beads/PK pour resuspendre les billes, puis ajouter 30 µl de mélange Beads/PK dans les puits appropriés de la plaque ou de la barrette de tubes. Mélange de l’échantillon avec le mélange Beads/PK et la solution Lysis/Binding 2. Transférer le volume adéquat de chaque échantillon préparé dans un puits contenant le mélange Beads/PK. Type d’échantillon Sérum Quantité 200 µl d’échantillon Plasma ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit 7 4 (suite) 3. Mélanger l’échantillon avec le mélange Beads/PK pendant 2 minutes à température ambiante selon la méthode de votre choix. • Utilisation d’un agitateur de plaques : agiter vigoureusement pendant 2 minutes (voir “Déterminer le réglage maximal de l’agitateur de plaques” en page 5). • Par pipetage : homogénéiser par plusieurs aspiration-refoulement, puis incuber 2 minutes ™ à température ambiante. (Pour le traitement en aval sur l’instrument KingFisher mL, vous devez mélanger en pipetant.) 4. Ajouter 700 µl de solution Lysis/Binding dans chaque puits ou tube contenant un échantillon. ™ (Les barrettes de tubes sont uniquement utilisées avec l’instrument KingFisher mL.) 5. Procéder immédiatement à la mise en place des échantillons sur l’instrument (section suivante). 5 Traitement des échantillons dans l’instrument 1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Choix du script approprié” en page 5 et “Téléchargement et installation du script” en page 6). 2. Démarrer le test, puis placer les plaques préparées dans la position appropriée lorsque l’instrument vous invite à le faire. Conserver les acides nucléiques purifiés sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Purification de l’ADN à partir d’échantillons de sérum, de plasma, de semences et d’organes (mode opératoire Incubation–Plus) 1 Préparation des plaques pour le traitement 1. Préparer les plaques de traitement. Tableau 7 Configuration de la plaque : instrument MagMAX™ Express-96 ou KingFisher™ Flex Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard ID de la plaque [1] Volume par puits Placer un peigne dans la plaque. Position sur l’instrument. Remarque : Pour configurer les plaques ou les barrettes de tubes pour l’instrument KingFisher ™ Duo Prime ou KingFisher mL, voir page 15. ™ 2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. 8 ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit 2 Préparation du mélange PK Remarque : Préparer le mélange PK immédiatement avant utilisation. 1. Combiner les composants suivants (dans l’ordre indiqué) pour le nombre requis d’échantillons, plus jusqu’à 10 % d’excédent (recommandé). Composant Volume par échantillon PBS (1X), pH 7.4 200 μl MagMAX™ CORE Proteinase K 10 μl PK Solution totale 210 μl 2. Retourner plusieurs fois le tube pour homogénéiser, puis centrifuger brièvement pour recueillir le contenu au fond du tube. 3 1. Préparer les échantillons selon le type d’échantillon. Combiner les composants suivants dans un tube de 2 ml ou dans une plaque deep well. Préparation de l’échantillon Type d’échantillon Volume de l’échantillon préparé Volume de MagMAX™ CORE Lysis Solution Sérum 100 μl 200 µl Semences 300 μl 400 µl Organe (haché[1]) 20 à 25 mg 200 µl [1] Hacher finement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide d’une pince et d’un scalpel stériles. 2. Mélanger au vortex vigoureusement pendant 10 secondes, puis centrifuger brièvement, ou homogénéiser par aspiration-refoulement plusieurs fois. 3. Passer immédiatement à l’étape suivante. 4 Traitement des échantillons avec la PK Solution Nous recommandons d’effectuer cette procédure dans des tubes individuels pour réduire la contamination. Des plaques peuvent être utilisées. Suivre les “Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR” en page 13 pour réduire la contamination. 1. Ajouter 210 µl de PK Solution directement au lysat. 2. Mélanger au vortex vigoureusement pendant 10 secondes, puis centrifuger brièvement pour recueillir le contenu, ou homogénéiser par aspiration-refoulement plusieurs fois. 3. Incuber l’échantillon. Type d’échantillon Action Sérum Incuber pendant 10 minutes à 55°C Semences Incuber pendant 30 minutes à 70°C Organe 4. Centrifuger brièvement pour recueillir le contenu au fond du tube. Pour les échantillons de semences, centrifuger à 15 000 × g pendant 2 minutes pour recueillir le contenu. 5 1. Transférer tout le volume de chaque lysat d’échantillon dans les puits appropriés de la plaque d’échantillon ou la barrette de tubes. Combinaison des échantillons avec le mélange Binding/Beads Type d’échantillon ™ Volume par échantillon Sérum Jusqu’à 510 μl Semences Jusqu’à 600 µl Organes Jusqu’à 410 µl Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit 9 5 (suite) ™ 2. Mélanger au vortex soigneusement les MagMAX CORE Magnetic Beads afin que toutes les billes soient resuspendues. 3. Préparation du mélange Binding/Beads : mélanger les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons, plus jusqu’à 10 % d’excédent (recommandé). Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Binding Solution 400 µl MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 μl Mélange Binding/Beads total 420 μl 4. Remuer le mélange Binding/Beads par retournement jusqu’à ce que la solution soit homogène, puis ajouter 420 μl du mélange Binding/Beads dans chaque échantillon. 5. Procéder immédiatement à la mise en place des échantillons sur l’instrument (section suivante). 6 Traitement des échantillons dans l’instrument 1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Choix du script approprié” en page 5 et “Téléchargement et installation du script” en page 6). 2. Démarrer le test, puis placer les plaques préparées dans la position appropriée lorsque l’instrument vous invite à le faire. Conserver les acides nucléiques purifiés sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. 10 ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit Purification de l’ADN avec le QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle) Avant la première utilisation du kit Reconstitution des tampons AW1 et AW2 Buffers : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du fournisseur. Réalisation de la procédure de purification 1 1. Combiner les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape suivante. Lyse et homogénéisation des échantillons Volume par échantillon testé Composant Sérum, plasma, liquide amniotique, semences, cultures cellulaires Organes Hacher finement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide d’une Échantillon préparé pince et d’un scalpel stériles. Procéder avec 25 mg d’échantillon. Tampon ATL 180 µl Protéinase K 20 µl Passer à l’étape étape 1.5 2. Vortexer pendant 1 minute. 3. Incuber à 70°C pendant 30 minutes (jusqu’à lyse totale). 4. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire descendre la condensation. 5. Ajouter les composants suivants, puis homogénéiser. Composant Tampon AL Volume par échantillon Organes Type d’échantillon Liquide NCS 200 µl 200 µl 200 µl 140 µl + 60 µl d’eau exempte de nucléases 200 µl d’eau exempte de nucléases Volume d’entrée Lysat préparé 6. Laisser incuber à 70°C pendant 10 minutes. 7. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement. 8. Ajouter 200 µl d’éthanol 96–100 % dans chaque échantillon, mélanger au vortex pendant 15 secondes, puis centrifuger rapidement pour recueillir le contenu. 2 ™ 1. Insérer une colonne QIAamp DNA Mini Kit dans un tube collecteur, puis transférer la totalité du volume de l’échantillon dans la colonne. Liaison de l’ADN à la colonne 2. Boucher la colonne, puis centrifuger l’ensemble à 15 000 × g pendant 1 minute. 3. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit 11 3 Lavage et élution de l’ADN 1. Ajouter 500 μl d’AW1 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 15 000 × g pendant 1 minute. 2. Jeter le tube collecteur, puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 3. Ajouter 500 μl d’AW2 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 15 000 × g pendant 1 minute. 4. Jeter le tube collecteur, puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 5. Centrifuger à 15 000 × g pendant 3 minutes pour sécher la membrane. 6. Jeter le tube collecteur. 7. Positionner la colonne sur un nouveau microtube de 1,5 ml et ajouter 200 µl d’AE Buffer. 8. Boucher la colonne, puis incuber à température ambiante pendant 1 minute. 9. Centrifuger à 6 000 × g pendant 1 minute, puis jeter la colonne. L’ADN purifié se trouve dans le microtube. Conserver l’ADN purifié entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour une conservation à long terme. Purification de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle) Avant la première utilisation du kit • Reconstitution du tampon B5 Buffer : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du fournisseur. • Reconstitution de la PK : ajouter le volume requis de tampon PB Buffer selon les recommandations du fournisseur. Réalisation de la procédure de purification 1 Lyse et homogénéisation des échantillons 1. Combiner les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape suivante. Volume par échantillon testé Composant Organes Hacher finement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide d’une Échantillon préparé pince et d’un scalpel stériles. Procéder avec 25 mg d’échantillon. T1 solution Lysis 180 µl Protéinase K 25 µl Sérum, plasma, liquide amniotique, semences, cultures cellulaires Passer à l’étape étape 1.5 2. Vortexer pendant 1 minute. 3. Incuber à 70°C pendant 30 minutes (jusqu’à lyse totale). 4. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire descendre la condensation. 12 ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit 1 5. Ajouter les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis homogénéiser. (suite) Composant B3 solution Lysis Volume par échantillon Organes Type d’échantillon Liquide NCS 200 µl 200 µl 200 µl 140 µl + 60 µl d’eau exempte de nucléases 200 µl d’eau exempte de nucléases Volume d’entrée Lysat préparé 6. Laisser incuber à 70°C pendant 10 minutes. 7. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement. 8. Ajouter 200 µl d’éthanol 96–100 % dans chaque échantillon, mélanger au vortex pendant 15 secondes, puis centrifuger rapidement pour recueillir le contenu. 2 ™ 1. Insérer une colonne de kit NucleoSpin Tissue dans un tube collecteur, puis transférer la totalité du volume de l’échantillon dans la colonne. Liaison de l’ADN à la colonne 2. Boucher la colonne, puis centrifuger l’ensemble à 11 000 × g pendant 1 minute. 3. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 3 1. Ajouter 500 μl de BW Buffer sur chaque colonne, boucher les colonnes, puis centrifuger à 11 000 × g pendant 1 minute. Lavage et élution de l’ADN 2. Jeter le tube collecteur, puis placer la colonne sur un nouveau tube collecteur. 3. Ajouter 600 μl de tampon B5 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 11 000 × g pendant 1 minute 4. Jeter le tube collecteur, puis placer la colonne sur un nouveau tube collecteur. 5. Centrifuger à 11 000 × g pendant 3 minutes pour sécher la membrane. 6. Jeter le tube collecteur. 7. Placer la colonne sur un nouveau microtube de 1,5 ml, puis ajouter 200 µl de BE Buffer. 8. Boucher la colonne, puis incuber à température ambiante pendant 1 minute. 9. Centrifuger à 6 000 × g pendant 1 minute, puis jeter la colonne. L’ADN purifié se trouve dans le microtube. Conserver l’ADN purifié entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour une conservation à long terme. Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR • Porter des gants et une blouse de laboratoire propres. – Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux précédemment portés pour manipuler des produits amplifiés ou préparer des échantillons. • Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à leur contamination possible. • Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des fournitures dédiés pour les étapes suivantes : – Préparation des échantillons et configuration de la réaction. – Amplification et analyse des produits. • Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone pré-PCR de la réaction. • Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute projection ou création d’aérosols. ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit 13 • Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure du possible. • Utiliser une pipette à piston ou des embouts de pipette résistant aux aérosols. • Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une solution de décontamination ADN. 14 ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit Annexe A Purification de l’acide nucléique avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL ™ ™ Suivre cette procédure pour la purification avec le MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit à l’aide de l’instrument KingFisher Duo ™ Prime ou KingFisher mL. Matériels requis non fournis Tableau 8 Matériels requis pour le traitement avec les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL Source[1] Élément Consommables pour l’instrument KingFisher™ Duo Prime KingFisher™ Duo Pack Combi pour plaque Microtiter 96 Deepwell (peignes, plaques et barrettes d’élution pour 96 échantillons) 97003530 KingFisher™ Duo Elution Strip (40 pièces)[2] 97003520 KingFisher™ Duo 12-tip comb for Microtiter 96 deep-well plate (50 pièces)[2] 97003500 KingFisher™ Flex Microtiter Deep-Well 96 plates[2] 95040460 Consommables pour l’instrument KingFisher mL ™ KingFisher™ mL Tubes et peignes (pour 240 échantillons) 97002141 KingFisher mL Peigne (800 unités) 97002111 KingFisher™ mL Tube (20 x 45 unités) 97002121 ™ [1] [2] Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. "PFL" indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. Inclus dans le pack KingFisher™ Duo Combi (cat. n° 97003530). Procédure de purification ™ Remarque : Pour la réalisation de cette procédure pour un traitement sur l’instrument KingFisher mL, mélanger les échantillons par aspiration-refoulement. Ne pas utiliser d’agitateur de plaques pour mélanger les grandes barrettes de tubes utilisées avec l’instrument. 1. Suivre le protocole, de la préparation du broyat d’échantillon au mélange des échantillons avec les billes et la solution Lysis. Remarque : Ne pas préparer les plaques ou les tubes pour le traitement avant d’avoir préparé les échantillons. ™ ™ ™ 2. Ajouter la MagMAX CORE Wash Solution 1, la MagMAX CORE Wash Solution 2 et le MagMAX CORE Elution Buffer aux positions indiquées, selon votre instrument. Tableau 9 Plan de plaque : Instrument KingFisher™ Duo Prime ID de la ligne Ligne sur la plaque Type de plaque Réactif Volume par puits Échantillon A Deep Well Lysat d’échantillon / mélange Bead / Binding Varie selon l’échantillon ou le mode opératoire Lavage 1 B MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 C MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit 15 [1] [2] ID de la ligne Ligne sur la plaque Type de plaque Réactif Volume par puits Élution[1] Barrette de tubes séparée[2] Barrette d’élution MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne H Deep Well Placer un peigne protecteur dans la plaque. S’assurer que la barrette d’élution est placée dans le bon sens dans le bloc d’élution. Placer sur l’élément de chauffage. Tableau 10 Configuration de la barrette de tubes : instrument KingFisher™ mL ID de la position Position de la barrette de tubes Tube Réactif Volume par puits Échantillon 1 Standard Lysat d’échantillon / mélange Bead / Binding Varie selon l’échantillon ou le mode opératoire Lavage 1 2 MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 3 MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 MagMAX CORE Elution Buffer 90 µl Peigne N/A ™ N/A Glisser le peigne dans le support pour peigne. 3. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 6). 4. Démarrer le test, puis placer en même temps les plaques ou les barrettes de tubes préparées dans l’instrument. L’instrument ne demande pas de placer les éléments individuellement. Conserver les acides nucléiques purifiés sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Annexe B Documentation et support Assistance à la clientèle et support technique Visiter thermofisher.com/support pour obtenir les informations les plus récentes sur les services et le support. • Numéros de téléphone de contact internationaux • Informations sur le support produit – FAQ relatives aux produits – Logiciels, correctifs et mises à jour – Formations sur de nombreux instruments et applications • Commandes et assistance en ligne • Documentation produit – Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles – Certificats d’analyse – Fiches de données de sécurité (FDS) Remarque : Pour obtenir les FDS relatives aux réactifs et produits chimiques d’autres fabricants, contacter ces derniers. Garantie limitée du produit Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les conditions générales de vente de Life Technologies disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Pour toute question, prendre contact avec Life Technologies à l’adresse www.thermofisher.com/support. 16 ™ Guide complémentaire du VetMAX Porcine Parvovirus Kit Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils – Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – France Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition. Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN1000013 A. Historique des révisions : Pub. nº MAN1000013 A Révision A Date 24 mars 2025 Description ™ Nouveau document pour VetMAX Porcine Parvovirus Kit. Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2025 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 18 juin 2025 ">
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